20211214084628-0154-TL

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BENÉMERITA UNIVERSIDAD 
AUTÓNOMA DE PUEBLA 
 
Facultad de Ciencias Químicas 
Departamento de Bioquímica-Alimentos 
 
Proyecto de Tesis 
Estudio de la proteína NudX de 
Azospirillum baldaniorum Sp245 
 
Presenta: p.Q.F.B. Jesús Emiliano Toscano Jiménez 
Licenciatura en Químico Farmacobiólogo 
 
 
Director de Tesis: D.C. Alberto Ramírez Mata 
ICUAP – Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas 
 
 
Codirector de tesis: D.C. Laura Morales Lara 
Facultad de Ciencias Químicas – Laboratorio de Bioquímica-Alimentos 
 
 
Noviembre 2021 
 
 
 
 
 
BENÉMERITA UNIVERSIDAD 
AUTÓNOMA DE PUEBLA 
 
Facultad de Ciencias Químicas 
Departamento de Bioquímica-Alimentos 
 
Proyecto de Tesis 
Estudio de la proteína NudX de 
Azospirillum baldaniorum Sp245 
 
Presenta: p.Q.F.B. Jesús Emiliano Toscano Jiménez 
Licenciatura en Químico Farmacobiólogo 
 
 
Director de Tesis: D.C. Alberto Ramírez Mata 
ICUAP – Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas 
 
 
Codirector de tesis: D.C. Laura Morales Lara 
Facultad de Ciencias Químicas – Laboratorio de Bioquímica-Alimentos 
 
 
Noviembre 2021 
 
 
 
 
 
 
 
OFICIO C.Q./CT 039P/2021 
 
 
C. Jesús Emiliano Toscano Jiménez 
PRESENTE 
 
Toda vez que se cuenta con la aprobación del Coordinador del Área de Bioquímica-Alimentos, le comunico 
que su anteproyecto de Tesis denominado: 
 
“Estudio de la proteína NudX de Azospirillum baldaniorum Sp245” 
 
ha sido autorizado, siendo: 
 
D.C. Alberto Ramírez Mata, Director de Tesis 
D.C. Laura Morales Lara, Asesor de Tesis 
 
Y con esta fecha se registra en los archivos de la Dirección de esta Facultad, para los fines legales que tenga 
lugar. 
 
Atentamente 
“Pensar bien, para vivir mejor” 
H. Puebla de Z., 3 de septiembre de 2021 
 
 
 
 
 
 
Dr. Jorge Raúl Cerna Cortez 
Director Facultad de Ciencias Químicas 
 
 
c.c.p. Archivo 
 
Cadena digital: 2Or"Cp&Rp*Dq.Mb(Lk+Bz$Ga,My)Bg#Vi.Lw&Fn&Nf+Rz#Pf*Ft%Od"Uf-
Ge*Px'Tc$Om%Vc/Fu&Xd+Lz)Dq)Ht#Zq$St(Vb.Ue(Wy%Ep+Or*Lr"Yj%Ce#Uv"Yk/Cn)Yk,Gy.Ku*Ii)Vh#Po(Ea/Vy-
Jv+Zm/Sq/Pf/Px"Sb*Il'Nx/Js/Wl/Wr$Dr+Na$Tj/Ne"Iu*Ru#Rq!Ye-
Sh$On(Lh#Ep$Vk+Zp)Qx)Zb"Vc#Oq$Yp%Yn!Oo,Ml%Iy$Uq&Tm'Lk#Gg.Bw,Sw'Ax%Sn+ 
 
 
 
 
 
 
 
OFICIO C.Q./CT 048CR/2021 
 
D.C. Nora Hilda Rosas Murrieta 
D.C. Armando Mena Contla 
M.C. Leticia García Albarrán 
 
 
Con toda atención comunico a Ustedes que se les propone como integrantes de la Comisión Revisora del 
trabajo de Tesis que presenta el pasante de la Licenciatura en Químico Farmacobiólogo 
 
Jesús Emiliano Toscano Jiménez 
 
cuyo título es: 
 
“Estudio de la proteína NudX de Azospirillum baldaniorum Sp245” 
 
realizada en el área de Bioquímica-Alimentos. 
 
 
Asimismo, les solicitamos que a la brevedad posible emitan el dictamen correspondiente. 
 
 
 
Atentamente 
“Pensar bien, para vivir mejor” 
H. Puebla de Z., 19 de noviembre de 2021 
 
 
 
 
 
Dr. Jorge Raúl Cerna Cortez 
Director Facultad de Ciencias Químicas 
 
 
c.c.p. Archivo 
Cadena Digital: 1Jf"Zq&Ak.Bj"Lz)Ou-No'Yr$Or%Od)Qe%Du!Ib%Kw/Nb*Cl'Xx'If"Jy+Vo-Yi"Uc#If-
Wb)Oe,El,Tj+Td$By*Ml,Yu.Br)Fz&Iy)Ie&Qh)Tv$Jy)Bz!Ou)Ik)Dl/Gb"Su!Vk+Hj#Vv)Uk(Qt$Ic!Ja&Cp!Nc)Mc#Le,Tt(Ok*Yw$Wc$Te
*Vh+Uu$Rm-Px%Qc(Dq&Su+Mo.Ea(Ds+Cs+Wn"Ay!Yz&Vz'Tx,Sg!Zo%Go.Ee-Mf$Hz/Gc+Tr!Uv$Gs&Gv(Wb*Bg%Wm$Hc#Li. 
 
 
 
 
 
OFICIO C.Q./CT 040A/2021 
Dr. Jorge R. Cerna Cortez 
Director Facultad de Ciencias Químicas 
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla 
 
Los que suscriben, integrantes de la Comisión Revisora de Tesis del alumno de la Licenciatura en Químico 
Farmacobiólogo 
Jesús Emiliano Toscano Jiménez 
 
realizada en el área de Bioquímica-Alimentos, comunican a Usted la autorización para la publicación del 
Trabajo de tesis bajo la dirección del D.C. Alberto Ramírez Mata y la D.C. Laura Morales Lara, con el siguiente 
título: 
 
“Estudio de la proteína NudX de Azospirillum baldaniorum Sp245” 
Se extiende la presente, para los usos que al interesado convengan el día 1 de diciembre de 2021. 
 
Atentamente 
“Pensar bien, para vivir mejor” 
H. Puebla de Z., a 2 de diciembre de 2021 
 
 
____________________________________ 
D.C. Nora Hilda Rosas Murrieta 
PRESIDENTE 
 
 
____________________________________ 
D.C. Armando Mena Contla 
SECRETARIO 
 
 
____________________________________ 
M.C. Leticia García Albarrán 
VOCAL 
 
c.c.p. Archivo 
Cadena digital: 0Wr"At+Va!Av/Bu/Uh#Hp%Fv-
Iy/Ii,Mo+Go"Jh(Qy,Zw*Ya&Jz/Nn"Uk'Nk&Ur)Wz'Cr$Sj.Rq&Bo'Ra(Io/Er(Ub(Ml%Ot$Gp!Vu*Rn(Sj/Ho+Bf+Zl,Xh/Ss,Ni'Kv$Fc&Eq
(Jc$Lw&Gb+Le&Gb)Ny&Ty!Nk%Oy'Ls(Pj%Ox%Rl-Zk"Ho#Bs-
Fm.Rd&Jc.Jb.Xh"Tu!Ep+Jt,Gv/Dm.Hf+Fe,Ox,Wq%Fz+Hh!Lr!Li+Tm*Ta,Wl,Qv-Td%Xe!Cl"Lk!Wb*Qp*Dk&Yn&Ad) 
 
 
 
 
 
 
 
 
OFICIO C.Q./CT 039J/2021 
 
Mtro. Ricardo Valderrama Valdez 
Director de Administración Escolar 
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla 
P R E S E N T E 
 
En relación al oficio de fecha 26 de noviembre de 2021, signado por el Coordinador del Departamento de 
Bioquímica-Alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas, me permito comunicar a Usted el nombre de los 
catedráticos que integran el Jurado de Examen Profesional de la Licenciatura en Químico Farmacobiólogo, 
quien con número de matrícula 201446040, en la Modalidad de Titulación por Tesis sustentará: 
 
JESÚS EMILIANO TOSCANO JIMÉNEZ 
JURADO 
D.C. Nora Hilda Rosas Murrieta, Presidente 
D.C. Armando Mena Contla , Secretario 
M.C. Leticia García Albarrán , Vocal 
 
Examen que se realizará el día 08 de diciembre de 2021, a las 13:00 horas en sesión en línea, mediante la 
Plataforma establecida. Esperando una respuesta favorable al presente, le reitero mi atenta y distinguida 
consideración. 
 
Atentamente 
“Pensar bien, para vivir mejor” 
H. Puebla de Z., 7 de diciembre de 2021 
 
 
 
 
 
Dr. Jorge Raúl Cerna Cortez 
Director Facultad de Ciencias Químicas 
 
c.c.p. Archivo 
Cadena digital: 
1Cc,Aq&Tc"Fn!Fj.Ic+Dm"Eo%Nn#Wp&Et&Eq,Jn/Lz/Kf#Jw(Wo#Dq"Cs*Ta,Ul.Sf*Ky'Er,Xt)Dl!Je+Xy+Wq.Ab'Mr'Qr#Vc#Md#Ri(M
t)Ln"Xk-Nl)Jm,Yf)Ns+Gv)Bj,Ll#Cj-
Bf&Cp,Bn+Tt"Vi+No'Vp)Cs.Ov*Wz"Ai+Nb"Il+Or*Lf/Hn!Vb"Jj'Bo!Mx/Rs,Gk%Er#Ky.Na)Qw&Zj&Gn*Ln%Fd(Gt(Kh$Sg)Dt!Lk!Zh-
Zg!Hy&Jz%Pl-Ct,Ae"Nf.Ja+Ji.Kw, 
 
ii 
 
Agradecimientos. 
La realización de este trabajo se debe en parte al apoyo y trabajo de familia, amigos y 
compañeros de laboratorio. 
Gracias a la Dra. Baca por abrirme las puertas de su laboratorio. Al Dr. Alberto por aceptarme en 
el equipo de trabajo y depositar su confianza en mí para trabajar en este proyecto. A Daniel por 
su amistad y su dedicación, sin los cuales, no hubiera podido desarrollar este emocionante 
trabajo. A la Dra. Sandra por su retroalimentación, enseñanzas y por compartir su buen humor 
todos los días en el laboratorio. A la Química María Luisa por guiarme en mis primeros días en 
el laboratorio y por siempre estar dispuesta a ayudarme y asesorarme. A Ricardo, por ser la 
persona mas dispuesta y ávida a compartir todo su conocimiento, gracias por responder a todas 
mis inquietudes. A los demás compañeros del laboratorio, que formaban parte de mi día a día y 
con quienes compartí momentos y risas. A todos aquellos docentes cuyas enseñanzas me han 
marcado como persona y como profesionista. 
Gracias a mi madre, por ser tan amorosa y siempre apoyarme incondicionalmente. A mi padre, 
por haberme dado todo y siempre cuidar de mí. A mi abuela, Lolo, eres mi segunda madre y 
pilar en mi corazón. A mi familia en general, por siempre apoyarme en todo. A mis amigos, gracias 
por siempre estar ahí. A mi abuelo Vicente, mi abuela Piedad y mi tía Cora, quienes ya no están 
entre nosotros, pero siempre los llevo conmigo. 
Gracias a Alexandra Elbakyan, por abrir las puertas de la ciencia a todos. 
Gracias a todos ustedes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
iii 
 
