Evaluacion-de-dos-metodos-de-conservacion-a-largo-plazo-para-bacterias-microaerofilicas-estrictas-de-importancia-medica

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
ZARAGOZA 
 
 
 
 
 
 
EVALUACIÓN DE DOS MÉTODOS DE CONSERVACIÓN A 
LARGO PLAZO PARA BACTERIAS MICROAEROFÍLICAS 
ESTRICTAS DE IMPORTANCIA MÉDICA 
 
 
 
T E S I S 
PARA OBTENER EL TITULO DE: 
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO 
P R E S E N T A: 
MAGNOLIA JIMÉNEZ RODRÍGUEZ 
 
 
 
U N A M 
F E S 
ZARAGOZA 
 
 
LO HUMANO, EJE 
DE NUESTRA REFLEXIÓN 
Q.B.P. EVERARDO ESCAMILLA AVILÉS
 DIRECTOR DE TESIS 
 
Q.B.P. JOEL SAUCEDO CONSTANTINO
 ASESOR 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
 
 
Sabiendo que no existirá una forma de agradecer toda una vida de 
 
sacrificios y esfuerzos quiero que sientan que la meta lograda, 
 
también es suya y que la fuerza que me ayudo a conseguirla fue su 
 
apoyo, confianza y amor, con todo mi cariño, admiración y respeto, 
 
dedico esta tesis a mis padres 
 
Margarita Lucia Rodríguez Carbajal 
Guilebaldo Jiménez García 
A mis hermanos 
 
Por apoyarme en todo momento y estar siempre conmigo: 
 
Antonio Jiménez Rodríguez 
 
Hermenegildo Jiménez Rodríguez 
 
Manuel Jiménez Rodríguez 
 
Arcelia Ortiz Pérez 
 
Ramón Jiménez Rodríguez 
 
José Angel Jiménez Rodríguez 
 
Fernando Jiménez Rodríguez 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A todas mis amigas y amigos 
que siempre me motivaron a seguir adelante 
Agradecimientos 
 
 
 
A la Dra. en C Patricia Isidra Cauich Sánchez 
y al M. en C. Everardo Nazario Escamilla Avilés; 
por compartirme sus experiencias sobre el tema 
y por su valiosa colaboración, puesto que fueron 
de gran importancia durante el desarrollo experimental, 
así como también por su dedicación y paciencia al 
revisar mi trabajo, enriqueciendo con sus conocimientos 
el contenido de esta tesis 
 
 
 
A mis mis profesores 
Q.B.P. Joel Saucedo Constantino 
Q.F.B.José Oscar González Moreno 
Por su valiosa enseñanza 
Por su paciencia y dedicación para 
revisar mi trabajo enriqueciendo 
con sus conocimientos el contenido 
de esta tesis 
 
 
 
A mi sinodal, Q.B.P. Dora Alicia Pérez González, por sus valiosos 
comentarios y paciencia al revisar esta tesis 
 
 
 
A Everardo Escamilla Avilés por la oportunidad de 
trabajar bajo su dirección, 
por compartir conmigo sus conocimientos, 
por su paciencia y apoyo; 
pero por sobre todas las cosas por su gran amistad 
 
 
 
 
 
Esta tesis fue realizada en el laboratorio de Bacteriología Médica de la 
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional 
 
 
 
 
 
Asesora Externa: 
Dra. en C Patricia Isidra Cauich Sánchez 
 
 
 
 
 
JURADO 
 
 
 
 
 
Presidente: Q.B.P. Joel Saucedo Constantino 
 
Vocal: Q.B.P. Everardo Escamilla Avilés 
 
Secretario: Q.B.P. Dora Alicia Pérez González 
 
Suplente: Q.F.B. José Oscar González Moreno 
 
Suplente: Dra. en C Patricia Isidra Cauich Sánchez 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 
i
EVALUACIÓN DE DOS MÉTODOS DE CONSERVACIÓN A LARGO 
PLAZO PARA BACTERIAS MICROAEROFÍLICAS ESTRICTAS DE 
IMPORTANCIA MÉDICA 
 
 
 
INDICE páginas 
 
 
 
RESUMEN 1 
 
INTRODUCCIÓN 2 
 
1.0. MARCO TEÓRICO 5 
 
1.0.0. MÉTODOS DE CONSERVACIÓN PARA CEPAS MICROBIANAS 5 
1.1.0. Conservación por congelación 5 
1.1.1. Agentes crioprotectores 10 
1.2.0. Conservación por Liofilización 13 
1.2.1. Congelación 19 
1.2.2. Secado primario 23 
1.2.3. Secado Secundario 25 
1.3.0. Métodos opcionales de conservación 26 
1.3.1. Conservación por transferencia periódica 26 
1.3.2. Conservación por suspensión en agua destilada 
o en agua de mar estéril 28 
1.3.3. Métodos restringidos 28 
 
 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 
ii
2.0. ANTECEDENTES DE LOS MICROORGANISMOS DE ESTUDIO 31 
 
2.1.0. Campylobacter jejuni 31 
2.1.1. Morfología y fisiología 32 
2.1.2. Epidemiología 33 
2.1.3. Patogenia 34 
2.1.4. Identificación en el laboratorio y conservación 36 
2.1.5. Manifestaciones clínicas 38 
 
2.2.0 Helicobacter pylori 39 
2.2.1. Morfología y fisiología 40 
2.2.2. Epidemiología 40 
2.2.3. Patogenia 41 
2.2.4. Identificación en el laboratorio y conservación 42 
2.2.5. Manifestaciones clínicas 44 
 
2.3.0. Haemophilus influenzae 45 
2.3.1. Morfología y fisiología 46 
2.3.2. Epidemiología 46 
2.3.3. Patogenia. 47 
2.3.4. Identificación en el laboratorio y conservación 48 
2.3.4.1. Características de su cultivo 48 
2.3.4.2. Requerimientos nutricionales 49 
2.3.5. Manifestaciones clínicas 51 
 
2.4.0. Neisseria gonorrhoeae 52 
2.4.1. Morfología y fisiología 52 
2.4.2. Patogenia 53 
2.4.3. Epidemiología 54 
2.4.4. Identificación en el laboratorio y conservación 56 
2.4.5. Manifestaciones clínicas 58 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 
iii
3.0. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 60 
 
4.0. OBJETIVO 60 
 
5.0. HIPÓTESIS 61 
 
6.0. POBLACIÓN DE ESTUDIO 61 
 
7.0. MATERIAL 61 
7.1. Equipo 62 
7.2. Medios de cultivo y reactivos 62 
 
8.0. MÉTODO 63 
8.1. Medios y condiciones de cultivo 63 
8.2. Caracterización de las cepas de referencia 64 
8.3. Preparación de los soportes y suspensiones bacterianas 68 
8.3.1.Congelación. 
Preparación de las mezclas crioprotectoras 68 
8.3.2. Liofilización. Preparación de los soportes 70 
8.4. Recuento de viables en superficie. Método de Miles y Misra 73 
 
9.0. RESULTADOS 76 
9.1. Método de congelación a – 70ºC 76 
9.1.1. Campylobacter jejuni 76 
9.1.2. Neisseria gonorrhoeae 77 
9.1.3. Haemophilus influenzae 78 
9.1.4. Helicobacter pylori 79 
9.2. Método de liofilización 80 
 9.2.1. Campylobacter jejuni almacenado a 4ºC 80 
 9.2.2. Campylobacter jejuni almacenado a temperatura 
ambiente 81 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 
iv
 9.2.3. Haemophilus influenzae almacenado a 4ºC 82 
 9.2.4. Haemophilus influenzae almacenado a temperatura 
ambiente 83 
 9.2.5. Neisseria gonorrhoeae almacenada a 4ºC 84 
 9.2.6. Neisseria gonorrhoeae almacenada a temperatura 
ambiente 85 
 9.2.7. Helicobacter pylori liofilizado 86 
 
10.0. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 87 
 
11.0. CONCLUSIONES 97 
 
12.0. PROPUESTA 98 
 
REFERENCIAS 99 
 
Magnolia Jiménez Rodriguez 
 1
EVALUACIÓN DE DOS MÉTODOS DE CONSERVACIÓN A LARGO 
PLAZO PARA BACTERIAS MICROAEROFÍLICAS ESTRICTAS DE 
IMPORTANCIA MÉDICA 
 
 
 
RESUMEN 
 
 
Se evaluaron dos métodos de conservación a largo plazo: A) congelación 
a - 70ºC y B) liofilización para Campylobacter jejuni, Helicobacter 
pylori, Haemophilus influenzae y Neisseria gonorrhoeae en el primer caso 
en el que se usaron como crioconservadores las combinaciones: 1) caldo 
tioglicolato – glicerol 15% – sangre de carnero desfibrinada 50%; 2) caldo 
tioglicolato – glicerol 15% – albúmina bovina 0.5%; y 3) caldo tioglicolato – 
glicerol 15%; se observó una buena recuperación con el soporte 
compuesto por caldo tioglicolato – glicerol 15% – sangre de carnero 
desfibrinada 50% para las cuatro especies bacterianas; mientras la 
conservaciónpor liofilización en la que se utilizaron los soportes: 1) suero 
de caballo–m-inositol 5% – sangre de carnero desfibrinada 0.5% y 2) 
leche descremada 5%–m–inositol 5%–sangre de carnero desfibrinada 
0.5% se observó buena recuperación de Campylobacter jejuni y 
Haemophilus influenzae con el soporte compuesto por leche descremada 
5%–m–inositol 5%–sangre de carnero desfibrinada 0.5% almacenados a 
4ºC y a temperatura ambiente a diferencia de Neisseria gonorrhoeae que 
se observó mejor recuperación con las mismas condiciones de 
almacenamiento solo con el soporte formado por suero de caballo–m–
inositol 5% – sangre de carnero desfibrinada 0.5%. Este estudio mostró 
que para Helicobacter pylori ninguno de los soportes utilizados fue 
satisfactorio, puesto que no se recuperó de ninguno de los liofilizados. 
Magnolia Jiménez Rodriguez 
 2
EVALUACIÓN DE DOS MÉTODOS DE CONSERVACIÓN A LARGO 
PLAZO PARA BACTERIAS MICROAEROFÍLICAS ESTRICTAS DE 
IMPORTANCIA MÉDICA 
 
 
INTRODUCCIÓN 
 
El empleo de bacterias es de gran importancia para el desarrollo de la 
investigación médica, la industria y la docencia, tan es así, que desde 
18801 han existido investigadores e instituciones que se han dedicado al 
cuidado, mantenimiento y conservación de cepas bacterianas2. 
 
