Localizacion-celular-de-los-receptores-[alfa]1-adrenergicos-en-celulas-de-musculo-liso-vascular

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA 
 
 
 
 
LOCALIZACIÓN CELULAR DE LOS RECEPTORES 
α1 ADRENÉRGICOS EN CÉLULAS DE MÚSCULO 
LISO VASCULAR 
 
 
 TESIS 
QUE PARA OBTENER EL TITULO 
BIOLOGA 
Presenta 
Victoria Domínguez Catzín 
 
 Asesor: Dr. Francisco Gabriel Vázquez Cuevas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
Agradecemos infinitamente la colaboración de: 
 
Dr. Rafael Villalobos Molina. Unidad de Biomedicina FES-Iztacala. 
 
Dra. Norma Laura Delgado Buenrostro. Microscopía Confocal de la 
Unidad de Biomedicina FES-Iztacala. 
 
MVZ. Leticia Flores Sánchez. Responsable Bioterio FES-Iztacala. 
 
Por apoyo incondicional en la realización de este trabajo. 
 
 
 
Y a mis sinodales: 
 
Dr. Francisco Gabriel Vázquez Cuevas. 
 
Dr. Rafael Villalobos Molina. 
 
Dr. Jaime Aurelio Barral Caballero. 
 
M. en C. María Eugenia Heres Pulido. 
 
M. en C. Irma Elena Dueñas García. 
 
 
Por su apoyo y por el enriquecimiento de este trabajo. 
 
 
 
Trabajo apoyado por CONACYT 47481, Fundación Miguel Alemán, 
A.C. y PAPIIT IN 203205. VDC fue becaria por PAPIIT IN 203205. 
 
 
ÍNDICE GENERAL 
 
Resumen 
 
 
1
Introducción 
 
 
2
Antecedentes 
 
 
15
Hipótesis 
 
 
17
Objetivos 
 
 
17
Planteamiento Experimental 
 
 
18
Materiales y Métodos 
 
 
19
Resultados 
 
 
22
Análisis y Discusión 
 
 
44
Conclusiones 
 
 
47
Perspectivas 
 
 
48
Bibliografía 
 
 
49
 
RESUMEN 
 
Los α1-adrenoreceptores (α1-AR) son proteínas de la membrana celular 
pertenecientes a la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). 
Se dividen en tres subtipos α1A, α1B y α1D. El mecanismo de transducción de señales 
en estos receptores consiste en el acoplamiento a proteínas G heterotriméricas. En 
el sistema cardiovascular, juegan un papel muy importante en la regulación de la 
contracción de músculo liso vascular, y por ende en la regulación de la presión 
arterial. 
Estudios de nuestro laboratorio han demostrado la participación de los α1-AR en la 
regulación de la contractilidad arterial. Actualmente es de nuestro interés llevar a 
cabo estudios a nivel celular. Por lo tanto los objetivos del proyecto fueron: generar 
anticuerpos policlonales y caracterizar la localización de los subtipos de receptores 
adrenérgicos en células de músculo liso vascular intactas. El primer paso del 
proyecto fue la generación de anticuerpos policlonales, para ello se obtuvieron las 
secuencias de los tres subtipos de los α1-AR en (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para 
el diseño de péptidos sintéticos. Los anticuerpos se generaron en conejos. Además, 
se generó una construcción GST-α1D para el receptor α1D. Se extrajeron arterias 
aorta de ratas adultas Wistar (W) y se obtuvieron células musculares para los 
cultivos primarios. Se obtuvo el antisuero de conejos inmunizados con los péptidos 
correspondientes a los receptores adrenérgicos α1A , α1B o α1D y se probó por 
inmunodetección de proteínas (Western-Blot) contra homogenizados de cerebro, 
hígado, riñón y aorta de rata. En estos ensayos se observaron bandas de ≈60 kDa 
para el α1A-AR; ≈85 kDa para el α1b-AR y ≈70 kDa para el α1D-AR. En todos los 
casos hay concordancia con reportes previos. Los tres receptores pueden 
detectarse en homogenizados de aorta. 
En los ensayos de inmunofluorescencia observamos que el α1A-AR y el α1B-AR se 
localizan cercanos al núcleo y en mayor cantidad en la membrana plasmática; el 
α1D-AR es perinuclear y además se localiza en membrana celular. Estos ensayos se 
realizaron por inmunohistoquímica y fueron analizados por microscopía confocal. 
 