ÍNDICE 
Resumen .....................................................................................................................................................1 
I. Introducción ............................................................................................................................................. 2 
I.I. El Género Azospirillum .................................................................................................................... 2 
II. Antecedentes .......................................................................................................................................... 3 
II.I. Proteínas NUDIX ............................................................................................................................. 3 
II.II. Nuevos sustratos de enzimas NUDIX: alarmonas .................................................................... 6 
II.II.I Respuesta astringente: (p)ppGpp ........................................................................................... 7 
II.II.II Dinucleótidos polifosfato: NpnNs ............................................................................................ 8 
II.III. Proteínas NUDIX y virulencia ...................................................................................................... 9 
III. Antecedentes directos ....................................................................................................................... 11 
IV. Planteamiento del problema ............................................................................................................. 12 
V. Justificación .......................................................................................................................................... 12 
VI. Objetivos .............................................................................................................................................. 13 
VI.I. Objetivo general ........................................................................................................................... 13 
VI.II. Objetivos específicos ................................................................................................................. 13 
VII. Diagrama de trabajo ......................................................................................................................... 13 
VIII. Material y métodos ........................................................................................................................... 14 
VIII.I. Material biológico 
VIII.I.I. Cepas .................................................................................................................................... 14 
VIII.I.II Vectores ................................................................................................................................ 14 
VIII.II. Métodos ...................................................................................................................................... 14 
VIII.II.I. Condiciones y medios de cultivo ...................................................................................... 14 
VIII.II. II. Electroforesis en gel de agarosa ................................................................................... 15 
VIII.II.III. Extracción de ADN de geles de agarosa ...................................................................... 16 
VIII.II. IV. Extracción y manipulación de ADN .............................................................................. 16 
VIII.II.V. Ensayos de restricción enzimática ................................................................................. 16 
VIII.II.VI. Preparación de células quimiocompetentes de E. coli .............................................. 16 
VIII.II.VII. Transformación de células quimiocompetentes de E. coli ....................................... 16 
VIII.II.VIII. Reacción en cadena de la polimerasa ....................................................................... 16 
VIII.II.IX Determinación de genes NUDIX en el genoma de A. baldaniorum Sp245 ............. 17 
VIII.II.X Búsqueda de secuencias promotoras para σ54 ........................................................... 18 
VIII.II.XI Alineamiento múltiple de secuencias y matriz de identidad ....................................... 18 
iv 
 
VIII.II.XII Análisis filogenético ......................................................................................................... 18 
VIII.II.XIII Predicción de la estructura secundaria ....................................................................... 18 
VIII.II.XIV Modelado de la estructura tridimensional de NudX .................................................. 19 
VIII.III Estudio bioinformático .............................................................................................................. 20 
VIII.IV Construcción de la mutante nudX::lacZ/KmR ...................................................................... 20 
X. Resultados ............................................................................................................................................ 21 
X.I. Estudio bioinformático .................................................................................................................. 21 
X.I.I. Gen nudX ................................................................................................................................. 23 
X.I.II. Producto proteico: NudX ....................................................................................................... 25 
X.I.II. Modelado de la estructura terciaria de NudX .................................................................... 31 
X.II. Construcción de la mutante nudX::lacZ/KmR .......................................................................... 37 
X.II.I Amplificación y clonación del fragmento B en pJMS ......................................................... 37 
X.II.II. Amplificación y clonación del fragmento A en pJMS-B .................................................. 40 
XI. Discusión ............................................................................................................................................. 42 
XII. Conclusión .......................................................................................................................................... 47 
XIII. Perspectivas ..................................................................................................................................... 48 
XIV. Bibliografía ........................................................................................................................................ 49 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
v 
 
 
Lista de Abreviaciones 
a.a Aminoácido 
ADN Ácido desoxirribonucleico 
ADP Adenosín difosfato 
ADPR ADP-ribosa 
Amp Ampicilina 
Ap4A Diadenosín tetrafosfato 
ARNm Ácido ribonucleico mensajero 
ARNr ARN ribosomal 
ARNt ARN de transferencia 
BbRppH ARN pirofosfohidrolasa de Bdellovibrio bacteriovorus 
CaCl2 Cloruro de calcio 
cAMP/CAP Complejo adenosín monofosfato cíclico/Proteína activadora por catabolitos 
c.b.p. Cuanto baste para 
CoA Coenzima A 
CTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio 
Da Daltones (unidad de masa atómica) 
dGTP Desoxiguanosín trifosfato 
di-GMPc Ácido di-(3´5´) guanosín-monofosfato 
D.O. Densidad óptica 
dNTP Desoxinucleósido trifosfato 
EcGDPMH GDP-manosa manosil hidrolasa de Escherichia coli 
EcRppH ARN pirofosfohidrolasa de Escherichia coli 
FeCl3 Cloruro de hierro 
GDMPH GDP-manosa manosil hidrolasa 
GDP Guanosín difosfato 
GMP Guanosín monofosfato 
GTP Guanosín trifosfato 
K Kilo (x1000) 
KCl Cloruro de potasio 
K2HPO4 Fosfato dibásico de potasio 
KH2PO4 Fosfato monobásico de potasio 
KOH Hidróxido de potasio 
Km Kanamicina 
Lb Libras 
M Mega (x1,000,000) 
MgSO4 Sulfato de magnesio 
mL Mililitros 
mM Milimolar 
N Normal 
Na2MoO4·2H2O Molibdato de sodio 
NaCl Cloruro de sodio 
NAD/ NADHDinucleótido de nicotinamida oxidado/ Dinucleótido de nicotinamida reducido 
NaOH Hidróxido de sodio 
NFb Malato semisólido libre de nitrógeno 
NH4Cl Cloruro de amonio 
NpnN Dinucleósido polifosfato 
NTP Nucleósido trifosfato 
ORF Marco de Lectura Abierto (Open Reading Frame) 
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction) 
vi 
 
pb Pares de bases 
PGPR Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (Plant Growth Promoting 
Rhizobacteria) 
RpoN Factor sigma alternativo 54 
RppH ARN pirofosfohidrolasa (RNA pyrophosphohydrolase) 
SDS Dodecilsulfato de sodio 
TAE Tris-Acetato-EDTA, buffer 
Tc Tetraciclina 
U Unidades de enzima 
WT Cepa Silvestre (Wild Type) 
µg Microgramos 
µM Micromolar 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
vii 
 
 
Lista de Ilustraciones 
Ilustración 1 Microscopía electrónica de transmisión de Azospirillum baldaniorum Sp245. 
Ilustración 2 
Gráfica de correlación lineal entre el tamaño del genoma procariota y el número de 
genes NUDIX para los cuales codifica cada genoma 
Ilustración 3 Representación gráfica de la estructura secundaria y terciaria de MutT 
Ilustración 4 
Control recíproco del crecimiento de Caulobacter crescentus por parte del di-GMPc 
y (p)ppGpp. 
Ilustración 5 Procesamiento y modificación de estructuras tipo caperuzas compuestas de NpnNs. 
Ilustración 6 
Resultados de los experimentos en la mutante nula de nudC en Pseudomonas 
syringae. 
Ilustración 7 Diagrama de trabajo. 
Ilustración 8 
Correlación entre el tamaño de genoma de Azospirillum baldaniorum y el número de 
genes NUDIX que en el codifican. 
Ilustración 9 Contexto genético del gen nudX de Azospirillum baldaniorum Sp245. 
Ilustración 10 Zona con altas probabilidades de unión a σ54 identificada mediante iPro54 PseKNC. 
Ilustración 11 Localización de los motivos encontrados por FIMO. 
Ilustración 12 Diseño de oligonucleótidos para amplificación de los fragmentos A y B. 
Ilustración 13 
Alineamiento y matriz identidad de las secuencias primarias de NudX de 
Azospirillum baldaniorum, MutT de Escherichia coli y MutX de Streptococcus 
pneumoniae. 
Ilustración 14 
Alineamiento y matriz identidad de la secuencia primaria de NudX contra los 
resultados de la búsqueda de BLAST en genomas de representantes brasilense y 
no brasilense del género Azospirillum y alfaproteobacterias 
Ilustración 15 Árbol filogenético de homólogos de nudX. 
Ilustración 16 
Alineamientos y matriz identidad de NudX contra representantes de las diferentes 
subfamilias NUDIX en búsqueda de una secuencia conservada de unión a sustrato. 
Ilustración 17 
Resultados de Phyre2 para la predicción de los elementos que conforman la 
estructura secundaria de NudX. 
Ilustración 18 Predicción de la estructura secundaria de NudX realizada por I-Tasser. 
Ilustración 19 
Superposición de estructuras tridimensionales del modelo de NudX generado por 
I-Tasser y el cristal 3EEU de BbRppH. 
Ilustración 20 
Superposición de las estructuras tridimensionales del modelo de NudX generado 
por SwissModel usando el cristal 3EEU-A como templado y el cristal 3EEU de 
BbRppH. 
Ilustración 21 
Superposición de las estructuras tridimensionales del modelo de NudX generado 
por C-I-Tasser (amarillo) y el cristal 3EEU de BbRppH 
Ilustración 22 
Alineamiento estructural entre el cristal 6VCQ de EcRppH, el cristal 3EEU de 
BbRppH y el modelo de NudX generado por SwissModel usando el cristal 3EEU de 
molde. 
Ilustración 23 
Gel de agarosa de la estandarización de los oligonucleótidos para amplificar el 
fragmento B. 
Ilustración 24 
Gel de agarosa de las reacciones de PCR llevadas a cabo con ADN plasmídico de 
las clonas candidatas. 
viii 
 
Ilustración 25 
Gel de agarosa con las reacciones de PCR llevadas a cabo con ADN plasmídico de 
C12 y C34. 
Ilustración 26 
Gel de agarosa de las reacciones de PCR en colonia de las clonas transformadas 
con el producto de ligación pJMS-B. 
Ilustración 27 Patrón de restricción de ADN plasmídico de la clona 45 y pJMS vacío como control. 
Ilustración 28 
Gel de agarosa con las reacciones de PCR para estandarizar la amplificación del 
fragmento A con los oligonucleótidos FnudA1 y FnudA2. 
Ilustración 29 
Reacciones de PCR con ADN plasmídico de las clonas transformantes obtenidas 
tras la transformación con pGEM-A 
Ilustración 30 
Mapa genético de la construcción pJMS-AB. 
 