Louis Pasteur, fue el primer poseedor de una colección de cepas 
microbianas, él dio a conocer el primer medio semisintético líquido para el 
desarrollo bacteriano. El primer medio sólido fue descrito por Robert Koch, 
él empleó la superficie de una papa cocida para aislar colonias puras, 
también utilizó gelatina y suero para solidificar los medios. La introducción 
de medios sólidos por Koch, permitió el aislamiento y caracterización de 
las bacterias. 
 
Con el tiempo, se desarrollaron procedimientos para almacenar 
microorganismos durante muchos meses y hasta varios años, empleando 
métodos diversos como congelación, inmersión bajo capa de aceite, 
conservación al alto vacío, liofilización etc. pero siempre hubo mutaciones 
y eventualmente pérdida del cultivo3. 
 
Los datos de muchos criobiologistas comenzaron la era moderna de la 
criobiología, desde el descubrimiento de las propiedades crioprotectoras 
del glicerol por Polge, Smit y Parkes en 1949. Desde entonces los 
agentes crioprotectores marcan un descubrimiento, al ser usados para 
asegurar la sobrevivencia de innumerables sistemas después de 
almacenarse a bajas temperaturas estabilizadas4. 
 
Al inventarse la técnica de liofilización, en la cual las células se congelan 
bruscamente a – 50ºC y simultáneamente se deshidratan, se obtuvo un 
método en el que la mayoría de las células se mueren por ruptura y las 
que sobreviven permanecen deshidratadas. Al añadir medio de cultivo 
líquido a las células deshidratadas y colocarlas a una temperatura y en 
condiciones de atmósfera adecuadas las células comienzan a dividirse. 
Esto marcó otro descubrimiento, para asegurar la sobrevivencia de los 
microorganismos4. 
 
El uso de agentes crioprotectores en los medios de preservación primero 
fue implementado en 1941 con Woodcock, utilizando azúcares para 
proteger eritrocitos contra las lesiones en la congelación. Numerosos 
investigadores a su vez han utilizado desde entonces diversos agentes 
para aumentar la sobrevivencia de las bacterias congeladas. Ling (1965), 
Magnolia Jiménez Rodriguez 
 3
Merymann y Hornblower (1972), Pribor (1974) y Nei (1981), consideraron 
que las lesiones por congelar son menores con la adición de agentes 
crioprotectores tales como glicerol, azúcar o leche, que inhiben la 
formación de hielo intracelular durante el congelado rápido5. 
 
En todos los laboratorios de microbiología no solo es fundamental 
mantener al cepario vivo, si no también, resulta necesario conservar a las 
bacterias por periodos prolongados de tiempo con todas sus 
características fisiológicas, bioquímicas y fenotípicas, dado que con ellas 
se va a trabajar en investigaciones o bien para desarrollar procesos 
industriales destinados a la producción, además de uso en parámetros en 
control de calidad. 
 
Debido a todo esto es necesario elegir métodos de conservación 
apropiados para cada cepa bacteriana, existen una gran variedad de 
métodos de mantenimiento y conservación de bacterias cuya utilización 
va a depender, además, de las posibilidades de cada laboratorio, del 
tiempo previsto (cortos, medianos o largos) y características de las 
bacterias; dos de los mejores métodos son la congelación a – 70ºC y la 
liofilización. 
 
Muchos microorganismos pueden conservarse durante periodos largos de 
tiempo, observándose que crecen abundantemente, sin embargo, pueden 
perder muchas de las características biológicas que tenían originalmente; 
cuando esto sucede decimos que no han sido satisfactoriamente 
conservados; entonces la función básica de la conservación de un cultivo 
no es solamente mantenerlo vivo sino también mantener sus 
características originales. 
 
En instituciones de muy diversas índole, dedicadas a varios aspectos de 
la microbiología es necesario conservar cepas, como ejemplo podríamos 
citar: centros de enseñanza, hospitales, laboratorios químico 
farmacéuticos, biología molecular, genética microbiana, producción de 
antigenos y de sueros hiperinmunes, etc. 
 
El número de laboratorios de producción, que utilizan microorganismos 
para la producción de antibióticos, enzimas, vitaminas, aminoácidos, etc., 
es cada día mayor y podría decirse que la parte más importante de estas 
industrias la constituye su colección de cepas; por lo tanto la persona 
dedicada al mantenimiento y conservación de ellas es la clave sobre la 
que giran estos procesos. 
 
Las cepas mantenidas en el laboratorio deben conservarse puras, viables 
y revisarse continua y frecuentemente sus características morfológicas y 
metabólicas, si presentan variaciones o mutaciones que si no se vigilan 
pueden ocasionar pérdidas económicas serias, contaminación de 
fermentadores y líneas de producción y pérdida de las cepas. En la 
Magnolia Jiménez Rodriguez 
 4
enseñanza e investigación, cuando esto sucede se obtienen resultados 
lamentables. 
 
La obtención de cepas es fundamental para el trabajo de laboratorio de 
referencia y esto requiere del envió sistemático de las mismas en 
condiciones adecuadas por parte de los laboratorios suministradores. 
Para lograr este propósito es indispensable el empleo de medios de 
cultivo que posibiliten mantener la viabilidad de los microorganismos 
durante todo el tiempo necesario hasta alcanzar su destino6, 7. 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 5
1.0. MARCO TEÓRICO 
1.0.0. MÉTODOS DE CONSERVACIÓN PARA CEPAS MICROBIANAS 
 
Para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios 
de microbiología depende de que el cultivo a conservar sea puro, evitando 
que se produzcan contaminantes durante el proceso de conservación, así 
como del tiempo de conservación en que sobrevivan al menos el 70-80% 
de los microorganismos y por último, que estas células permanezcan 
genéticamente estables8. 
 
Los métodos de conservación a largo plazo son los mejores porque en 
ellos se paraliza el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no 
han muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por 
evitarse la aparición de generaciones sucesivas. Aún así no se puede 
descartar algún cambio originado por el método preparatorio en si mismo. 
Los métodos de conservación pertenecientes a este grupo son dos: 
congelación a – 70ºC y liofilización8. 
 
1.1.0. Conservación por congelación 
 
La sobrevivencia de microorganismos congelados en agua es 
frecuentemente baja, por los daños, ocasionados a las células dentro de 
una simple suspensión de sales. Polge (1949) demostró las propiedades 
crioprotectoras del glicerol y desde entonces, en aquel tiempo un amplio 
rango de compuestos son identificados como crioprotectores. Aunque 
varían en sus propiedades químicas los crioprotectores se caracterizan 
por ser altamente solubles enagua, permanece su concentración 
después de congelar, son capaces de enlazar hidrógenos y muestran una 
baja toxicidad7. 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 6
Se hacen suspensiones densas de bacterias en leche descremada en o 
bien en soluciones más ricas según las características de las bacterias, en 
frascos de tapón a rosca y se llevan a un congelador a − 20ºC o a – 70ºC, 
de esta forma permanecen vivos muchos microorganismos durante largos 
periodos de tiempo9 o bien se congelan las células en suspensión en un 
líquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores 
a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, 
al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento. 
Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se recuperan 
subiendo la temperatura8. 
 
Sin embargo el enfriamiento rápido de las bacterias mesófilicas, desde 
una temperatura normal de crecimiento hasta 0ºC causa la muerte o 
lesiona un cierto porcentaje de las células que componen el cultivo. Las 
bacterias gram negativas parecen ser más susceptibles al frío que los 
microorganismos gram positivos. Las respuestas de los microorganismos 
a la congelación son variables: unos la resisten, pero son susceptibles a 
sufrir lesiones durante la descongelación; y algunos se ven inactivados 
por la congelación10. 
La congelación a – 70ºC es el mejor método de conservación desde todos 
los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos 
especiales, y además existe el peligro de que algún fallo del sistema 
produzca una subida no deseada de la temperatura durante el 
almacenamiento. También resulta ser el método más molesto para 
realizar el envío de las cepas. 
 
Los factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células 
conservadas por este método son los siguientes8: 
 
 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 7
a) Edad de las células: 
 
En la mayoría de los casos conviene utilizar células maduras del inicio de 
la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de 
organismos que presenten en su ciclo vital algún estado que les prepare 
para la resistencia a condiciones adversas, es preferible alcanzar este 
estado. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en 
algunos pleomórficos e incluso en algunos más sencillos. 
 
b) Velocidad en la congelación y descongelación: 
 
Si se considera un sistema acuoso rico en agua congelable como lo son 
los sistemas biológicos, el cual se somete a un enfriamiento progresivo 
comienza a formarse hielo, en general, a una temperatura inferior a 0ºC. 
Como la cristalización del hielo provoca una concentración de la fase 
líquida restante, el avance de la solidificación del agua estará ligado a un 
descenso de temperatura del sistema. En este periodo de enfriamiento el 
producto contiene cristales de hielo que nadan en una fase líquida cada 
vez más concentrada (soluciones intersticiales) 11. 
 