 
INTRODUCCIÓN 
Presión Arterial 
La presión arterial es la fuerza que ejerce la sangre sobre las paredes de las 
arterias. Esta fuerza es de gran importancia para lograr que la sangre circule a 
través de todo el organismo y lleve los nutrientes y oxígeno a los tejidos, así como 
también para que las sustancias de desecho sean eliminadas. Existen dos fuerzas 
que de manera directa influyen en la presión arterial: la primera es la que ejerce el 
corazón al contraerse y bombear sangre hacia la arteria aorta y se define como 
presión sistólica; la segunda es resultado de la elasticidad de las arterias grandes 
(en especial la aorta y sus ramificaciones) que inicialmente se dilatan para contener 
la sangre que se expulsa del corazón y después regresan a su forma normal, 
generando esta segunda presión, la diastólica (Figura 1). 
Se sabe que las dos alteraciones características de la pared vascular en la 
hipertensión arterial (HTA), son la disfunción endotelial y la hipertrofia de las células 
musculares lisas vasculares. La disfunción endotelial ha sido bien documentada en 
la circulación periférica, en la macrocirculación y microcirculación coronarias y en la 
circulación renal. Las células endoteliales producen y liberan sustancias 
vasodilatadoras y vasoconstrictoras. Entre las vasodilatadoras figuran el óxido 
nítrico (NO), el factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF) y la 
prostaciclina. Entre las vasoconstrictoras están las endotelinas y el tromboxano A2 
(Nava, 2002). 
 
Fig 1. El calibre de las arterias se regula por el grado de contracción del músculo de la capa 
media, si la arteria está dilatada mejora el flujo y disminuye la presión arterial (izquierda); y 
si está contraída disminuye el flujo y aumenta la presión arterial (derecha). 
Además existen numerosos estudios que demuestran que la hipertensión arterial 
está estrechamente relacionada con el sistema renina - angiotensina y la disfunción 
renal no definida. 
Sistema Renina-Angiotensina 
 
Entre los mecanismos que regulan la presión arterial sistémica se encuentra el 
Sistema Renina - Angiotensina (SRA) (figura. 2), que desempeña un papel muy 
importante, siendo la angiotensina II (Ang II) la principal responsable de los efectos 
cardiovasculares. La actividad del SRA comienza con la liberación de renina desde 
el aparato yuxtaglomerular, ésta actúa sobre el angiotensinógeno, que es una alfa 
globulina sintetizada en hígado. En una reacción de hidrólisis separa al decapéptido 
amino terminal del angiotensinógeno. Este oligopéptido es la Angiotensina I que al 
metabolizarse origina a la Angiotensina II, una hormona con actividad biológica. Este 
octapéptido tiene una vida media muy breve y da origen a la Angiotensina III 
(Sánchez, 2003). 
 
La Angiotensina II tiene un efecto vasoconstrictor en la circulación, además de 
participar en mecanismos de reabsorción y excreción de sodio. El sistema Renina – 
Angiotensina se encuentra vinculado a través de la Enzima Convertidora de 
Angiotensina (ECA) con el sistema de las calicreinas – quininas. Esta enzima 
inactiva a las quininas mientras transforma la Angiotensina I en II (Sánchez, 2003). 
 
Fig 2. Esquema del Sistema Renina-Angiotensina (SRA). 
 
Otros componentes que regulan la presión arterial 
 
Además del sistema renina-angiotensina existen otros componentes que participan 
en la regulación de la presión arterial. Uno de los más importantes es el sistema 
nervioso autónomo o periférico, constituidopor nervios, ganglios y plexos, que 
Angiotensinógeno Quininógeno 
Angiotensina I
Renina 
Angiotensina II
Enzima 
Convertidora 
de 
angiotensina 
Bradiquininas 
Productos de 
degradación 
Calicreínas
Prostaglandinas
 F2 y E 
+ 
inervan al corazón, los vasos sanguíneos y otros órganos. Se le ha llamado 
autónomo porque regula funciones sin control de la conciencia. 
 
De manera esquemática, una proyección nerviosa llega hasta sus células blanco 
formando un sistema denominado sinapsis, que comprende una terminal 
presináptica (en la célula nerviosa donde los neurotransmisores se encuentran 
almacenados en vesículas), un espacio sináptico y una terminal postsináptica, esta 
última en la célula blanco donde existen receptores para los neurotransmisores. 
 
En el sistema nervioso autónomo existen moléculas transmisoras primarias, 
acetilcolina o noradrenalina, liberadas desde sus sinapsis terminales: gran cantidad 
de fibras periféricas sintetizan y liberan acetilcolina y son denominadas colinérgicas; 
por otra parte las fibras posganglionares simpáticas liberan noradrenalina, es decir, 
son adrenérgicas. Las neuronas adrenérgicas también transportan una molécula 
precursora al interior de la terminación nerviosa, después sintetizan el transmisor y 
por último, lo almacenan en vesículas. 
 