 
 
 
 
 
Lista de Tablas 
Tabla 1 
Residuos conservados aledaños a la caja NUDIX que confieren especificidad de 
sustrato. 
Tabla 2 Cepas bacterianas utilizadas en este proyecto. 
Tabla 3 Vectores utilizados en este proyecto. 
Tabla 4 Composición de 1 litro de medio LB. 
Tabla 5 Composición de 1 litro de medio LB*. 
Tabla 6 Composición de 1 litro de medio SOC. 
Tabla 7 Composición de 1 litro de medio K-malato. 
Tabla 8 Reactivos y sus concentraciones utilizadas para llevar a cabo ensayos de PCR. 
Tabla 9 
Oligonucleótidos empleados para la amplificación de los fragmentos A y B del gen 
nudX de Azospirillum baldaniorum Sp245. 
Tabla 10 
Probables genes NUDIX codificados en el genoma de Azospirillum baldaniorum 
Sp245. 
Tabla 11 Motivos de unión a σ54 detectados por FIMO. 
Tabla 12 
Presencia de secuencias características de subfamilias NUDIX para ubicar a NudX 
dentro de una subfamilia. 
Tabla 13 
Recopilación de los valores de los indicadores de calidad estructural calculados 
para los modelos generados en este trabajo usando “Structure Asessment” de 
ExPasy. 
Tabla 14 
Tabla comparativa entre los residuos de la RppH de E. coli conservados a lo largo 
de diferentes representantes de la proteína RppH y sus equivalente estructurales 
en el cristal 3EEU y el modelo de NudX generado por SwissModel. 
 
 
1 
 
Resumen 
Actualmente el uso de agentes biofertilizantes representa una estrategia alterna al uso de 
fertilizantes químicos en el campo. El género de bacterias Azospirillum pertenece a un grupo de 
microorganismos catalogados como Rizobacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal que, 
como su nombre lo indica, favorece un desarrollo mas saludable y vigoroso en plantas. 
Azospirillum logra este efecto benéfico a través de la formación de una biopelícula sobre la 
superficie de la raíz que le permite un íntimo contacto con esta. Se sabe actualmente que el 
proceso de formación de esta biopelícula se encuentra regulado en gran medida por el segundo 
mensajero, diGMPc. En el Laboratorio de Interacción Bacteria-Planta (CICM-ICUAP) se ha 
estudiado el papel de las diguanilato ciclasas, las proteínas encargadas de sintetizar el diGMPc, 
en el modelo biológico Azospirillum. Derivado de estos estudios, se identificó un fenotipo anómalo 
en una cepa mutante del gen cdgC, que codifica para la denominada diguanilato ciclasa C. En 
esta cepa mutante en cdgC, denominada cepa 102-C, se llevó a cabo la inserción de una unidad 
genética conformada por dos genes reporteros que permitieron la selección de la cepa mutante, 
así como el rastreo de la expresión del gen cdgC. Adicionalmente, el desarrollo de una mutante 
por deleción del gen cdgC reveló fenotipos diferentes a los observados en la mutante por 
inserción. Datos recabados en la bibliografía indican una posible sobre-expresión del gen rio 
abajo de donde se llevó a cabo la inserción genética. Mediante estudios bioinformáticos se 
identificó la presencia de un gen que codifica para una presunta proteína NUDIX, aquí 
denominado nudX. Las proteínas NUDIX comprenden una amplia familia de hidrolasas 
ampliamente distribuidas en todos los dominios de la vida y en virus. Estas hidrolasas se 
caracterizan por llevar a cabo la hidrólisis de sustratos cuya naturaleza obedece a la fórmula 
general de nucleósidos difosfato unidos a una entidad X. Inicialmente las proteínas NUDIX fueron 
relacionadas con el depuramiento del pool celular de nucleótidos. Sin embargo, derivado de la 
caracterización de MutT de E. coli, la primer NUDIX hidrolasa descrita, han sido descritas 
proteínas homólogasque representan subfamilias dentro de este amplio grupo. Estas subfamilias 
se caracterizan por presentar afinidades diferenciales a diversos sustratos y secuencias 
específicas relacionadas con el reconocimiento a un tipo de sustrato en específico. En el presente 
trabajo se adopta un enfoque bioinformático para tratar de dilucidar la identidad catalítica del 
producto del gen nudX y tratar de relacionarlo con el fenotipo observado en la cepa 102-C. 
Además, también se realizaron modelos por homología de la estructura tridimensional del 
producto proteico del gen nudX para analizar la viabilidad de la conservación estructural del 
dominio y motivo NUDIX. Los primeros acercamientos al estudio de este presunto gen NUDIX 
revelaron una secuencia no canónica formando el motivo catalítico NUDIX. Sin embargo, tras 
una búsqueda en la literatura, se encontraron ejemplos de este tipo de hidrolasas con motivos 
catalíticos no canónicos pero que mantienen la actividad hidrolasa. Sumado a esto, en algunos 
casos la falta de conservación en este motivo está asociada con alguna modificación al momento 
de llevar a cabo el mecanismo de acción. También se identificó la presencia de una presunta 
zona promotora asociada al la subunidad sigma 54. La subunidad sigma 54 forma parte de la 
isoforma N de la ARN polimerasa o RpoN, asociada a la expresión de genes relacionados con la 
fijación de nitrógeno y la respuesta a estrés y privación nutricional. Adicionalmente, estudios de 
búsqueda de genes homólogos revelaron la conservación del contexto genético formado por los 
genes cdgC y nudX, lo cual plantea la posibilidad de una relación entre ambos genes para regular 
de manera conjunta los niveles de algún intermediario metabólico de naturaleza nucleotídica. 
 
2 
 
I. Introducción 
I.I. El Género Azospirillum 
En la década de 1970 los trabajos de la Dra. Döbereiner llevaron a la reclasificación de la bacteria 
Spirillum lipoferum, descrita por Beijerinck en 1925 en un nuevo género, Azospirillum, junto con 
la descripción de dos especies pertenecientes a este mismo, Azospirillum lipoferum (antes 
Spirillum lipoferum) y Azospirillum brasilense (Caballero-Mellado, 1993; Tarrand et al., 1978). 
Debido a su capacidad de asociarse con raíces de cereales y fomentar su crecimiento y 
producción, Azospirillum brasilense ha sido estudiada ampliamente en su ecología, fisiología y 
genética. Además, cada vez toma más popularidad como producto biotecnológico comercial para 
aumentar el rendimiento en el campo. 
El género Azospirillum comprende a un grupo de bacterias gram negativas pertenecientes a la 
subclase alfa de las proteobacterias, capaz de fijar nitrógeno, de desarrollo óptimo en 
condiciones microaerofílicas y de vida libre. Morfológicamente Azospirillum es pleomórfico, 
contando con una peculiar forma vibroide, de movimiento en espiral impulsado por un flagelo 
polar y varios flagelos perítricos; y formas planctónicas ovoides y sésiles. Azospirillum fue 
inicialmente aislado de suelos rizosféricos asociados a cereales. Su cultivo se hace en medio 
NFb que es libre de nitrógeno y contiene malato como fuente de carbono. Otro medio popular 
usado para lograr cultivos puros de Azospirillum son aquellos adicionados con el colorante Rojo 
Congo, el cual se embebe en la matriz polimérica secretada por Azospirillum, la cual confiere 
soporte a la biopelícula tornando las colonias de un color rojo (Caballero-Mellado, 1993). 
Recientemente, la cepa Sp245 de Azospirillum brasilense junto con las cepas BR12001 y Vi22 
fueron reclasificadas en una nueva especie denominada Azospirillum baldaniorum, siendo la 
cepa Sp245 la cepa tipo (Ilustración 1). Esta última fue aislada por primera vez en Brasil a partir 
de raíces de trigo y se describe como “células gram negativas, en forma de bacilos ligeramente 
curvos o en espiral, miden 1.6-2.1 µm de largo y 0.6-0.7 µm de ancho. Son móviles con largos 
flagelos polares y varios laterales de menor longitud” (Ferreira et al., 2020). Su crecimiento 
óptimo se produce alrededor de 30°C y su genoma cuenta con un contenido de guanina y citosina 
del 68.4%. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Ilustración 1.- Microscopía electrónica de transmisión de Azospirillum baldaniorum Sp245. Se observa el flagelo polar. 
(Recuperado de Alenkina et al., 2014). 
 
3 
 
Actualmente el género Azospirillum es uno de los modelos biológicos de PGPRs mejor 
caracterizados, siendo las especies brasilense y lipoferum las más estudiadas por sus efectos 
en diferentes cultivos como maíz, trigo, arroz y caña de azúcar (Fukami et al., 2018). La habilidad 
de este género para promover el crecimiento vegetal recae en su capacidad de interactuar con 
la planta mediante la formación de una biopelícula sobre la superficie de la raíz. Las células 
independientes de este género son capaces de detectar la presencia de esta, movilizarse hasta 
ella y anclarse a su superficie para colonizarla y formar la biopelícula (Ramírez-Mata et al., 2014). 
Los fenotipos que le permiten a Azospirillum llevar a cabo este proceso están regulados 
principalmente por el segundo mensajero di-GMPc. En general, bajos niveles de di-GMPc están 
asociados a un fenotipo de alta movilidad y comportamiento virulento, mientras que la 
acumulación intracelular de este promueve la transición de la bacteria a un estado de vida sésil 
capaz de formar biopelícula (Shyp et al., 2021). El di-GMPc regula estos fenotipos mediante la 
interacción directa con diferentes efectores, entre estos figuran una amplia gama de enzimas y 
proteínas adaptadoras, así como factores transcripcionales, cinasas histidínicas sensoras y 
riboswitches (McDougald et al., 2012; Ramírez-Mata et al., 2014; Shyp et al., 2021). 
 