Aunque hay programas de congelación bien estandarizados para 
determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las 
variaciones de la temperatura sean rápidas, tanto para la congelación 
como para la descongelación, por lo que para descongelar conviene 
poner las células a 37ºC. Por lo tanto, otro factor a tener en cuenta es la 
manera de realizar la descongelación, y el número de ciclos de 
congelación – descongelación. La descongelación lenta es más letal que 
la rápida, ya que aumenta el volumen de cristales de hielo. El grado de 
muerte por descongelación puede ser por dos factores, el efecto 
inmediato, muertes que ocurren al congelarse la muestra y el efecto de 
almacenamiento que consiste en la lenta pérdida de viabilidad debida al 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 8
tiempo que permanecen las bacterias sobrevivientes en estado 
congelado, y que depende de la temperatura a la que se mantenga la 
muestra12. 
 
c) Crecimiento de los cristales de hielo: 
 
Este crecimiento es controlado por dos procesos físicos distintos: la 
incorporación de las moléculas en la red cristalina y la difusión de las 
moléculas desde el seno del líquido hacia la superficie del cristal 
(transferencia de masa), correlacionada a la difusión de calor desde el 
cristal hacia el líquido (transferencia de calor). 
 
d) Influencia de las sustancias disueltas: 
 
En general, cuando el agua contiene solutos, el crecimiento de los 
cristales de hielo es inferior al que se mide en el agua pura un mismo 
subenfriamiento. Si bien las sales minerales bajan considerablemente la 
velocidad de cristalización del agua, ciertas sustancias como el glicerol o 
las proteínas tienen un efecto aún más notable. Por regla general, la 
cristalización es más lenta conforme aumenta la concentración de las 
soluciones. 
 
e) Temperatura de almacenamiento: 
 
Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es guardar tubos cerrados o 
sellados, que contengan las células microbianas, sumergidos en 
nitrógeno líquido, que tiene una temperatura de –195ºC, o bien en la fase 
gaseosa del nitrógeno líquido, con una temperatura de –140ºC8. 
 
 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 9
f) Congelación en los sistemas celulares: 
 
Los fenómenos de congelación son esencialmente los mismos en un 
tejido, suspensión celular o solución, después de una primera etapa de 
separación de hielo, se produce la solidificación de las soluciones 
intersticiales concentradas. La repartición del hielo según una forma inicial 
más o menos fina dependerá de la velocidad de enfriamiento y de la 
composición química. 
Un problema específico es la localización del hielo al interior o exterior de 
las células, por lo cual, se puede decir que un enfriamiento rápido produce 
una cristalización simultanea de líquidos intracelulares y pericelulares, un 
enfriamiento lento origina al principio la cristalización del hielo solo en el 
exterior de las células. La separación del hielo determina una 
concentración del medio por lo que las células se deshidratan (fenómeno 
de criosinéresis). Después puede continuar la cristalización extracelular 
sola o la intracelular, según la velocidad a la que se extraiga el agua de la 
célula11. 
 
g) Empleo de agentes crioprotectores: 
 
En su elección influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar. 
Estas sustancias protegen del daño que se pueda producir en las células 
microbianas en el momento de la congelación. Existen muchos 
compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se 
utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración del 15 al 
20%. También se pueden utilizar sustancias no ionizables de bajo peso 
molecular (glicerol, dimetilsulfóxido, glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, 
etc.) que provocan la solidificación amorfa y vítrea en lugar de la 
cristalización evitando así la formación de zonas intracelulares con alta 
concentración de sales. O también se pueden utilizar sustancias ricas 
como la leche descremada, suero, extracto de carne, proteínas 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 10
purificadas como albúmina, determinadas macromoléculas como 
polivinilpirrolidona, dextranos etc8. 
 
h) Efectos tóxicos de los crioprotectores: 
 
Un prerrequisito para los crioprotectores es que el aditivo no debe ser 
toxico, aunque hay aditivos como el metanol que frecuentemente exhibe 
toxicidad a concentraciones por arriba de la óptima. Se ha observado que 
el metanol al 6% es un excelente crioprotector para Escherichia coli 
congelada en caldo. La concentración de los solutos durante la 
congelación es un importante factor el cual puede exacerbar la toxicidad 
del aditivo. El dimetilsulfóxido muestra una interesante conducta, el aditivo 
es no tóxico a bajas temperaturas (menores de 4ºC) y se hace tóxico a 
temperaturas elevadas (mayores de 37ºC)7. 
 
1.1.1. Agentes crioprotectores 
 
Los aditivos o agentes crioprotectores pueden ser clasificadosde diversas 
formas: los de bajo peso molecular y los de alto peso molecular. Pero la 
división más común de los agentes crioprotectores, es la que se basa en 
la cantidad de penetración, los que penetran rápidamente como metanol, 
etanol, etilenglicol, propilenglicol, dimetilformamida, metilacetamida, o 
algunos otros como dimetilsulfóxido, glicerol que penetran más fácilmente, 
y los mono-, oligo- y polisacáridos, manitol, sorbitol, dextrano, almidón, 
metilcelulosa, albúmina, celulosa, polivinilpirrolidona, polietilenglicol, oxido 
de polietileno, alcohol polivinilico, son compuestos no penetrantes o 
impermeables causando crioprotección extracelular, cuando se presentan 
en concentraciones del 10 al 40%. 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 11
Algunos agentes crioprotectores penetrantes solamente protegen a la 
célula y no a la membrana citoplasmática, de este modo se tienen tres 
categorías de agentes crioprotectores: 
 
a) Crioprotectores que penetran en la membrana citoplasmática y la pared 
celular (ejemplo: glicerol y dimetilsulfóxido), son de bajo peso molecular, 
estos compuestos reducen los daños en la célula por la alteración de las 
condiciones físicas del hielo y el soluto en el medio. 
 
b) Crioprotectores que penetran pared celular, pero no membrana 
citoplasmática (mono- y disacáridos, aminoácidos, polímeros con bajo 
peso molecular). 
 
c) Crioprotectores que no penetran uniformemente la pared celular 
(polímeros de alto peso molecular, proteínas, polisacáridos, oxido de 
polietileno, polietilenglicol, dextran etc.), pueden funcionar impidiendo 
parcialmente la deshidratación celular por medio de incremento de la 
viscosidad del medio extracelular7, 13. 
 
Puesto que los agentes crioprotectores representan un factor muy 
importante para la conservación de los microorganismos, es necesario 
elegir el crioprotector adecuado. Algunos de los agentes crioprotectores 
más usados en bacteriología son los siguientes: 
 
a) Alcoholes y derivados: 
 
Mientras los alcoholes polihídricos, especialmente glicerol, pero además 
glicoles y alcoholes de azúcares son comúnmente usados, como 
crioprotectores, el uso de alcoholes monovalentes, es comparativamente 
menos frecuente, probablemente debido a su toxicidad para algunos 
sistemas biológicos. Sin embargo, metanol y etanol pueden ser 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 12
sorprendentemente efectivos con menor toxicidad para algunas células 
procariotas y eucariotas, el metanol puede ser tan efectivo crioprotector 
como el dimetilsulfóxido o el glicerol para algunas cepas criosensibles 
como S. cerevisiae. Glicerol (1, 2,3-propanotriol), al mismo tiempo con 
dimetilsulfóxido pueden ser los crioprotectores más extensamente usados 
en microbiología. El efecto crioprotector del glicerol fue descubierto por 
Keith quién observó que al adicionar el glicerol del 5 – 42 % a 
suspensiones de E. coli en agua permitió la supervivencia a largo plazo a 
– 20ºC. El glicerol al 50% fue adoptado para la preservación rutinaria de 
procariotes patógenos y virus a temperaturas de entre 4ºC a – 20ºC 
mucho antes de 1950. Después el glicerol fue aplicado en 
concentraciones de 2 – 55 % (X= 10%) para la congelación de diversos 
virus, bacterias incluyendo ricketsias, micoplasmas, mixomicetes, hongos 
filamentosos, levaduras, algas y protozoarios13. 
 
b) Péptidos, proteínas y glicoproteínas: 
 
La albúmina de suero puede ser usada como crioprotector a 
concentraciones de 0.1 – 4 %, por largo tiempo, especialmente para virus 
y ricketsias. La albúmina de suero humano es protectora así como el 
dimetilsulfóxido para virus de sarampión a – 65ºC. Con E. aerogenes, la 
albúmina humana y ovalbúmina fue comparable con dimetilsulfóxido y 
glicerol. La sangre inactivada de varias especies vertebradas (ternera, 
caballo, carnero, humana, conejo y pollo) puede ser incorporada dentro 
del medio a congelar, usualmente con una concentración de 10 – 20% y 
frecuentemente es combinada con otros crioprotectores para la 
refrigeración de virus, de algunas bacterias, incluyendo clamidias, 
micoplasmas y cianobacterias, levaduras hongos filamentosos y 
protozoarios. Con la adición de crioprotectores efectivos, como el suero 
de la sangre o albúmina del suero puede protegerse a las células contra 
posibles efectos tóxicos del glicerol, o del dimetilsulfóxido, durante la 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 13
congelación-descongelación. Por otro lado la sangre desfibrinada en si 
misma es crioprotector principalmente por el contenido del suero13. 
 
c) Sulfóxidos: 
 
Los sulfóxidos son tioésteres oxidados que contienen un átomo de 
oxígeno por molécula (el grupo S-O en la molécula de sulfóxido, es casi 
químicamente inerte) solubles en agua en contraste con otros tioésteres. 
La oxidación de sulfóxidos, resulta en sulfonas, con dos átomos de 
oxígeno por molécula, dimetilsulfona que carece de capacidad 
crioprotectora. El dimetilsulfóxido fue introducido a la criobiología, como 
muy efectivo, penetra rápidamente y es el crioprotector universal, tiene 
también propiedades redioprotectoras para organismos. Fue 
originalmente usado como crioprotector de células rojas sanguíneas, 
aplicado en la crioprotección de virus, bacterias ricketsias, micoplasmas, 
clamidias, cianobacterias, hongos filamentosos, levaduras, algas y 
protozoarios. Solo el grado químicamente puro de dimetilsulfóxido, puede 
ser usado como crioprotector, la concentración óptima de dimetilsulfóxido 
es extensamente variada como del 1 al 32% (X= 10%)13. 
 