II. Antecedentes 
II.I. Proteínas NUDIX 
La superfamilia de proteínas NUDIX (Pfam: CL0261) comprende un amplio grupo. de proteínas 
evolutivamente relacionadas presentes en las tres formas de vida celular (arqueas, protistas y 
eucariotas) y en virus (Bessman et al., 1996; Srouji et al., 2017). El tamaño de estas proteínas 
puede variar dependiendo la actividad que llevan a cabo, mientras que los representantes de las 
NUDIX hidrolasas de NTP´s presentan un tamaño pequeño que ronda los 20 kDa, aquellas 
NUDIX hidrolasas que presentan actividad contra el NADH pueden tener tamaños hasta de 40 
kDa (Xu et al., 2000). Independientemente del tamaño, las NUDIX hidrolasas conforman una 
superfamilia mecanísticamente diversa, esto quiere decir que son un grupo de proteínas 
evolutivamente relacionadas y que comparten un mismo atributo en el mecanismo de reacción 
(Gunawardana et al., 2009). A pesar de que entre las proteínas de la superfamilia NUDIX existe 
un cierto grado de divergencia funcional, todas presentan el característico dominio o plegamiento 
NUDIX. Este está conformado por alrededor de 130 residuos aminoacídicos y presenta una 
arquitectura tipo “β-grasp”, también conocido como plegamiento NUDIX. El mecanismo catalítico 
de las enzimas NUDIX consiste en una sustitución nucleofílica en el fósforo beta de compuestos 
que compartan una estructura general de tipo nucleósido difosfato enlazado a una entidad X (A. 
S. Mildvan et al., 2005). De esta estructura general, común entre los sustratos de las NUDIX 
hidrolasas, proviene el nombre de esta superfamilia, por sus siglas en inglés “NUcleoside 
DIphosphate linked to an X moeity” (nucleósido difosfato ligado a una entidad X). Aunque, 
también se ha reportado la sustitución tomando lugar en el carbono enlazado al grupo fosfato 
(enlace C-O-P) de la ADP-ribosa (ADPR) en ADPR hidrolasas (Gabelli et al., 2002). De acuerdo 
con la estructura general de los sustratos de las NUDIX hidrolasas, existe un amplio catálogo de 
moléculas que pueden clasificar como tal. Los sustratos más representativos son los dNTP´s y 
NTP´s tanto canónicos como no canónicos, alcoholes y azúcares de nucleótidos, dinucleótidos 
polifosfatos (NpnN),coenzimas dinucleótidas (CoA) y ARNm (estructuras tipo caperuza) 
(Bessman et al., 1996; A. G. McLennan, 2006; A. S. Mildvan et al., 2005; Song et al., 2013). 
 
4 
 
El número de genes NUDIX en procariontes es altamente variable, sin embargo está relacionado 
con la complejidad metabólica y la adaptabilidad de cada especie, lo cual se ve reflejado en el 
tamaño del genoma, siendo que especies con genomas más grandes contienen mayor cantidad 
de genes NUDIX en comparación con genomas de menor tamaño (A. G. McLennan, 2006; 
Rodionov et al., 2008). En 2006 McLennan construyó la gráfica que se muestra en la Ilustración 
2 donde correlaciona la cantidad de genes NUDIX con el tamaño del genoma de la especie. 
Aunque se notan evidentes excepciones, la regla se cumple en general. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La proteína MutT de Escherichia coli fue la primera enzima NUDIX en ser caracterizada. Esta 
lleva a cabo una función de mantenimiento celular o “housecleaning function” al catalizar la 
hidrólisis de una versión oxidada del dGTP con alta actividad mutagénica, el 8-oxo-dGTP 
(Bessman et al., 1996). Sin embargo, es de importancia mencionar que la mayoría de miembros 
de las enzimas NUDIX presenten multiespecificidad o ambigüedad en su reconocimiento a 
sustrato, por lo que pueden reconocer e hidrolizar diferentes moléculas, como MutT que también 
es capaz de ligar e hidrolizar NTP´s y dNTP´s canónicos con diferentes constantes catalíticas 
para cada uno (Alexander G. McLennan, 2013) e incluso nucleótidos polifosfatados como el 
(p)ppGpp (Sanyal et al., 2020). 
 
La estructura secundaria de MutT está compuesta de dos alfa hélices y cinco láminas beta 
plegadas, de las cuales dos son paralelas y tres son antiparalelas. En forma más amplia y 
empezando desde el extremo N-terminal, la estructura secundaria de MutT está constituida por: 
β-plegada (A), giro cerrado, β-plegada (B), bucle-I, α-hélice-I, bucle-II, β-plegada (C), giro 
cerrado, β-plegada (D), bucle-III, β-plegada (E), bucle-IV y α-hélice-II (Ilustración 3A). Entre las 
β-plegadas A, C y D, junto con el extremo C-terminal y N-terminal de loop IV y el α-hélice II, 
respectivamente, se forma un surco (cleft) hidrofóbico en donde se liga la entidad de nucleótido 
de los sustratos de la enzima MutT (Ilustración 3B) (A. S. Mildvan et al., 2005). 
Ilustración 2.- Gráfica de correlación lineal entre el tamaño del genoma procariota y el número de genes NUDIX para 
los cuales codifica cada genoma. 1) Streptomyces avermatilis MA-4680; 2) Streptomyces coelicolor A3; 3) Frankia sp 
EAN1pec; 4) Bacillus cereus ATCC 14579; 5) Bacillus anthracis Ames; 6) Bacillus thuringiensis ser konkukian 97-27; 
7) Deinococcus radiodurans R1; 8) Burkholderia xenovarians LB400; 9) Bradyrhizobium japonicum USDA 110; 10) 
Burkholderia capacia 383; 11) Acidobacteria-3 sp; 12) Nostoc punctiforme PCC73102; 13) Bacillus halodurans C-125; 
14) Escherichia coli K12 (Recuperado de McLennan, A.G., 2006) 
 
5 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El motivo o caja NUDIX corresponde a la secuencia GX5EX7REX2EEXGU altamente conservada 
en enzimas NUDIX de tipo pirofosfohidrolasa y se encuentra a lo largo de la estructura tipo bucle-
I/α-hélice-I/bucle-II (Ilustración 3B). En esta estructura se encuentra un núcleo de ácidos 
glutámicos altamente conservados indispensables para llevar a cabo la catálisis. Estos ácidos 
glutámicos son los encargados de coordinar de uno a tres cationes divalentes, comúnmente 
Mg+2, que estabilizarán los enlaces polifosfatos del sustrato y activarán la molécula de agua que 
sirve como nucleófilo para atacar el enlace trifosfato en la posición β (Abeygunawardana et al., 
1995; Frick et al., 1994; Harris et al., 2000; J. Lin et al., 1996; Maksel et al., 2001; A. S. Mildvan 
et al., 2005; Albert S. Mildvan et al., 1999). 
 
Derivado de la caracterización de la enzima MutT gracias a los esfuerzos de Bhatnagar & 
Bessman, 1988; Maki & Sekiguchi, 1992 y a las actuales bases de datos genómicas y 
herramientas bioinformáticas, se han incorporado nuevos miembros a la familia de proteínas 
NUDIX hidrolasas (Tabla 1). Todos ellos están asociados al mantenimiento de las funciones 
celulares mediante la eliminación de metabolitos secundarios potencialmente deletéreos o 
controlando la acumulación de intermediarios bioquímicos, lo que promueve la supervivencia 
celular. 
 
Por su parte, Srouji et al., 2017 mencionan cuatro clases funcionales de proteínas con 
plegamiento NUDIX: pirofosfohidrolasas, glicosilasas de adenina A/G específicas, isopentenil 
Ilustración 3.- Representación gráfica de la estructura secundaria y terciaria de MutT. A: Disposición de estructura 
secundaria de MutT. B: Estructura terciaria de MutT. Se puede apreciar el plegamiento tipo NUDIX, así como las 
cadenas laterales de los ácidos glutámicos conservados de la caja NUDIX, ubicados en el motivo estructural loop I/α-
hélice I. En números romanos se señalan los bucles y se enumeran las α-hélices y en letras mayúsculas están 
señaladas las láminas β-plegadas. Se señala también la ubicación del surco hidrofóbico donde se liga la entidad 
nucleotídica (Recuperado de Mildvan, A.S. et al, 1999). 
B A 
 
6 
 
difosfato isomerasas y proteínas sin actividad enzimática pero capaces de llevar a cabo 
interacciones proteína-proteína y regulación transcripcional. Las isopentenil difosfato isomerasas 
y glicosilasas de adenina A/G específicas no cuentan con la secuencia del motivo NUDIX 
conservada, sin embargo, la arquitectura bucle/α-hélice/bucle permanece como el sitio catalítico. 
Por otro lado, las pirofosfohidrolasas cuentan con la caja NUDIX conservada y presentan un 
amplio rango de sustratos, también pueden presentar dominios adicionales. Las proteínas NUDIX 
sin actividad catalítica, por lo general forman parte de conglomerados proteicos multidominio en 
donde el dominio NUDIX liga moléculas pequeñas y/o interactúa con otros dominios. En estos 
casos, la secuencia conservada del motivo NUDIX puede presentar degeneraciones, pero 
conservando la estructura bucle/α-hélice/bucle y la capacidad de unir a su ligando. Se han 
descrito este tipo de enzimas en procesos de regulación transcripcional o asociados a canales 
de Ca+2. En ambos casos está presente un dominio N-terminal homólogo a las ADPR hidrolasas 
(Perraud et al., 2003; Rodionov et al., 2008; Srouji et al., 2017).………………… 
……………………………………..…. 
Partiendo de la información estructural y catalítica expuesta anteriormente, se puede inferir que 
la especificidad en el reconocimiento del sustrato recae en residuos dispuestos en algún lugar 
río arriba o río abajo de la caja NUDIX. En la Tabla 1 se hace una recopilación de los residuos 
altamente conservados en las diferentes clases de NUDIX hidrolasas que se encuentren fuera 
de la caja NUDIX y que su presencia haya sido efectivamente relacionada con el reconocimiento 
del sustrato que hidroliza. 
 