1.2.0. Conservación por Liofilización 
 
Algunas observaciones hechas en el siglo XVIII permitieron conservar 
vivos ciertos organismos por medio de la desecación de los mismos, sin 
embargo no fue sino hasta principios del siglo XX que se anunciaron los 
principios de la liofilización. Así entonces la primera aplicación de la 
liofilización en microorganismos fue realizada en 1911 por Hammer14 
Masucci y Boyer fueron quienes en los años 1930 forjaron y utilizaron por 
primera vez la palabra “liofilo”, que etimológicamente significa “amigo de 
los solventes”. 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 14
En efecto, los productos liofilizados se presentan bajo la forma de cuerpos 
sólidos, porosos, friables y ávidos de agua (el agua que precisamente les 
ha sido quitada). La liofilización es un proceso que consiste en desecar 
bajo presión reducida un producto previamente congelado, sublimando el 
solvente, siendo generalmente agua u otras sustancias volátiles. 
 
El procedimiento de liofilización, combina las ventajas del método de 
deshidratación y el de congelación. Este proceso permite conservar a los 
microorganismos, eliminando las resiembras periódicas, y con ello, la 
manipulación constante, además de conservarlos por periodos mayores 
de tiempo15. 
 
Este método está basado en la obtención de un medio ambiente 
herméticamente cerrado, enfriable en donde una solución acuosa llega 
hasta su punto de congelación, por medio de vacío, existiendo un arrastre 
del producto. El hielo se transforma en vapor de agua, sublimándose y 
quedando el material no volátil distribuido en el espacio correspondiente 
al volumen inicial, siendo ésta una superficie sólida y muy frágil, que es 
redisoluble en agua16, 17. 
 
Respecto a los crioprotectores se pueden utilizar varios dependiendo del 
tipo de microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, 
debido a su elevado punto de evaporación y a su higroscopicidad, que 
provoca que los liófilos queden muy viscosos. Tampoco es conveniente 
utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al concentrarse por la 
evaporación del agua puede dañar a las células microbianas. 
 
Por lo tanto, para la liofilización se recomiendan como crioprotectores el 
inositol para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para 
hongos y actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden sermás convenientes otros crioprotectores, como por ejemplo el glutámico-
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 15
glutamato para las bacterias lácticas, mezclas de glucosa con caldo de 
hígado para bacterias anaerobias, etc8. 
 
La liofilización es un proceso que incluye un gran número de variables, la 
eficiencia de este proceso depende de un buen control de sus 
condiciones, por lo cual la determinación de la temperatura eutéctica es 
fundamental en el proceso, puede calcularse teórica y prácticamente. 
“Para el caso particular de productos biológicos es muy difícil el cálculo 
teórico debido a que generalmente se desconoce el comportamiento 
fisicoquímico de las soluciones y suspensiones biológicas debido a su 
naturaleza química compleja y en algunos casos variable”18. 
 
Una vez realizado el proceso de liofilización tampoco se da crecimiento en 
las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado el 
agua mediante la liofilización. Con ello la estabilidad genética es alta, pero 
a veces no tanto como en la congelación, porque la liofilización se 
consigue por sublimación del hielo de las células. 
Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las células y 
después eliminarla mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la 
temperatura, lo que acabaría afectando a la viabilidad del 
microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos 
denominados liofilizadores. Las células microbianas así conservadas se 
someten a un tratamiento más complejo que en el caso de la 
congelación8. 
 
Sin embargo, este es un método muy recomendable por su comodidad 
para el almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez 
conseguidos los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente 
(18ºC-20ºC), con lo cual su envío es muy cómodo.28 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 16
Debido a la moderada manera de eliminar la humedad, las condiciones de 
liofilización pueden optimizarse deliberadamente para conseguir la 
máxima sobrevivencia de las células microbianas. La baja temperatura de 
rehidratación, los aditivos protectores en la suspensión microbiana y el 
almacenamiento de los liófilos con vacío, aumentan la viabilidad del 
microorganismo.29 
 
“La liofilización o criodesecación se puede definir como la operación que 
consiste en secar una solución o un material impregnado de agua, 
manteniéndolo primero a una temperatura lo suficientemente baja como 
para que la mayor parte del agua que contiene se congele y se extraiga 
después por sublimación del hielo. El producto liofilizado esta 
caracterizado por una textura porosa. Esta es una razón etimológica del 
término liofilización (lyo: disolvente, phil: amigo), ya que los productos 
liofilizados se caracterizan por una gran afinidad de disolución debida en 
parte a su textura porosa, y en parte, al hecho de que la deshidratación se 
efectúa a baja temperatura, evita la desnaturalización de las sustancias 
termolábiles”.11 
El proceso de liofilización puede dividirse en tres partes principales: 
 
Congelación 
Secado primario 
Secado secundario 
 
Los factores que hay que tener en cuenta para hacer una buena 
liofilización son lógicamente los mismos que influyen en la congelación, a 
los que habrá que añadir otros que surgen como consecuencia de la 
deshidratación. 
 
Los factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización 
como medio de conservación son: 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 17
a) Tipo de microorganismo: 
 
Hay algunos microorganismos que no resisten la liofilización y 
lógicamente serán aquellos que contengan más agua en su interior. 
Algunos hongos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se 
pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros métodos8. 
Los microorganismos gram positivos son generalmente más resistentes a 
los daños por la liofilización que los gram negativos. 
Una revisión hecha a las características de liofilización de 70 cepas de 
importancia médica por Mello Snell (1985), en el cual, reportó que la 
mayoria de las cepas resistio a la liofilización, incluyendo cepas como 
Clostridium, Bacillus, Corynebacterium, Pasteurella, Yersinia, 
Pseudomonas aeruginosa, P. flourescens y P. maltophilia. Y también 
observó con este estudio que especies como Haemophilus influenzae, 
Neisseria gonorrhoeae, Bacteroides melanogenicus, Campylobacter coli y 
Campylobacter jejuni resultaron muy sensibles al proceso de liofilización7. 
 
b) Concentración celular: 
 
Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentración del 
orden de 108-109 células/mL en el caso de las bacterias y algo inferior en 
el caso de hongos filamentosos y levaduras8. 
 
c) Composición del medio de suspensión: 
 
Al iintentar liofilizar células en agua o en una simple solución salina, se 
obtiene un pobre resultado y una sobrevivencia variable o pobre. Un 
medio para liofilizar, debe de ser por lo tanto formulado para que proteja a 
los organismos, desde el momento de la congelación y proteja de los 
daños provocados por el secado 1ª y 2º, para que se pueda producir un 
inóculo estable durante el almacenamiento en el anaquel. 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 18
Regway y Lapage (1974) compararon la efectividad de más de 20 
carbohidratos y relacionaron compuestos como protectores para liofilizar 
para una variedad de especies de bacterias incluyendo cepas sensibles 
como Haemophilus suis y Neisseria gonorrhoeae , los solutos fueron 
categorizados como protectores en el siguiente orden (de mayor a menor 
efectividad): meso-inositol (más efectivo), carbohidratos, alcoholes (ej. 
manitol), disacáridos no reductores (ej. trehalosa), disacáridos reductores 
(ej. lactosa), monosacáridos (ej. glucosa), glicerol, pentosas (menos 
efectividad, o pobremente protectoras)7. 
También es recomendado el uso de suero-inositol, meso-inositol y suero 
de caballo o bien caldo-inositol, caldo nutritivo y meso-inositol19. 
 
d) Determinación de temperatura eutéctica: 
 
La determinación de la temperatura eutéctica específica para cada 
producto es importante para el proceso de liofilización de las sustancias 
biológicas. La técnica empleada para su determinación está basada en la 
propiedad que tienen las soluciones acuosas de conducir electricidad 
cuando tienen agua libre, disminuyendo conforme las moléculas de agua 
van siendo congeladas, hasta llegar a un punto en el que no hay 
conductividad. Los productos se congelan en un pequeño vaso con un 
termopar que determina la temperatura y dos electrodos que establecen 
un voltaje y miden resistividad de la solución o suspensión una vez que el 
producto llega a una temperatura de − 60ºC aproximadamente, se dejan 
calentar a temperatura ambiente, llevándose simultáneamente un registro 
de datos de temperatura y resistividad. El valor de la temperatura 
eutéctica se alcanza en el momento en el que la resistividad es menor a 
100µΩ18. 
 
 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 19
e) Grado de deshidratación alcanzado: 
 
Debe ser lo más alto posible, aunque la concentración de solutos puede 
conllevar una pequeña cantidad de agua remanente que no es perjudicial. 
 
f) Atmósfera de oxígeno en el tubo: 
 
Las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vacío para evitar, 
tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del tubo, 
como el oxígeno que puede dañar a las células8, 20. 
 
g) Temperatura durante la sublimación: 
 
Debe ser lo más baja posible, sin subir por encima de – 50ºC. 
 
h) Condiciones de almacenamiento: 
 
La temperatura debe ser constante, preferentemente a 18ºC y sin bajar de 
los 0ºC. Los liófilos se deben guardar en la oscuridad8. 
 
1.2.1. Congelación 
 
Durante la congelación de una solución binaria diluida que consiste de un 
solo soluto en agua, el hielo puro se separa y la solución residual (fluido 
intersticial) se vuelve más concentrado con respecto al soluto, hastaque 
se forma una composición en la cual el agua y el soluto solidifican. 
 
La temperatura a la cual ocurre la solidificación final se le llama 
“temperatura eutéctica” y la composición correspondiente de la solución 
concentrada antes mencionada, se le llama “composición eutéctica”. 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 20
La temperatura eutéctica es la temperatura más baja a la cual el material 
no congelado existe en equilibrio con el material congelado. 
 
En un ciclo normal de liofilización, el material se enfría hasta alrededor de 
5-10ºC por de bajo del punto eutéctico y se mantiene a esta temperatura 
por lo menos de 2-3 horas con objeto de asegurar la completa 
solidificación, elevando después la temperatura hasta la temperatura de 
secado (sublimación) y en esta etapa es importante que el agua este 
completamente congelada. 
 
Si la liofilización se conduce con éxito, en la pastilla liofilizada al hacer 
cortes transversales, se observan perfectamente los pequeños canales 
por donde sublima el agua. En caso de colapso pierde su estructura 
porosa, bloquea el paso de vapor de agua y evita el enfriamiento 
evaporativo. 
 
Esta situación, podría causar fusión parcial del material congelado 
remanente. “Se debe tomar en cuenta el hecho de que muchos materiales 
tienen un rango de temperaturas eutécticas en vez de un punto eutéctico”, 
si no se encuentra un verdadero eutéctico, entonces al sobre enfriar el 
soluto este puede precipitarse como partículas amorfas por debajo de 
unas temperaturas específicas21, 22. 
Por lo cual la congelación para la liofilización puede efectuarse de 
diferentes maneras: 
 
a) Congelación lenta: 
 
Cuando se considera adecuado obtener cristales grandes de agua, la 
temperatura debe ir disminuyendo muy lentamente, de este modo se 
permite crecer a dichos cristales con pequeña área total21. Después de 
una congelación lenta la forma es irregular y con frecuencia laminar. Estas 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 21
diferencias porosas se relacionan con las propiedades mecánicas, el 
producto que ha sufrido una congelación lenta es, por lo general, más 
friable y tiende a presentar una coloración más obscura que el que se ha 
sometido a una congelación rápida. 
 
Un enfriamiento lento en un sistema biológico permite una permanencia 
relativamente prolongada del producto en la zona de las temperaturas 
intermedias, donde las soluciones intersticiales concentradas pueden 
originar reacciones perjudiciales para las sustancias sensibles a las 
concentraciones elevadas en electrólitos, a las variaciones de pH, etc11. 
 
b) Enfriamiento muy rápido: 
 
Mediante el enfriamiento brusco; por ejemplo al utilizar nitrógeno líquido (-
170ºC), hielo seco (-80ºC) o freón comprimido (no recomendable por su 
efecto ecológico), se obtendrán cristales pequeños, con el consiguiente 
aumento de superficie o área expuesta a la liofilización (sublimación). Esta 
técnica también se utiliza, cuando el producto se daña si se produce 
recristalización bajo condiciones moderadas de congelamiento21. 
Inversamente, el enfriamiento rápido favorece la formación de cristales de 
hielo intracelular, responsable de deterioros mecánicos a las estructuras. 
En general existe una velocidad óptima de enfriamiento que permite una 
conservación máxima de la actividad biológica del producto tratado11. 
 
c) Introducción del tratamiento térmico durante la congelación: 
 
Cuando sucede que durante el proceso de congelación normal un 
material tiene su estructura amorfa y esta estructura no es deseable, por 
que ocasiona mala reconstitución, es posible introducir un paso de 
calentamiento precediendo a la sublimación. El tratamiento térmico 
consiste de una primera congelación del material a una temperatura 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 22
suficientemente baja y calentamiento gradual a una temperatura 
predeterminada, para permitir cristalizar a la formas metaestables y luego 
enfriar nuevamente a una temperatura apropiada, antes de liofilizar21. 
 
d) Congelación seriada (en capas): 
 
La congelación seriada se define como la congelación separada de los 
componentes de un producto, capa tras capa, esta técnica puede 
aplicarse para anticipar la ocurrencia de una mezcla con un punto 
eutéctico muy bajo. El método contiene una mayor estabilidad al 
producto21. 
 
e) Congelación en esferas: 
 
La solución o suspensión a ser liofilizada se gotea dentro de un recipiente 
que contiene nitrógeno líquido (-170ºC). Al subir la temperatura del 
nitrógeno por tomar al calor de las gotas, se forman pequeñas burbujas 
de gas alrededor de las gotas que se están empezando a congelar, las 
cuales las mantienen flotando. Cuando las gotas están completamente 
congeladas lentamente van depositándose en el fondo del recipiente; 
durante la liofilización, el calor, se suministra también del fondo de la 
cama de esferas congeladas, sin embargo, en este caso es 
importantísimo el papel que juega el enfriamiento evaporativo.21. 
 
Para la congelación de una suspensión de bacterias en un medio habitual 
se tiene que, cuando la temperatura es ligeramente inferior al punto de 
congelación del medio, el citoplasma queda en sobrefusión (sin congelar) 
entre – 1ºC y – 10ºC. Pero como la tensión de agua en el interior es 
mayor que en el exterior, existe una tendencia a restablecer el equilibrio 
que puede ser por pérdida del agua de la célula (cuando la congelación 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 23
se efectúa lentamente) o bien por cristalización de agua en el interior 
(cuando la congelación se realiza rápidamente). 
 
En ambos casos la consecuencia es que las sales intracelulares se 
concentran, lo que supone que la solución del citoplasma puede llegar a 
saturarse, con precipitación de sales. Ello conlleva a varias 
consecuencias, los cristales de sales y la alta concentración de electrolitos 
provocan la desnaturalización de las proteínas y daños a la membrana, de 
modo que pueden salir componentes del citoplasma (fosfato, ribosa, 
péptidos y nucleótidos procedentes de las actuación de ribonucleasas y 
peptidasas latentes) otro efecto es el daño mecánico a la pared celular y a 
la membrana provocado por los cristales de hielo23. 
 
Los cambios estructurales al congelar, pueden afectar drásticamente las 
propiedades de disolución del producto liofilizado. En algunos casos, 
estos problemas dan como resultado, una reconstitución inaceptable del 
producto liofilizado que se refleja en altos tiempos de disolución o por la 
opalescencia permanente de la solución, que se forma después de añadir 
el solvente a la pastilla liofilizada. 
 
1.2.2. Secado primario 
 
Durante el secado primario (sublimación) el solvente (vapor) es extraído 
directamente del material (congelado). 
Conforme los cristales de hielo van sublimando se van formando capilares 
en forma de largos hoyos en la masa congelada. A través de estos hoyos 
el agua cristalizada de las capas más profundas de la cama va escapando 
hacia fuera por sublimación, en los lugares donde sublima el hielo se 
forman pequeños orificios. A través de estos pequeños orificios, el agua 
en forma de vapor escapa de las capas cada vez más bajas o profundas 
de la masa congelada. 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 24
El grosor o espesor de la capa seca, aumenta gradualmente durante el 
proceso de secado y el vapor de agua experimenta un aumento de 
resistencia a escapar en la capa seca. De este modo la velocidad de 
sublimación va disminuyendo durante el proceso21. 
 
Casi invariablemente se usa agua como solvente; el hielo únicamente 
sublima por debajo del punto triple del agua (0.01ºC y 6.09 milibar). El 
secado empieza siempre por la parte superior del material congelado 
(cuando se trata de masas congeladas en recipientes tales como 
ampolletas o viales), o bien de la superficie exterior (cuando la masa 
congelada esta en forma esférica u otra semejante).En general el flujo de vapor de agua se impide por tres tipos de 
resistencia a saber: 
 
a) Resistencia de la capa de producto seco. 
b) Resistencia del tapón de hule a pesar de que estos son de forma 
especial, es decir, que se les coloca sobrepuestos, dejando orificios 
laterales. 
c) Resistencia de la cámara de liofilización (debido a su diseño geométrico 
específico). 
La relación entre el flujo del calor y la diferencia de la temperatura se 
puede describir por un coeficiente del traspaso térmico del frasco a partir 
de tres mecanismos paralelos: 
 
a) Conducción directa del estante al frasco vía puntos del contacto entre el 
frasco y del estante. 
b) Conducción a través del vapor entre el fondo del frasco y el estante. 
c) Traspaso térmico radiactivo. 
El suministro de calor al nivel de sublimación es un factor determinante 
para lograr una velocidad óptima en esta etapa del proceso. 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 25
La temperatura de sublimación debe alcanzarse, tan alto como sea 
posible, sin permitir la fusión de la masa congelada a modo de obtener la 
mayor diferencial de temperatura, así como la máxima diferencia de 
presión de vapor de agua entre el producto y el condensador de hielo 
cuya posición se encuentra alejada lo más posible del producto en 
proceso, denominada fuerza impulsora de sublimación21, 24. 
 