Tipo NUDIX Hidrolasa Motivo Conservado Ubicación 
MutT-like (d)NTP hidrolasa NDXbox: GX5EX7REXXEEXGU Estructura bucle-αhélice-bucle 
Ap4A hidrolasa / RppH 
(NudH*) 
R27, V137, F139 y K140 
(EcNudH) 
17 a.a. río abajo caja NUDIX 
ADP-ribosa hidrolasa 
(NudE*) 
Prolina 15 a.a. río abajo de 
NDXbox (EcNudF) 
15-16 a.a. río abajo caja 
NUDIX 
GDP-manosil hidrolasa 
(NudD*) 
Núcleo NUDIX degenerado: 
RLTMAE + D22, H88, Y90 y 
H124 (EcNudD) 
Núcleo caja NUDIX 
NADH hidrolasa (NudC*) SQXWPXPXS 8 a.a. rio abajo 
de NDXbox (EcNudC) 
10 a.a. río abajo caja NUDIX 
CoA hidrolasa (NudL*) LLTXR[SA]X3RX3GX3FPGG rio 
arriba y sobrelapando la 
NDXbox (EcCoA) 
Río arriba de la caja NUDIX 
Isopentenil Difosfato 
Isomerasa 
GX5EX7RRAXEEXGI / 
SX7EX14RRLXAEXGI 
Motivo NUDIX 
Glicosilasas de adenina 
A/G específicasNDXbox: GX5EX7REXXEEXGU Motivo NUDIX 
 Tabla 1.- Residuos conservados aledaños a la caja NUDIX que confieren especificidad de sustrato. *Tomando como 
referencia a Escherichia coli. Datos recuperados de (Bessman, 2019; Bessman et al., 1996; Foley et al., 2015; Gabelli 
et al., 2004; Srouji et al., 2017). 
 
II.II. Nuevos sustratos de enzimas NUDIX: alarmonas 
El repertorio de procesos en los que están involucradas las enzimas NUDIX se ha expandido a 
medida que fueron encontrando nuevos sustratos, por ejemplo, las alarmonas. Estas son 
 
7 
 
moléculas cuyos niveles se ven drásticamente aumentados ante situaciones de privación 
nutricional y estrés ambiental (ej., choque térmico, presencia de antibióticos, desecación, medio 
altamente oxidante, etc.), resultando en la reprogramación de la fisiología celular de un estado 
de crecimiento activo a un estado de supervivencia y crecimiento limitado. A esta reprogramación 
se le conoce como respuesta astringente y se vale de mecanismos transcripcionales y alostéricos 
para reorientar los recursos celulares a procesos relacionados con el metabolismo de 
carbohidratos, absorción de nutrientes, resistencia a antibióticos, expresión de genes de 
virulencia y síntesis de aminoácidos y la subunidad σ54. Al mismo tiempo, procesos proliferativos 
relacionados con la división celular, movilidad y síntesis de ribosomas, proteínas, nucleótidos, 
fosfolípidos, ARNr y ARNt se ven detenidos (Kanjee et al., 2012; Kundra et al., 2020). 
 
II.II.I Respuesta astringente: (p)ppGpp 
Las bacterias deben ser capaces de regular la progresión de su ciclo celular en respuesta a la 
disponibilidad de nutrientes en el medio (Gonzalez & Collier, 2014). Uno de los mecanismos por 
los cuales se lleva a cabo esta regulación es aquel mediado por las alarmonas GDP-3´difosfato 
y GTP-3´difosfato, abreviados como (p)ppGpp, reconocidas como las moléculas efectoras de la 
respuesta astringente (Kundra et al., 2020). Esta se refiere a una adaptación pleiotrópica, 
evocada por condiciones de estrés ambiental y privación nutricional (Ooga et al., 2009). Esta 
adaptación responde a la acumulación celular de (p)ppGpp, el cual es capaz de interactuar con 
la ARN polimerasa, afectar sus propiedades cinéticas y finalmente provocar un cambio general 
de la transcripción que promueva la reprogramación del estado metabólico de un estado de 
crecimiento activo a uno semi latente (Bernardo et al., 2009; Kundra et al., 2020; Potrykus & 
Cashel, 2008). En el caso de las alfa-proteobacterias, el (p)ppGpp es sintetizado e hidrolizado 
por una clase de proteínas de función dual conocidas como proteínas homólogas a RelA y SpoT 
(proteínas RSH) (Kundra et al., 2020). 
Recientemente se ha demostrado que la señalización del (p)ppGpp converge con el di-GMPc 
para controlar el crecimiento de Caulobacter crescentus de forma recíproca (Shyp et al., 2021). 
Cuando los niveles de (p)ppGpp son altos se arresta el crecimiento de Caulobacter en su estado 
no replicativo y móvil. Por otro lado, niveles bajos de di-GMPc fomentan un estilo de vida móvil, 
el aumento sostenido de este segundo mensajero dirige la transición a un estilo de vida sésil y 
replicativa, contrarrestando el efecto del (p)ppGpp (Ilustración 4A). 
Durante la etapa de crecimiento exponencial los niveles de ambas moléculas son similares, sin 
embargo, durante la etapa estacionaria los niveles de la alarmona sobrepasan hasta 50 veces 
los del di-GMPc. Ambos mensajeros celulares convergen en la proteína SmbA, la cual adopta su 
conformación activa cuando se encuentra en forma de apoenzima o unida a (p)ppGpp (Ilustración 
4B). SmbA modula el estado celular redox ejerciendo un importante rol protector ante el estrés 
oxidativo mediante la estimulación de enzimas como las tioredoxinas, glutaredoxinas o 
chaperedoxinas, lo cual alivia la carga oxidativa derivada de la vías glucolíticas y así el 
metabolismo de glucosa se ve promovido en condiciones de estrés (Shyp et al., 2021). 
Aunado a todo lo anterior, se ha reportado en la literatura la degradación del (p)ppGpp en E. coli 
por medio de la sobreexpresión de las enzimas NUDIX, NudG y MutT, capaces de unir e hidrolizar 
 
8 
 
(p)ppGpp a pGp (Sanyal et al., 2020). La sobreexpresión de estas enzimas fue capaz de reducir 
el pool celular de (p)ppGpp y revertir el defecto de crecimiento en cepas mutantes deficientes de 
SpoT, la principal hidrolasa de (p)ppGpp (Sanyal et al., 2020). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
II.II.II Dinucleótidos polifosfato: NpnNs 
Los dinucleótidos polifosfato (NpnNs), son considerados alarmonas cuya síntesis deriva de 
reacciones enzimáticas no canónicas en respuesta a condiciones de estrés y privación 
nutricional. Anteriormente se creía que estas moléculas no regulaban de manera activa la 
mitigación del estrés. Sin embargo, actualmente existe evidencia suficiente para considerar a 
estas como moléculas señalizadoras de estrés que, en procariontes, regulan la expresión génica 
al controlar la degradación de transcritos de ARNm (Ferguson et al., 2020; Luciano & Belasco, 
2020). 
La idea tradicional de que las moléculas de ARNm procarionte son protegidas de la degradación 
de la ARNasa E por la presencia de una entidad trifosfato en su extremo 5´ ha quedado obsoleta 
ante el hallazgo de novedosas estructuras tipo caperuza. En específico, resulta de interés la 
inclusión de una molécula de NpnN por parte de la ARN polimerasa como nucleótido iniciador de 
la transcripción en condiciones donde los niveles de esta alarmona se ven elevados, lo cual 
resulta en una molécula de transcrito protegida por un NpnN en su extremo 5´. En específico, los 
derivados de Ap4N se incorporan al inicio de la transcripción con mayor eficiencia que cualquier 
otro NpnN, en especial comparado con aquellos que cuentan con otro número de entidades 
fosfato (Luciano & Belasco, 2020). Este tipo de estructuras tipo caperuza de NpnN en ARNm son 
A 
B 
Ilustración 4.- Control recíproco del crecimiento de Caulobacter crescentus por parte del di-GMPc y (p)ppGpp. A: 
Influencia del (p)ppGpp y di-GMPc sobre la progresión del ciclo celular de Caulobacter crescentus. B: Efecto de la 
unión de di-GMPc y (p)ppGpp sobre el estado de activación de SmbA. (Recuperado y modificado de Shyp et al., 2021) 
 
9 
 
accesibles para su hidrólisis por parte de la enzima NUDIX, RppH y la enzima no NUDIX, ApaH, 
pero no por la ARNasa E (Ilustración 5A). Sin embargo, fue demostrado que en cultivos en fase 
estacionaria hay una mayor proporción de estas caperuzas metiladas en relación con su estado 
no metilado (Ilustración 5B). Las primeras representan un sustrato inaccesible para RppH, pero 
accesible para ApaH. Adicionalmente, la enzima ApaH se ve regulada negativamente en 
condiciones de estrés y recobra su expresión cuando el medio contiene nutrientes suficientes 
(Hudeček et al., 2020). La enzima RppH también es capaz de hidrolizar la entidad trifosfato del 
extremo 5´de los transcritos (Celesnik et al., 2007; Deana et al., 2008). La protección del ARNm 
con caperuzas de NpnN ofrece una explicación a los fenotipos asociados a altos niveles 
intracelulares de Ap4N observados en bacterias, entre los cuales destacan movilidad reducida, 
capacidad alterada de formación de biopelícula, invasividad reducida y desacoplamiento de la 
replicación de ADN y división celular (Ferguson et al., 2020; Ismail et al., 2003; Monds et al., 
2010). 
Similar al caso anterior, se demostró la presencia in vivo de ARNm modificado mediante la 
adición de NAD y CoA en su extremo 5´ (Chen et al., 2009; Kowtoniuk et al., 2009), presentando 
una nueva capa de regulación transcripcional. En el caso de las unidades transcripcionales 
protegidas en su extremo 5´ por NAD, estas fueron degradas por acción de la enzima NudC, pero 
inaccesibles para la ARNasa E y la RppH (Cahová et al., 2015). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
II.III.Proteínas NUDIX y virulencia 
Actualmente existen en la literatura referencias que relacionan la actividad hidrolasa de enzimas 
NUDIX con el fenotipo de formación de biopelícula y movilidad, dos características esenciales 
para la colonización efectiva de superficies bióticas. En 1995 Mitchell y Minnick identificaron y 
clonaron dos ORFs de Bartonella bacilliformis asociados a la invasión de eritrocitos humanos, 
cuya transformación en células de E. coli DH5α y HB101 resultó en cepas transformantes con 
una aumentada capacidad de invasividad en eritrocitos humanos. Estos genes son ialA y ialB 
(Mitchell & Minnick, 1995). En 1999, el producto de ialA fue descrito como una proteína 
perteneciente a la familia NUDIX (Conyers & Bessman, 1999), mostrando un alto grado de 
A B 
Ilustración 5.-. Procesamiento y modificación de estructuras tipo caperuzas compuestas de NpnNs. A: 
Procesamiento celular de ARN en E. coli y rol de RppH y ApaH en este mecanismo. B: Abundancia relativa de 
caperuzas compuestas de diguanosín tetrafosfato metilado en extractos de cultivos en fase de crecimiento 
exponencial y en fase estacionario. (Recuperado de Hudecek y cols. 2020) 
 
10 
 
identidad de secuencia con las Ap4A hidrolasas descritas en plantas. A partir de su secuencia 
fueron detectados homólogos en bacterias patógenas (Cartwright et al., 1999). El aporte de ialA 
a la invasividad de Bartonella bacilliformis fue explicado con base en su actividad hidrolítica de 
Ap4A. Este forma parte de la familia de las alarmonas que en concentraciones intracelulares 
elevadas promueven un estado de hipersensibilidad al estrés metabólico. Por tanto, la actividad 
hidrolítica hacia las alarmonas para reducir su nivel durante el proceso de invasión podría 
promover la supervivencia del patógeno. 
Posteriormente en 2001, Bessman y sus colaboradores identificaron el gen ydgP (actualmente 
rppH) de E. coli K1 y a su producto como una Ap5A hidrolasa asociada a la invasividad de células 
epiteliales microvasculares de cerebro (Bessman et al., 2001). 
Por su parte, Ismail y sus colaboradores generaron mutantes nulas de los genes rppH y apaH de 
Salmonella enterica serovar Typhimurium, las cuales exhibieron una disminución en la capacidad 
invasiva y de adhesión en células epiteliales humanas HEp-2 y U-937. En su trabajo, Ismail 
relaciona niveles elevados de alarmonas con la formación y función del complejo cAMP/CAP, el 
cual regula la expresión del factor sigma alternativo RpoF, que a su vez regula la expresión de 
operones flagelares en S. typhimirium (Ismail et al., 2003). Adicionalmente en 2005, el gen nudA 
fue identificado como factor de virulencia de Legionella pneumophila, agente causal de 
legionelosis, cuya resultó en una cepa de invasividad deficiente y crecimiento retardado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ilustración 6.- Fenotipo de la mutante nula de nudC en P. syringae. A: curva de crecimiento donde se hace evidente 
un retraso en el crecimiento de la mutante nula de nudC con respecto de la cepa silvestre (WT). B: Ensayos de 
formación de biopelícula. C: En ensayos de movilidad tipo swimming y swarming, la cepa mutante mostró una drástica 
disminución del movimiento cuando se compara con la cepa silvestre (Recuperado y modificado de Modzelan et al, 
2014). 
C 
A B 
 
11 
 
En cuanto al estudio de NUDIX hidrolasas en modelos fitopatógenos, Modzelan en 2014 generó 
una mutante nula en el gen nudC de Pseudomonas syringae. Esta mutante exhibió un fenotipo 
deficiente en movilidad y formación de biopelícula, además estaría impedida en viabilidad celular 
mostrando un retraso de crecimiento (Ilustración 6) (Modzelan et al., 2014). 
Por último, se ha descrito el involucramiento de las enzimas NUDIX en procesos de regulación 
transcripcional. Hasta hace poco, eran conocidos principalmente dos factores transcripcionales 
de la biosíntesis de NAD: NadR y NiaR. El primero es exclusivo de un reducido grupo de 
enterobacterias y el segundo es exclusivo de Firmicutes, Bacillus y Clostridium, así como en 
Thermotogales y Fusobacteria. En fechas más recientes se ha caracterizado un novedoso factor 
transcripcional denominado nrtR o regulador transcripcional tipo NUDIX (NUDIX Related 
Transcriptional Regulator). Este se compone por un dominio N-terminal tipo NUDIX bastante 
similar a las ADPR hidrolasas y un dominio C-terminal de unión a ADN. El ADPR es un derivado 
de la degradación de NAD y es capaz de unirse a NrtR e inhibir su actividad represora 
permitiendo la expresión de los genes de la vía biosintética y de captación de precursores de 
NAD. Concentraciones intracelulares elevadas de ADPR son indicativas de degradación activa 
de NAD. Este tipo de reguladores se han descrito en bacterias que no presentan alguno de los 
dos reguladores transcripcionales antes mencionados, incluidas γ-Proteobacterias, Firmicutes, 
Bacteroidetes, Cyanobacteria y Actinobacteria (Huang et al., 2009; Rodionov et al., 2008). Es 
común que buena parte de los miembros de esta familia cuenten con degeneraciones en los 
residuos conservados del motivo NUDIX, involucrando efectivamente la relación entre la 
actividad catalítica de estas enzimas con el grado de conservación de la secuencia consenso 
NUDIX. NrtR ha sido descrito en γ-Proteobacterias como Shewanella oneidensis, en cuyo caso 
la secuencia NUDIX no se encuentra conservada y carece de dos residuos de glutamato 
conservados esenciales para la coordinación del catión divalente (Huang et al., 2009); y 
Pseudomonas aeruginosa, que cuenta con una versión catalíticamente inactiva de NrtR y cuya 
mutagénesis compromete el comportamiento virulento (Okon et al., 2017). En Streptococcus suis 
se ha demostrado que el producto del gen nrtR carece de un ácido glutámico esencial de la caja 
NUDIX y aunque no presenta actividad catalítica aún tiene la capacidad de unirse a ADN. La 
eliminación de este regulador transcripcional resultó en una mutante con invasividad deficiente y 
menor formación de biopelícula (Wang et al., 2019). 
 
III. Antecedentes directos 
En 2013, en el laboratorio de Interacción Bacteria-Planta del ICUAP-CICM, Fernández 
Domínguez generó una mutante por inserción del gen cdgC, que codifica para una diguanilato 
ciclasa en Azospirillum baldaniorum Sp245, la cual fue denominada cepa 102-C. En este trabajo 
fue reportado un fenotipo con crecimiento retardado (Fernández Domínguez, 2013). En 2015 el 
trabajo de Romero Pérez en la cepa 102-C reveló fenotipos deficientes de movimiento y 
formación de biopelícula similares a los reportados en Pseudomonas syringae por Modzelan 
(Modzelan et al., 2014; Romero, Pérez, 2015). Esto último cobra más relevancia al considerar 
que, en teoría, de la mutación de un gen que codifica para una diguanilato ciclasa se esperaría 
un decremento en los niveles de di-GMPc y por lo tanto un incremento en movilidad y una 
disminución en la formación de biopelícula, contrario al fenotipo observado. Es probable que la 
 
12 
 
inserción en cdgC haya resultado en una mutación polar que modifique el marco de lectura y la 
expresión del gen río abajo. En 2017 Sierra cacho llevó a cabo la complementación génica de la 
cepa 102-C con una copia del gen cdgC, la cual no recobró el fenotipo silvestre. Aunado a esto, 
la generación de una cepa mutante por eliminación demuestra un fenotipo de crecimiento y 
formación de biopelícula similar al de la cepa silvestre (Sierra Cacho et al., 2021). 
Finalmente, el grupo de trabajo del Laboratorio de Interacción Bacteria-Planta realizó análisis 
bioinformáticos en el contexto genético de cdgC que concluyeron en la localización de un gen 
tipo NUDIX, aquí denominado nudX (NCBI: WP_014240082.1), río abajo del gen cdgC. Estos se 
encuentran separados por una región intergénica de 68 pb en la cual no se evidenció la presencia 
de secuencias promotorasreconocidas por el factor σ70. Adicionalmente, experimentos no 
publicados del grupo de trabajo demostraron la ausencia de un sistema de operón conformado 
por estos dos genes. 
 
IV. Planteamiento del problema 
Para que las bacterias promotoras del crecimiento vegetal puedan establecer una relación 
mutuamente benéfica con la planta, el microorganismo debe desarrollar una serie de 
mecanismos complejos: desplazarse en un medio como el suelo rizosférico y aledaño, censar la 
presencia de la raíz por quimiotaxis y anclarse físicamente a esta; los cuales son atributos 
esenciales para las PGPRs. Estos fenotipos están globalmente regulados por el segundo 
mensajero di-GMPc, el cual converge con la alarmona (p)ppGpp en la proteína SmbA. Esta 
misma alarmona ha sido relacionada como sustrato de enzimas NUDIX, al igual que el dGTP 
cuyo pool celular está relacionado con la capacidad de Azospirillum de mantener los mecanismos 
de señalización para sostener el progreso de la bacteria dentro de su ciclo celular normal, debido 
a que el dGTP es el sustrato de las enzimas diguanilato ciclasas que sintetizan al di-GMPc. La 
manera en cómo podría influir el producto de nudX en los niveles celulares de alguna alarmona 
o molécula relacionada con los fenotipos regulados por el diGMPc o incidir sobre el pool celular 
del sustrato principal para la síntesis de este, podría indicar una posible función biológica. 
 
V. Justificación 
El uso de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal, específicamente del género 
Azospirillum, como potenciadoras del crecimiento en plantas suscita una inevitable necesidad de 
entender los procesos por los cuales este tipo de bacterias logran instalar una relación 
mutuamente benéfica con organismos vegetales. El estudio cuidadoso y minucioso de las partes 
que componen un modelo biológico tiene como objetivo entender el funcionamiento de este. En 
concordancia con lo anterior, se ha encontrado en la literatura científica datos que relacionan a 
las proteínas tipo NUDIX con los fenotipos de formación de biopelícula y movilidad, procesos 
fundamentales para que Azospirillum ejerza su efecto benéfico. Además, el hallazgo del gen 
nudX río abajo del gen cdgC ofrece una oportunidad para explicar el inusual fenotipo observado 
en la mutante 102-C. 
 
 
13 
 
VI. Objetivos 
VI.I. Objetivo general 
• Identificar una posible función biológica del producto del gen nudX de Azospirillum 
baldaniorum Sp245 mediante un estudio bioinformático. 
VI.II. Objetivos específicos 
• Efectuar un estudio in silico del gen nudX y su contexto genético para diseñar 
oligonucleótidos y valorar la presencia de zonas promotoras. 
• Realizar un análisis bioinformático para buscar homólogos en otras bacterias del género 
Azospirillum, identificar posibles funciones de la proteína NudX de Azospirillum 
baldaniorum y valorar la conservación del plegamiento NUDIX y de su sitio activo. 
• Desarrollar una estrategia para construir la cepa mutante nudX::lacZ/KmR que permita 
evaluar cómo afecta la ausencia de este gen al fenotipo de movilidad, formación de 
biopelícula y crecimiento. 
• Generar un modelo estructural tridimensional de la proteína NudX. 
 
VII. Diagrama de trabajo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ilustración 7.- Diagrama de trabajo. 
 
14 
 
VIII. Material y métodos 
VIII.I. Material biológico 
VIII.I.I. Cepas 
Cepa Características Referencia 
E. coli DH5α F–, φ80, lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169, 
recA1, endA1, hsdR17, (rK–, mK+), phoA, 
supE44, λ–, thi-1, gyrA96 & relA1 
(Hanahan, 
1983) 
E. coli S17.1 recA, pro, hsdR & integración cromosómica de 
RP4-2-Tc::Mu-Km::Tn7 
(Simon et al., 
1983) 
E. coli ONE Shot 
Top10 
 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 
Δ lacX74 recA1 araD139 
Δ(araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG 
(Ho & Pastan, 
2009) 
Azospirillum 
baldaniorum 
Sp245 
Cepa WT 
AmpR 
(Ferreira et al., 
2020) 
Clona 68 E. coli DH5α + pGEM-A (AmpR, lacZα--) Este trabajo 
Clona 34 E. coli ONE Shot Top10 + pGEM-B Este trabajo 
Clona 45 E. coli DH5α + pJMS-B (KmR, TcR, lacZ) Este trabajo 
 Tabla 2.- Cepas bacterianas utilizadas en este proyecto. 
 