Otro factor que también influye durante el secado primario son las curvas 
del interior del frasco de vidrio utilizado, puesto que la acumulación de 
calor, en este frasco contribuye de manera significativa en el traspaso 
térmico durante el secado25 así como también la posición del frasco para 
el traspaso térmico conocida como el efecto del frasco del borde, en 
donde se ha encontrado que la sublimación es más alta para los frascos 
situados en la parte de enfrente comparada a los frascos del centro26. 
 
1.2.3. Secado Secundario 
 
Después del secado primario, la remoción de la humedad residual de la 
pastilla porosa depende de la naturaleza del material, la temperatura del 
producto y de la presión de vapor, el contenido de humedad residual 
depende de la efectividad del secado del anaquel21. 
La humedad residual cerca de la tapa de la pastilla es mucho más baja 
que la humedad cerca del fondo, por lo menos durante e inmediatamente 
después de la liofilización27. 
 
En las partes laterales externas del anaquel, el secado es más efectivo, 
este fenómeno parece que sucede en todo tipo de liofilizadora. Por 
turbulencia de las moléculas de gas en las esquinas, tiene lugar una 
mejor conducción de calor entre el anaquel y el producto. Si la cantidad 
de humedad residual disminuye obteniéndose un producto estable, aún 
después de liofilizar, el secado secundario es necesario para remover el 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 26
agua absorbida, intermolecularmente; para el secado secundario, 
frecuentemente se elige una temperatura más alta, y la presión dentro de 
la cabina tenderá a ser más baja, a diferencia del secado primario21. 
 
Debido a la moderada manera de eliminar la humedad, las condiciones de 
liofilización pueden optimizarse deliberadamente para conseguir la 
máxima sobrevivencia de las células microbianas. La baja temperatura de 
rehidratación, los aditivos protectores en la suspensión microbiana y el 
almacenamiento de los liófilos con vacío, aumentan la viabilidad del 
microorganismo.29 
 
1.3.0. Métodos opcionales de conservación 
 
Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de 
congelación y liofilización, bien por carecer de los equipos necesarios, o 
bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la 
conservación por estos métodos. 
Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método 
alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo 
empleando varios de estos métodos. 
 
1.3.1. Conservación por transferencia periódica 
 
La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de 
cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas células no pueden 
permanecer indefinidamente en el mismo medio, porque al seguir activas 
excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, 
provocando el envejecimiento y muerte celulares, por lo que es necesario 
transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco8. 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 27
Este es el peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que 
al estar las células creciendo hay una alternancia de generaciones, y al 
cabo del tiempo las células que se están guardando serán descendientes 
lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas 
de sus características. 
 
Si se va a utilizar este método es aconsejable retardar el envejecimiento y 
alargar los periodos entre dos resiembras. Esto se puede conseguir de 
varias maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inóculo; 
rebajando la proporción de algunos nutrientes en el medio de cultivo; 
inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios 
facultativos, ya que el crecimiento en presencia de oxígeno es más rápido 
y origina productos generalmente tóxicos; y almacenando los cultivos a 
4ºC-8ºC30. 
 
A veces también se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite 
mineral estéril, con esto se consigue también evitar en la medida de lo 
posible la desecación del medio de cultivo, que podría ser tóxico para las 
células al aumentar su concentración. Hay que tener en cuenta que los 
microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los hongos 
filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. 
 
Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es que 
la contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los 
tubos a lo largo del tiempo y también por la posibilidad de entrada de 
ácaros en los mismos8. 
 
 
 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 28
1.3.2. Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de 
mar estéril 
 
Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de 
viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos 
filamentosos como levaduras y algunas bacterias. 
Consiste en suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo 
que se quiere conservar. 
 
Se pueden preparar en criotubos. En este caso la concentración celular 
no debe ser superior a 104-105 células/mL en el caso de bacterias y 
levaduras. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se pueden 
poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el 
caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en agua de mar 
diluida8. 
 
1.3.3. Métodos restringidos. 
 
En este grupo se encuentran métodos no empleados habitualmente, pero 
a los que es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de 
microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización o 
la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, 
Rhodospirillum, etc. 
 
Los métodos aquí citados se basan en la paralización del crecimiento por 
eliminación del agua disponible para las células. 
 
 
 
 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 29
a) Desecación en papel de filtro. 
 
Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatman Nº 3) que se impregna 
con una solución muy densa de células y se deja secar al aire (en 
condiciones estériles). 
También es posible desecarlos por el procedimiento que se llama 
desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero 
sin que haya habido congelación previa de las células. El vacío producido 
por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un vacío 
excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la 
temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelación 
incontrolada de las células8. 
 
b) Desecación en suelo, arena, silicagel, etc. 
 
La desecación se lleva a cabo con ayuda de sílica gel. La técnica directaconsiste en colocar algunas gotas de una suspensión concentrada de 
células cosechadas en la fase estacionaria, en leche estéril en un 
pequeño tubo que contenga sílica gel (alrededor de 1 cm. de altura) 
previamente esterilizado. Todo lo anterior se conserva a temperatura 
ambiente dos semanas y después se transfieren a 4ºC30. Se añaden las 
células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los 
microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante 
bastante tiempo por este método. 
 
c) Desecación en bolitas de alginato. 
 
Éste es un procedimiento bastante eficaz. Las células se encuentran en 
una matriz de alginato y la eliminación del agua se hace por tratamiento 
con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta 
que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 30
se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas 
de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC debido al bajo 
contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte 
de alginato. Este es un método que se está utilizando incluso para la 
conservación de algas y células vegetales. 
 
d) Desecación en sal gorda para halobacterias. 
 
Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y se 
dejan desecar espontáneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la 
desecación no es total, pero las células dejan de multiplicarse por ser 
insuficiente el nivel de agua disponible8. 
 
e) Método de Stamp. 
 
Es una técnica simple y no requiere aparatos costosos. Los 
microorganismos se suspenden en gelatina nutritiva al 10 % con 0.25 % 
de ácido ascórbico, para obtener una suspensión de alrededor del 15 %. 
Esta deberá tener aproximadamente 1X1010 microorganismos viables/mL. 
Con un cuenta gotas verter algunas gotas sobre una superficie de 
material de plástico. Pasar a un desecador con pentóxido de fósforo, y 
mantener en condiciones de vacío parcial. Los finos discos, que se han 
formado, se transfieren a un recipiente estéril con tapón de algodón 
hidrófilo, que se conserva a temperatura ambiente con cloruro de calcio. 
Para obtener un subcultivo se pasa a uno de los discos a un medio 
adecuado, se calienta para que se disuelva y se siembra en el medio 
sólido que se considere apropiado. Este método no es satisfactorio para 
gonococos, meningococos, ni Vibrio cholerae31. 
 
 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 31
2.0. ANTECEDENTES DE LOS MICROORGANISMOS DE ESTUDIO 
 
2.1.0. Campylobacter jejuni 
 
El microorganismo actualmente clasificado como Campylobacter jejuni (en 
un principio denominado Vibrio jejuni) fue descubierto en 1931 por Jones 
y Little como agente causal de disentería invernal en vacunos. Estudios 
anteriores a este descubrimiento realizados por Doyle en 1914 descubrió 
un vibrión aislado del intestino de cerdos con diarrea y lo denomino Vibrio 
coli. Mac Fadyean, Stockmann y Smit en 1918 establecieron la 
participación de una bacteria microaerófilica en el aborto del ganado 
bovino y ovino de morfología similar a las especies del género Vibrio por 
lo que se le denomino Vibrio fetus. 
 
En 1956 Elizabeth King describe un grupo de bastones microaerofílicos, 
curvos y móviles aislados de la sangre de niños con disentería aguda que 
ella denominó vibrión, ella observó que estos vibriones podían estar 
estrechamente relacionados por el microorganismo descrito por Jones y 
Little y que podría ser causante de síndromes diarreicos infantiles de 
etiología desconocida. 
 
En 1963, Sébald y Veron proponen el género Campylobacter cuando se 
reconoció que las bacterias conocidas como V. fetus no pertenecían a la 
familia Vibrionaceae. En 1972, Dekeyser y col. aislaron los vibriones 
relacionados de las heces de pacientes con enteritis aguda usando una 
técnica de filtración que permitía el paso de pequeños bastones curvos a 
través de la membrana. 
 
En 1973, Butzler y col. aislaron Campylobacter a partir de materia fecal en 
el 5% de los niños con diarrea usando la técnica de filtración. En 1977, 
Skirrow desarrolló un medio selectivo adicionado de antimicrobianos que 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 32
permitió en forma simple el aislamiento rutinario de Campylobacter a partir 
de heces32, 33. 
 
2.1.1. Morfología y fisiología 
 
El nombre del género Campylobacter deriva de la palabra griega campylo 
que significa curvado: Los microorganismos del género son bacilos Gram 
negativos helicoidalmente curvados y delgados que miden de 0.2 a 0.5 
µm de ancho y de 0.5 a 5 µm de longitud. 
 
Se han informado de diversas formas morfológicas de Campylobacter, 
entre ellas, formas en espiral, en S, en ala de gaviota, de coma y cocoide. 
De manera característica, los microorganismos tienen forma de coma 
cuando se ven en los tejidos infectados pero son filamentosos o cocoides 
después del aislamiento en el laboratorio. Las formas en espiral son más 
abundantes en los cultivos jóvenes, mientras que las formas cocoides 
predominan en los cultivos viejos. 
 
Los microorganismos tienen un tipo de movilidad distintivos en 
sacacorchos rápido, que se observa mejor en el microscopio con 
contraste de fase o con campo oscuro. La mayor parte de las especies 
son unipolares o bipolares. 
 
Los microorganismos del genero Campylobacter son microaerófilicos y 
requieren una baja tensión de oxigeno (3 a 15 %) y nivel aumentado de 
CO2 (3 a 5 %) para la proliferación. 
 
Estas bacterias son sumamente sensibles al peróxido de hidrógeno y a 
los iones superóxido que aparecen en los medios de cultivo cuando se 
exponen al aire y a la luz. El frasco con vela proporciona una atmósfera 
adecuada para algunas cepas de Campylobacter pero otras cepas 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 33
pueden no proliferar en estas condiciones a menos que se agregue un 
sobre generador de CO2. Las campilobacterias son incapaces de utilizar 
los azúcares, de forma oxidativa o fermentativa34 C. jejuni es catalasa y 
oxidasa positivas35. 
 
La hidrólisis de hipurato es una prueba importante usada para la 
identificación de especies de Campylobacter que causan enfermedad 
humana. La prueba rápida del hipurato en tubo fue descrita por Hwang y 
Ederer y modificada para el uso con el Campylobacter spp por Harvey, se 
utiliza con frecuencia para distinguir al C. jejuni de otras especies de 
Campylobacter36, 37. 
 
2.1.2. Epidemiología 
 
Con anterioridad a la década de los años 1970, las campilobacterias eran 
conocidas principalmente por los microbiólogos veterinarios como 
microorganismos que producían abortos espontáneos en vacas y ovejas y 
como causa de otras patologías en los animales38. 
 
Las campilobacterias se hallan en todo el mundo como comensales en el 
conducto intestinal de gran cantidad de animales salvajes y domésticos. 
En medicina veterinaria las infecciones causadas por estos 
microorganismos tienen gran interés debido a las serias pérdidas 
económicas que experimentan los granjeros como resultado de los 
abortos y la infertilidad de los ovinos infectados35. 
 
La infección de los animales se transmite se forma venérea y los 
microorganismos pueden alojarse en los tractos genitourinario e intestinal 
durante lapsos prolongados sin causar síntomas. C. jejuni tiene el 
espectro más amplio de reservorios animales que incluye a las aves de 
corral, los perros, los gatos, los ovinos y los bovinos. 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 34
Las grandes epidemias de infecciones humanas se han rastreado hasta el 
consumo de leche, agua y alimentos contaminados, que constituyen los 
principales vehículos para la transmisión de los microorganismos a los 
seres humanos, también los animales de compañía, como perros y gatos, 
se pueden infectar y convertirse en fuentes de infección humana, sobre 
todo para los niños pequeños39. 
 
Sin embargo, también se ha demostrado la diseminaciónde un ser 
humano a otro por la vía fecal-oral. El C. jejuni infecta a las personas de 
todas las edades, pero el diagnostico es más frecuente en los niños que 
en los adultos. La atención de los niños pequeños con diarrea causada 
por C. jejuni conlleva el riesgo de la infección de las personas adultas que 
los cuidan. 
La incidencia de la infección es mayor durante el verano y el otoño. 
Algunos estudios efectuados en ciertos hospitales de Estados Unidos y 
otros países indican que el C. jejuni causa tantas enteropatías en los 
seres humanas como las especies de los géneros Salmonella y Shigella. 
 
De acuerdo con algunos datos la incidencia de C. jejuni en las personas 
con diarrea es similar a la de Yersinia enterocolitica, aproximada al 9% de 
los casos diagnosticados. Con frecuencia el C. jejuni causa enfermedades 
diarreicas agudas en personas que viajan a países en desarrollo. En 
notable contraste con los hallazgos en los países desarrollados, en los 
países del tercer mundo el C. jejuni se aísla mucho más a menudo de las 
personas sanas en especial durante los 5 primeros años de vida34. 
 
2.1.3. Patogenia 
 
La susceptibilidad individual a la infección parece variar de forma 
considerable. Los estudios epidemiológicos han demostrado que la 
ingestión de apenas 500 microorganismos en la leche puede provocar la 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 35
enfermedad en algunas personas, mientras que en otras la ingestión de 
menos de 106 microorganismos no causa diarrea. 
Es probable que la variación de la virulencia relativa de las diferentes 
cepas también sea un determinante importante de la dosis infecciosa. 
 
La infección entérica por C. jejuni da como resultado la invasión de la 
mucosa, caracterizada por la ulceración de la superficie mucosa, la 
formación de abscesos en las criptas y la necrosis hemorrágica del íleon y 
el yeyuno. 
 
El examen de las heces durante la infección revela diarrea hemorrágica 
en una gran proporción de los casos y en general hay leucocitos en las 
heces, incluso en niños pequeños. Se han identificado tres propiedades 
potencialmente patogénicas del C. jejuni la invasividad, la producción de 
enterotoxina y la producción de citotoxina. La colonización del 
revestimiento mucoso del conducto gastrointestinal parece desempeñar 
un papel importante en la capacidad del microorganismo de producir la 
enfermedad. Para la colonización son cruciales los flagelos que 
incrementan la adherencia y que en virtud de su movilidad permiten que 
los microorganismos atraviesen la capa mucosa que cubre la superficie 
del intestino. 
 
Las cepas de Campylobacter aisladas de los pacientes con diarrea 
acuosa producen una entorotoxina termolábil que estructural e 
inmunológicamente están relacionadas con la enterotoxina colérica. 
La toxina causa una diarrea secretora por la estimulación de la actividad 
de la adenilato ciclasa en la mucosa intestinal y por la alteración del 
transporte normal de los iones en los enterocitos. 
 
 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 36
2.1.4. Identificación en el laboratorio y conservación 
 
Las características del cultivo son muy importantes para el aislamiento y 
la identificación de C .jejuni, se requiere medios selectivos y la incubación 
debe efectuarse en atmósfera con O2 reducido (5%) y la adición de CO2 
(10%). 
 
La incubación de las placas primarias debe ser entre 42ºC a 43ºC aunque 
el C. jejuni crece bien entre 36 a 37ºC la incubación a 42ºC impide el 
crecimiento de la mayor parte de las otras bacterias presentes en las 
heces y permiten la proliferación de las campilobacterias termofílas. Las 
colonias se desarrollan totalmente de 24 a 48 horas. 
 
El aislamiento de C. jejuni de muestras de material obtenido del recto y 
material fecal se ha visto facilitado por el desarrollo de medios selectivos. 
Los medios selectivos apropiados incluyen los medios de Butzler, de 
Skirrow y Campy-BAP. Estos medios contienen diversos antibióticos para 
inhibir la proliferación excesiva de la flora rectal competitiva34. 
 
Las colonias tienden a ser incoloras o de color gris pueden ser acuosas y 
extenderse o redondas y convexas y ambos tipos de colonias pueden 
aparecer sobre las placas de agar40. 
 
Las características estructurales de Campylobacter son las típicas de 
bacterias Gram negativas, una pared celular en la que destaca la 
presencia de galactosa, manosa y ramnosa, en la membrana externa 
sobresale la presencia del antígeno somático O también referido como 
lipopolisacarido al cual se debe la diversidad serologica de C. jejuni ya 
que se conocen más de 60 antígenos “O”. 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 37
Dan M41 utilizó para evaluar la recuperación a largo plazo de 
Campylobacter jejuni dos métodos de congelación, a – 70ºC y en 
nitrógeno líquido, y empleó 3 medios de preservación Cary-Blair, Amies y 
solución salina-glicerol, y preservó en los 3 a otros microorganismos 
enteropatógenos (Salmomella, Shigella) eficientemente por un periodo de 
12 meses, excepto a Campylobacter jejuni41. Luechtefeld NW42 menciona 
que cepas puras de Campylobacter congeladas a – 70ºC en un medio con 
glicerol y caldo brucela los mantiene viables por varios años; aun que no 
menciona cuantos y en que cantidad de microorganismos. 
 
Para mantener una cepa de Campylobacter jejuni a corto plazo se puede 
utilizar medio Mueller Hinton M-H, preparado con 0.25% de agar, extracto 
de Fildes y 0.15% de carbón activado a 4ºC por cuatro semanas, o bien 
en caldo M-H con glicerol al 30% y sangre a – 10ºC durante 30 días o a − 
70ºC por tres meses33 también se han realizado estudios para su 
conservación a – 10ºC en un medio compuesto por fosfato salino (PBS) 
pH 6.7, carbón 0.0025%, FBP al 0.1% (sulfato ferroso, metabisulfito de 
sodio, piruvato de sodio), L-cistina, glicerol 10%, por un periodo de 135 
días43. 
 
El medio FBP fue nuevamente probado a – 85ºC y a – 20ºC, donde se 
obtuvo una recuperación de 100% y 80% respectivamente después de un 
año44. 
 
Se estudió también su comportamiento en un medio de caldo brucela-
albúmina y glicerol al 10% a – 20ºC y a – 65ºC, en donde se observó que 
a – 20ºC no fueron recuperadas después de un mes y a – 65ºC los 
resultados de la viabilidad disminuyeron 6.5 logaritmos, también se 
liofilizaron cepas con sacarosa al 12% y leche descremada al 10%, el 
resultados entre estos dos soportes no fue diferente45, pero en ambos se 
recuperarón microorganismos. 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 38
2.1.5. Manifestaciones clínicas 
 
La infección por C. jejuni puede manifestarse de varias formas diferentes. 
La enteritis aguda es la presentación más común, con síntomas que 
duran de un día a una semana o más tiempo. 
 