VIII.I.II Vectores 
Plásmido Características Referencia 
pGEM-T Easy AmpR, lacZα Promega® 
pJMS-lacZ Derivado de pSUP202: MCS, KmR, TcR, 
lacZ 
(Ramírez-Mata et 
al., 2016) 
pGEM-A pGEM-T Easy (AmpR) + Amplicón del 
fragmento A (lacZα--) 
Este trabajo 
pGEM-B pGEM-T Easy (AmpR)+ Amplicón del 
fragmento B (lacZα--) 
Este trabajo 
pJMS-B pJMS (KmR, TcR, lacZ) + Fragmento B Este trabajo 
 Tabla 3.- Vectores utilizados en este proyecto. 
 
VIII.II. Métodos 
VIII.II.I. Condiciones y medios de cultivo …………………………………………… 
Las cepas de E. coli DH5α y S17.1 fueron cultivadas en medio LB o LB modificado (LB*) líquido 
o en placa a 37°C con o sin agitación, suplementado con el antibiótico pertinente. Las cepas de 
Azospirillum baldaniorum Sp245 se sembraron en medio K-lactato y rojo Congo a 30°C con o 
sin agitación suplementado con el antibiótico de selección Gm [30 µg/mL], Tc [10 µg/mL], Amp 
[50 µg/mL] y Km [50 µg/mL]. 
 
15 
 
Medio Luria-Bertani (LB) 
Peptona de caseína 10.0 g 
Extracto de levadura 5.0 g 
NaCl 10.0 g 
Agar bacteriológico 15.0 g 
Ajustar a pH 7.0 con NaOH 1 N y esterilizar a 
15 lb por 30 minutos. 
Dejar en prueba de esterilidad 24 horas. 
 Tabla 4.- Composición de 1 litro de medio LB. 
Medio Luria-Bertani modificado (LB*) Medio SOC 
Peptona de caseína 10.0 g Peptona de caseína 20.0 g 
Extracto de levadura 5.0 g Extracto de levadura 5.0 g 
NaCl 5.0 g NaCl 0.58 g 
CaCl2·2H2O 0.367 g KCl 0.186 g 
MgSO4·7 H2O 0.616 g MgCl2 0.952 g 
Agar bacteriológico 15.0 g Glucosa 3.6 g 
Ajustar a pH 7.0 con NaOH 1 N y esterilizar 
a 15 lb por 30 minutos. Dejar en prueba de 
esterilidad 24 horas. 
 Ajustar a pH 7.0 con NaOH 1 N y esterilizar 
a 5 lb por 15 minutos. Dejar en prueba de 
esterilidad 24 horas. 
Tabla 5.- Composición de 1 litro de medio LB*. Tabla 6.-Composición de 1 litro de medio SOC. 
Medio mínimo K-malato 
KH2PO4 0.87 g 
K2HPO4 1.67 g 
MgSO4·7 H2O 0.2 g 
NaCl 0.1 g 
Acido málico 5.0 g 
KOH Ajustar a pH 6.8 
Ajustar a pH 6.8 con KOH 10% y esterilizar a 5 lb por 30 minutos y dejar enfriar. 
Finalmente agregar las siguientes soluciones: 
CaCl2 [2%] 1.0 mL 
FeCl3 [1%] 1.0 mL 
Na2MoO42H2O [0.2%] 1.0 mL 
NH4Cl [20%] 5.0 mL 
Solución de oligoelementos 1.0 mL 
Dejar en prueba de esterilidad 24 horas. 
 Tabla 7.- Composición de 1 litro de medio k-malato. 
VIII.II. II. Electroforesis en gel de agarosa………………………………………… … 
Para separar muestras de ADN con base en su carga y peso molecular, estas fueron sometidas 
a electroforesis en gel de agarosa. El gel fue preparado con 35 mL de buffer TAE 1x y agarosa 
0.8% p/v. Finalmente, el gel fue teñido mediante sumersión en solución de bromuro de etidio 
para posteriormente ser revelado en un transiluminador UV. 
 
16 
 
VIII.II.III. Extracción de ADN de geles de agarosa………………………………… 
La extracción de ADN a partir de geles de agarosa se llevó a cabo de acuerdo con las 
instrucciones incluidas por el proveedor. En breve, el fragmento de agarosa donde se encuentre 
la banda fue recuperado, posteriormente la agarosa fue disuelta y sometida a centrifugación 
donde el ADN fue retenido por un filtro, lavado y finalmente eluido con agua estéril libre de 
nucleasas. 
VIII.II. IV. Extracción y manipulación de ADN……………………… …………….. 
Para la obtención de ADN genómicode Azospirillum baldaniorum Sp245 y las mutantes se 
empleó el método de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) (Sambrook, 2001). Para la extracción de 
ADN plasmídico de las cepas mutantes y de las cepas de E. coli se utilizó el método de lisis 
alcalina con SDS e NaOH (Sambrook, 2001). En ambos casos la extracción de la muestra se 
realizó a partir de la recuperación y lisis del paquete celular generado en 24 horas en 5 mL de 
medio de cultivo suplementado con antibiótico cuando fue pertinente. 
VIII.II.V. Ensayos de restricción enzimática……………………… ………………. 
Los ensayos de restricción enzimática fueron realizados de acuerdo con las indicaciones del 
proveedor. Brevemente, las muestras fueron sometidas a incubación a 37°C durante 1 hora, 
seguidas de un tratamiento de inactivación térmica a 80°C por 20 minutos. Se utilizaron como 
reactivos el buffer adecuado para cada enzima de restricción a una concentración final de 1x 
(según las indicaciones del proveedor), una relación de 2 U de enzima de restricción por cada 1 
µg de DNA (de 1.0 a 2.0 µg de DNA por cada 20 µL de reacción) y agua estéril c.b.p. un volumen 
final de 20 µL de reacción. 
VIII.II.VI. Preparación de células quimiocompetentes de E. coli… …………… 
Las células quimiocompetentes de E. coli se prepararon conforme al método de Sambrook 
modificado (Sambrook et al., 2012). Este consiste en un tratamiento con solución fría de CaCl2 
[0.2M] a partir de un cultivo de bacterias de E. coli con una densidad bacteriana de 
aproximadamente 108 células/mL. Las células se lavaron varias veces y finalmente fueron 
suspendidas en 140 µL de una solución de CaCl2 [0.2M] y 60 µL de glicerol puro. 
VIII.II.VII. Transformación de células quimiocompetentes de E. coli 
Las células quimiocompetentes de E. coli fueron transformadas de acuerdo al protocolo descrito 
por Sambrook con modificaciones (Sambrook et al., 2012). Para esto se agregó en un tubo para 
microcentrífuga 100 µL de células quimiocompetentes. A este se añadieron aproximadamente 
10 µL del producto de ligación. Posteriormente, las células fueron sometidas a shock térmico 
(42°C por 45 segundos en baño maría o termoblock) y reposadas en hielo por 10 minutos. Todo 
el volumen de la reacción de transformación fue inoculado en 1.5 mL de medio SOC e incubado 
a 37°C por 1.5-2 horas. Pasado este tiempo, se sembraron de manera directa y concentrada 
distintos volúmenes de la reacción de transformación en placas adicionadas con el antibiótico 
correspondiente y X-Gal. Éste último sirve para detectar la complementación alfa en bacterias de 
E. coli que fueron transformadas con el vector vacío en vez de haber integrado el vector con el 
fragmento de interés clonado. 
VIII.II.VIII. Reacción en cadena de la polimerasa…………………………………………………. 
La reacción en cadena de la polimerasa fue descrita por primera vez en 1985 por Kary B. Mullis 
y consiste en la síntesis de múltiples copias de una secuencia de ADN específica usando la ADN 
polimerasa. Esta técnica hace uso de oligonucleótidos específicos complementarios a regiones 
de la secuencia que se planea amplificar, estos servirán de iniciadores para la polimerización de 
 
17 
 
la nueva cadena de ADN complementaria y están señalados en la tabla 9. Para llevar a cabo la 
amplificación es necesario someter la reacción a un ciclo de temperaturas que permitan la 
desnaturalización de doble cadena de ADN, el alineamiento de los oligonucleótidos y la actividad 
polimerasa. A la reacción son añadidos todos los elementos necesarios para que la ADN 
polimerasa sea capaz de llevar a cabo su actividad enzimática, estos se enlistan en la tabla 8. 
Reactivos Concentración final 
ADN molde 20 ng/µL 
Oligonucleótido delantero 0.15 mM 
Oligonucleótido reverso 0.15 mM 
5x GC Buffer 1x 
MgCl2 1.5 mM 
dNTP´s 0.25 mM 
Polimerasa 1.25 U 
Agua c.b.p. 20 µL 
Tabla 8.- Reactivos y las concentraciones utilizadas para llevar a cabo PCR. 
 
Oligonucleótido 
nudX 
Secuencia 
(5´-3´) 
Inserto de 
restricción 
Tamaño 
amplicón 
(pb) 
FnudA1 (r) TTgcggccgcACATGGCGCATCGCCTCTTC NotI 
(GCGGCCGC) 
854 pb 
FnudA2 (f) GGggtaccGAACCTTGCCCAGGCCGAAT KpnI 
(GGTACC) 
FnudB5 (f) CCcccgggATCATCGCCCTGCAATGAG XmaI 
(CCCGGG) 
822 pb 
FnudB6 (r) TTactagtGACATGGTGTACCCGGCCAT SpeI 
(ACTAGT) 
Tabla 9.- Oligonucleótidos empleados para la amplificación de los fragmentos A y B del gen nudX de Azospirillum 
baldaniorum Sp245. Todos los oligonucleótidos fueron diseñados mediante métodos bioinformáticos por el grupo de 
trabajo del Laboratorio de Interacción Bacteria-Planta del CICM-BUAP. 
 
VIII.II.IX Determinación de genes NUDIX en el genoma de A. baldaniorum Sp245 
Haciendo uso del software RAST (Overbeek et al., 2014) se cargó y procesó el genoma de 
Azospirillum baldaniorum Sp245 (GenBank: GCA_003119195.2), adicionalmente fue analizado 
para la búsqueda de genes NUDIX mediante búsquedas tipo BLAST en el mismo software 
usando las proteínas MutT de E. coli (UniProt: P08337), DR0079 de Deinococcus radiodurans 
(UniProt: Q9RY71), RppH de E. coli (UniProt: P0A776) y CoA pirofosfohidrolasa de Deinococcus 
radiodurans (Q9RV46) como templados. Los parámetros fueron ajustados para un valor de corte 
de e-value de 1e-02. El producto proteico de cada probable gen NUDIX encontrado en el genoma 
de Azospirillum baldaniorum Sp245 fue analizado con las plataformas SMART (Letunic et al., 
2021) y Pfam (Mistry et al., 2021) para búsqueda de dominios con el propósito de confirmar la 
presencia del dominio NUDIX. Ambos softwares se valen del e-value para calificar los resultados 
obtenidos; mientras este adopte valores cercanos a 0, el resultado tendrá cierto grado de 
 
18 
 
significancia. De manera similar se usó el software InterPro Scan (Jones et al., 2014) para la 
búsqueda de probables sustratos para cada producto proteico. 
VIII.II.X Búsqueda de secuencias promotoras para σ54 
Para identificar probables zonas de unión al factor σ54 en la zona río arriba del gen nudX se hizo 
uso de los software iPro54-PseKNC (H. Lin et al., 2014) y Virtual FootPrint (Münch et al., 2005). 
Adicionalmente se analizó la zona detectada por iPro54 y la zona entre esta misma y el codón 
de inicio de nudX con la plataforma online FIMO (Grant et al., 2011) para búsqueda de motivos, 
en este caso para la búsqueda de los elementos -12 y -24 de unión a σ54. FIMO calcula la 
significancia de los resultados obtenidos mediante dos indicadores, el p-value y el q-value. El 
primero se define como la probabilidad de que una secuencia aleatoria de la misma longitud que 
el motivo coincida en esa posición con un valor de score igual o mejor al estipulado en los 
parámetros de búsqueda, en este caso se tomará el valor de corte de 0.01 para el p-value. El q-
value se define como la taza de descubrimientos falsos. Tanto en el caso del p-value como el q-
value se buscan valores lo más cercanos a 0 posible. 
VIII.II.XI Alineamiento múltiple de secuencias y matriz de identidad 
Los alineamientos múltiples de secuencias fueron llevados a cabo usando el software Clustal 
Omega (Sievers et al., 2011). Este tipo de estudios forman parte de los análisis rutinarios 
bioinformáticos para la comparación de proteínas homólogas. Estos generan un alineamiento 
biológicamente significativo de secuencias lo que permite una fácil visualización de zonas 
conservadas a lo largo de estas. Adicionalmente, este software genera una matriz de identidad 
entre las secuencias evaluadas, aquellas secuencias que compartan un mínimo de 30% de 
identidad en su secuencia son consideradas homólogas. 
VIII.II.XII Análisis filogenético 
Se hizouso del software MEGA (Kumar et al., 2018) para llevar a cabo el análisis de relación 
filogenética entre NudX y sus homólogos encontrados mediante la búsqueda de BLASTp. Se 
utilizaron las secuencias nucleotídicas y el método de máxima verosimilitud para generar el 
cladograma. Adicionalmente MEGA calculó que el mejor modelo para generar el árbol 
filogenético es K2+G (K2: Kimura de 2 parámetros; +G: distribución gamma) con 1000 replicados. 
La posición de cada uno de los rama se valora tomando en cuenta el valor de Bootstrap, este 
informa acerca de la cantidad de veces que se observó una misma rama durante las repeticiones 
de la reconstrucción filogenética, este valor indica una alta probabilidad de que la rama se 
encuentre en la posición correcta mientras este sea más cercano a 100 (aunque esto depende 
de los parámetros elegidos). 
VIII.II.XIII Predicción de la estructura secundaria 
La secuencia primaria de NudX fue analizada con el software Phyre2 (Kelley et al., 2015) para 
generar una predicción de los elementos que conforman la estructura secundaria de esta 
proteína. La predicción típica de Phyre2 usa un código de colores para medir la confianza de la 
predicción de la estructura secundaria en el apartado “SS confidence”, donde la presencia de 
color rojo indica un alto grado de confianza y colores más asociados al azul indican una pobre 
predicción. Adicionalmente, Phyre2 devuelve la presencia de zonas desordenadas y lo califica 
con el mismo sistema de puntaje basado en colores mencionado anteriormente. Aquellas zonas 
donde se muestra un “?” denota zonas con un alto grado de desorden, mientras que en el 
apartado “Disorder confidence” se califica la relevancia de esta caracterización basado en el 
código de colores donde el rojo indica más confianza en la predicción de desorden. 
 
19 
 
Adicional a Phyre2, el software I-Tasser también genera una predicción de la conformación 
secundaria adoptada por la proteína analizada. Una típica predicción de la estructura secundaria 
toma en cuenta tres estados: alfa hélice (H), lamina beta (S) y bucle (C) con puntajes de confianza 
para cada residuo, aquel estado con mayor puntaje para cada residuo es el mostrado por I-
Tasser. El rango de este puntaje va desde 0-9, donde las predicciones de mayor puntaje son 
aquellas que presentan un mayor grado de confianza. 
VIII.II.XIV Modelado de la estructura tridimensional de NudX 
Haciendo uso de los softwares I-Tasser (Yang & Zhang, 2015) y SwissModel (Waterhouse et al., 
2018), se procesó la secuencia primaria de NudX para generar un modelo estructural 
tridimensional de esta proteína. I-Tasser busca varios posibles templados estructurales en bases 
de datos mediante alineamientos, una vez seleccionados estos moldes, I-Tasser construye el 
modelo “uniendo” los mejores empalmes de lo alineamientos realizados. Para calificar los 
modelos generados por I-Tasser, el software emplea 3 indicadores de calidad: el C-score, TM-
score y RMSD. El primero de ellos, C-score, adopta valores del rango -5 a 2, mientras más 
cercano sea el resultado a 2, significará que el modelo presenta una buena calidad. El TM-score, 
el cual mide la similitud estructural entre dos secuencias, presenta valores de 0 a 1, por lo que 
valores >0.5 indican una buena topología. Es conveniente mencionar que el TM-score evalúa 
zonas pequeñas dentro de la misma secuencia proteica, por lo cual este indicador es menos 
sensible a errores locales. Finalmente, el RMSD (raíz de la desviación cuadrática media) es el 
responsable de informar sobre la distancia presentada entre los átomos de dos proteínas 
superpuestas. Para este último parámetro, valores cercanos a 0.0 Å son los ideales, sin embargo, 
valores hasta de 2.0 a 4.0 Å son aceptables. Los modelos fueron validados mediante las 
plataformas SwissModel de ExPasy utilizando la herramienta “Structure Assessment” y la 
plataforma MolProbity (Williams et al., 2018) en su interfaz integrada en la plataforma 
SwissModel. Además, los modelos fueron comparados con los templados para evaluar la 
conservación del plegamiento NUDIX y de los residuos importantes para la catálisis y unión a 
ligando. 
Por otro lado, también se utilizó la plataforma SwissModel, la cual construye modelos por 
homología (Waterhouse et al., 2018). Este software parte de la secuencia problema para realizar 
una búsqueda en base de datos mediante el uso de dos metodologías: usando el método BLAST 
para encontrar estructuras de proteínas evolutivamente relacionadas a la secuencia problema; y 
mediante la metodología HHblits para añadir sensibilidad en caso de no encontrar homólogos 
cercanos. Posteriormente SwissModel califica los alineamientos encontrados con base en el 
valor de calidad global estimada para el modelo (GMQE: Global Model Quality Estimate) y 
devuelve al usuario una tabla resumen con las estructuras con mejor GMQE. De estas 
estructuras moldes seleccionadas se genera un modelo de manera automática transfiriendo las 
coordenadas de los residuos completamente conservados, las inserciones y deleciones son 
construidas por modelado de bucles y por último las cadenas laterales de los residuos no 
conservados son construidas sobre la estructura principal de las coordenadas del residuo molde 
respectivo en el alineamiento. Los modelos generados son calificados con el indicador 
QMEANDisCo, este se vale de potenciales estadísticos de fuerza para generar estimados de 
calidad a nivel global y local (Quality Model Energy ANalysis). Aunado a lo anterior, se toma en 
cuenta un puntaje de restricciones de distancia (Distance Constraints) en el cual se evalúa la 
consistencia en la distancia entre carbonos alfa (Cα-Cα) de un modelo contra las mismas 
 
20 
 
restricciones obtenidas de una estructura homóloga. El QMEANDisCo adopta valores de 0-1, 
mientras más cercano a 1 el estimado de calidad es mejor. Adicionalmente SwissModel se vale 
de la plataforma MolProbity para calcular diferentes parámetros de calidad estructural como el 
cálculo de la gráfica de Ramachandran, la cual representa los ángulos psi y phi de los ángulos 
diedros de los enlaces peptídicos. En esta gráfica se denotan zonas que representan los valores 
más usuales para los diferentes elementos que conforman la estructura secundaria de las 
proteínas, es decir, representan zonas donde suelen encontrarse los valores de enlaces psi y phi 
de las alfas hélices, láminas betas, hélices 310, etc., determinados experimentalmente. Por tanto, 
los residuos cuyos ángulos diedros formados por su cadena principal no “caigan” en alguna de 
estas zonas favorecidas se considera que cuentan con una mala conformación, en un modelo de 
buena calidad no debería haber más de 0.5% de residuos que no pertenezcan a las zonas 
favorecidas de Ramachandran (Ramachandran outliers) y por lo menos el 95% de los residuos 
debería estar dentro de la zona donde recaen el 98% de los residuos. El ClashScore representa 
la cantidad de átomos traslapados por más de 0.4 Å por cada 1000 átomos, por lo que este 
deberá ser lo más pequeño posible. También se calculan los enlaces y ángulos de enlace 
deficientes, en el primer caso no se deberá superar el 0.2% y en el segundo caso el 0.5%. El 
MolProbity Score el cual es un indicador único combinado de la calidad del modelo, se basa en 
una función de puntaje que toma en cuenta los residuos en las zonas permitidas de 
Ramachandran y los que recaen fuera de esta para aproximar un valor de resolución 
cristalográfica en la cual se esperarían ver estos puntajes. Es decir, el MolProbity score es la 
resolución a la cual se esperaría encontrar una estructura con las características de distribución 
angular de los residuos que presenta el modelo evaluado, por lo cual, mientras más próximo a 0 
se encuentre el score, mejor calidad estructural presentará el modelo. 
VIII.III Estudio bioinformático ………………………… ……………………………………