El periodo de incubación es variable (1 a 7 días), y a menudo se producen 
síntomas como fiebre, cefalea y mialgias con un promedio de 12 a 24 
horas antes del comienzo de los síntomas intestinales. La diarrea puede 
variar de deposiciones blandas a una diarrea acuosa masiva o 
deposiciones con sangre y células inflamatorias. El dolor abdominal es un 
síntoma común y se manifiesta como cólico. Durante el punto álgido de la 
enfermedad, pueden producirse diez o más deposiciones diarreicas al día, 
la enfermedad suele ser autolimitada46. 
 
La infección también puede dar como resultado una colitis aguda con 
fiebre, cólicos abdominales y diarrea hemorrágica. El tenesmo es un 
síntoma frecuente y en las formas más severas, los pacientes tienen un 
aspecto tóxico. De forma ocasional el dolor abdominal agudo, en general 
en el cuadrante inferior derecho, puede ser el síntoma de infección más 
importante o único. Asimismo la fiebre muy alta y persistente puede ser la 
única manifestación de la infección. 
 
Se produce bacteriemia en menos del 1 % de los pacientes infectados por 
C. jejuni. Si bien las infecciones extraintestinales son raras, se han 
informado casos de meningitis, colecistitise infecciones urinarias34. 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 39
2.2.0 Helicobacter pylori 
 
La presencia de microorganismos espirales en el estómago de mamíferos 
fue descrito inicialmente por Bizonnero en 1893, tres años después en 
1896, Solomón describió microorganismos espirales “espirilos”tanto en 
gatos como en perros, en 1906, Baltour observó espiroquetas en gastritis 
y úlcera intestinas de perros y monos. 
 
La primera descripción de este microorganismo en humanos fue realizada 
por Krienitz, en 1906 con estas evidencias de la presencia de éste 
microorganismo en el epitelio gástrico se retoman estos estudios en 1924, 
por Lucko y Seth, quienes describieron, la presencia de una considerable 
producción de ureasa en el estómago, producida por Helicobacter pylori. 
 
En 1938, Doenges describió espiroquetas con la descripción morfológica 
actual de Helicobacter pylori en estomago de victimas accidentadas. 
En 1975 Steer y Colin-Jones describieron a la bacteria sobre la superficie 
luminar de las células epiteliales de pacientes con úlcera gástrica. 
 
El crédito del redescubrimiento de este microorganismo y subsecuentes 
eventos son atribuidos a Marshall y Warren quienes lograron por primera 
vez el aislamiento de H. pylori y publicaron en 1983, un trabajo en donde 
se ponía atención a la estrecha relación entre H. pylori la gastritis y ulcera 
duodenal45. 
 
En 1989, Campylobacter pylori (antes C. pyloridis) fue reclasificado en un 
nuevo género como Helicobacter pylori. Desde 1983, se ha dedicado un 
considerable interés al Helicobacter pylori, que se ha observado sobre la 
superficie del epitelio antral gástrico en pacientes con gastritis crónica 
activa34 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 40
2.2.1. Morfología y fisiología 
 
En los cortes de tejidos, los microorganismos pueden verse más 
fácilmente con una tinción con plata, pero en muchos casos también se 
les puede demostrar de forma directa en los frotis de tejidos teñidos con la 
tinción de Gram. 
 
Aparecen estrechamente asociados con las superficie de las células 
epiteliales y en la luz, debajo de la capa mucosa. En los tejidos, los 
microorganismos son curvos y Gram negativos, mientras que en los 
cultivos a menudo tienen forma más forma de bastón y se observan 
células grotescas en forma de U y circulares. 
 
Las cepas de H. pylori tienen cierto número de características que las 
diferencian de las especies del género Campylobacter: las 
campilobacterias tienen un solo flagelo polar, mientras que el H. pylori 
tiene un ramillete de flagelos polares que están envainados, no se 
observan filamentos axiales. La movilidad óptima, que es de naturaleza 
en sacacorchos o espiral, aparece en los medios altamente viscosos, 
como la capa mucosa gástrica. 
 
2.2.2. Epidemiología 
 
En 1994, la Organización Mundial de la Salud (OMS) a través de su 
Agencia para la Investigación en Cáncer (IARC) consideró que H. pylori 
era un agente carcinógeno del grupo 1 para el hombreI. 
 
Se ha encontrado en diferentes estudios que la prevalecía de infección 
por H. pylori en personas asintomáticas aumentan la prevalecía de 
gastritis que a su vez se aumenta a medida en que avanza la edad. La 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 41
prevalecía de H .pylori depende en gran parte del nivel socio-económico, 
la raza y condiciones higiénico-sanitarias. 
Se ha sugerido que la manipulación de secreciones del conducto 
digestivo superior puede ser un mecanismo de transmisión persona a 
persona. Se menciona también la posibilidad de transmisión intrafamiliar 
persona a persona y por especies distintas a la humana es decir una 
posible zoonosis. 
 
El reservorio de H. pylori aun se desconoce aun cuando se ha 
demostrado la viabilidad del microorganismo durante largo tiempo en el 
agua47. 
El estado socioeconómico pobre es un factor de riesgo importante para la 
enfermedad péptica de la úlcera. El trabajo vigoroso puede aumentar el 
riesgo de esta enfermedad con la infección de H .pylori y los factores 
genéticos no influyen el riesgo en adultos48. 
 
El reciente interés en H. pylori fue suscitado por los estudios de muestras 
de biopsia gástrica procedentes de pacientes con gastritis aguda y 
crónica, ulceras gástricas y duodenales y otras afecciones 
gastrointestinales. Desde 1982, cuando el H. pylori se aisló por primera 
vez de material de biopsias, se ha demostrado en reiteradas ocasiones la 
asociación de este microorganismo con la gastritis antral y de la gastritis 
antral con las ulceras gástricas y duodenales34. 
 
2.2.3. Patogenia 
 
Helicobacter pylori crece óptimamente en pH de 6 a 7 y muere o no se 
desarrolla, en el pH de la luz gástrica. El moco del lado luminal tiene pH 
bajo de 1 a 2, en el lado epitelial el pH es de casi 7.4. H. pylori se sitúa 
profundamente en la capa mucosa cerca de la superficie epitelial donde el 
pH es fisiológico. 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 42
H. pylori muestra una potente actividad ureasa que genera la producción 
de amonio y amortigua adicionalmente el ácido. El H. pylori es muy móvil 
aun en el moco y es capaz de desplazarse hacia la superficie epitelial40. 
Los microorganismos son sensibles al ácido y parecen residir como una 
capa profunda en el revestimiento mucoso de estómago. 
Son muy móviles y se asocian estrechamente con las células gástricas 
que secretan moco. Parecen invadir la mucosa gástrica en las regiones de 
las uniones intercelulares y producir gran cantidad de iones amonio y 
dióxido de carbono a partir de la urea presente en el lugar. 
 
La presencia de los microorganismos sobre la superficie, entre los 
enterocitos, en la profundidad de las glándulas antrales y dentro de los 
enterocitos da como resultado una respuesta inflamatoria que incluye 
leucocitos polimorfonucleares. En algunos pacientes con gastritis crónica 
se produce la perdida de las microvellosidades en las regiones 
parasitadas34. 
 
2.2.4. Identificación en el laboratorio y conservación 
 
Cuando se incuba a 37ºC en un ambiente microaerofílico crece de 3 a 6 
días, los medios para aislamiento primario incluyen el medio se Skirrow 
con vancomicina, polimixina B y trimetroprim, el medio de chocolate y 
otros medios selectivos con antibióticos (vancomicina, ácido nalidíxico, 
anfotericina)40. 
 
H. pylori es un microorganismo microaerofílico y, si la humedad es 
elevada, puede proliferar a 37ºC en incubadoras con CO2 estándar que 
contenga 10% de CO2. Prolifera con los medios que contienen sangre 
entera o lisada y produce colonias circulares, translúcidas y no 
pigmentadas. No metaboliza ninguna azúcar34. 
 
Magnolia Jiménez Rodríguez 
 43
Las colonias son traslúcidas de 1 a 2 mm de diámetro, es oxidasa y 
catalasa positiva y es un fuerte productor de ureasa49. 
 
Se ha observado que Helicobacter pylori es una bacteria frágil al, 
almacenarse a temperaturas bajas y ultra bajas en comparación con otras 
bacterias intestinales; se observó que en suspensiones bacterianas de 
solución salina, Escherichia coli y Bacteroides, se conservaron a 4ºC, − 
20ºC y – 80ºC por tres semanas; Escherichia coli y Bacteroides fueron 
recuperados, y Helicobacter pylori no se recuperó50. 
 
En algunos estudios realizados para la preservación de Helicobacter pylori 
se ha encontrado que puede ser conservado en nitrógeno líquido en un 
medio de caldo BHI con glicerol al 20%, a – 70ºC, en agua peptonada al 
1% con glicerol al 25%49. 
 
También se ha observado que se tiene una buena recuperación en 
medios con leche descremada-glicerol 17%, caldo brucela-glicerol 20% y 
cistina-albúmina-glicerol 20%, con una mejor recuperación a – 70ºC que a 
– 20ºC51. 
 
El caldo brucela-sangre caballo 2%-glicerol 17%-mucina 10% a – 70ºC es 
otro medio eficaz para la conservación de Helicobacter pylori hasta por 9 
meses52. 
Se ha observado también que en sangre de oveja, caballo, suero de 
caballo con/sin glicerol o medios