La terminación de la transmisión adrenérgica es resultado de varios procesos, 
incluyendo difusión simple a partir del sitio receptor y recaptación al interior de la 
terminal nerviosa o en células de músculo liso (Bertram et al.,2001). Los diversos 
neurotransmisores liberados por el sistema nervioso simpático, las catecolaminas 
adrenalina y noradrenalina, la acetilcolina, y diversos péptidos transmisores, actúan 
mediante la activación de receptores (proteínas de membrana que reconocen 
específicamente a mensajeros extracelulares) (Goodman et al., 2003). 
 
Otros factores que regulan la presión arterial son los factores hemodinámicos como 
el tono de la pared muscular de venas y arterias y algunas hormonas 
(corticoadrenales) tales como cortisol, vasopresina, aldosterona, hormona del 
crecimiento, y factores depresores como el sistema Kalicreina-Kinina y 
Prostaglandinas (González, 2004). 
 
 
 
Estructura de los vasos sanguíneos 
El aparato circulatorio se compone del sistema de vasos sanguíneos y de vasos 
linfáticos. Los vasos sanguíneos pueden ser de tres tipos: A) Arterias, que llevan la 
sangre oxigenada desde el corazón a los órganos, transportando el oxígeno y los 
nutrientes, B) Venas, las cuales llevan la sangre desde los órganos y los tejidos 
hasta el corazón y desde éste a los pulmones, donde se intercambia el dióxido de 
carbono con el oxígeno del aire inspirado, esta sangre se denomina venosa y C) 
Capilares, que tienen su origen en la división progresiva de las arterias en ramas 
cada vez más pequeñas hasta llegar a los vasos capilares, que poseen paredes 
muy finas a través de los cuales pasan las células sanguíneas con los gases 
respiratorios, los nutrientes y el resto de las sustancias que transporta la sangre. 
 
En la estructura de estos vasos se han descrito tres tejidos básicos (Figura. 3): 
túnica íntima (TI), que es la capa interna, formada por un endotelio, su lámina basal 
y tejido conectivo subendotelial. La túnica media (TM), que es una capa formada por 
capas concéntricas de células de músculo liso entre las cuales se interponen 
cantidades variables de elastina, fibras reticulares y proteoglicanos, que en las 
arterias está bastante más desarrollada que en las venas y que prácticamente no 
existe en los capilares. Finalmente la túnica adventicia (TA), es la capa externa 
compuesta por tejido conectivo con abundantes fibras de colágena; varía de espesor 
desde relativamente fino en la mayor parte del sistema arterial hasta bastante 
grueso en las vénulas y venas, donde representa el principal componente de la 
pared del vaso. En particular, las arterias son los vasos que tienen la pared más 
gruesa, formada por las tres capas (Geneser, 2000). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig 3. Fotomicrografía de un corte transversal de la pared de la arteria aorta de humano, 
teñido con hematoxilina-eosina, el aumento es 65X. Pueden observarse la túnica íntima (TI), 
túnica media (TM) y túnica adventícia (TA); tomado de Geneser, 2000. 
Músculo visceral o liso 
Está formado por la asociación de células largas que pueden medir de 5 a 10 µm de 
diámetro por 80 a 200 µm. de largo. Están generalmente dispuestas en capas sobre 
todo en las paredes de los órganos huecos, como el tubo digestivo o vasos 
sanguíneos. 
TI 
 
 
 
 
 
 
 
TM 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TA 
En un corte transversal el músculo liso se presenta como un aglomerado de 
estructuras circulares o poligonales, que pueden ocasionalmente presentar un 
núcleo central. En corte longitudinal se distingue una capa de células fusiformes 
paralelas (Geneser, 2000). 
Catecolaminas 
 
Las catecolaminas, secretadas por el sistema nervioso simpático y la médula 
suprarrenal, participan en la regulación de varias funciones, en particular integran 
las reacciones de diversos tipos de estrés o tensión. Una gran variedad de agentes 
terapéuticos de utilidad clínica general afectan al sistema nervioso simpático o 
interactúan con receptores adrenérgicos, con lo cual es posible estimular o inhibir 
los efectos fisiológicos mediados por las catecolaminas, con algún grado de 
especificidad. Las catecolaminas influyen sobre las células efectoras al interactuar 
con sitios específicos de reconocimiento o receptores localizados en la membrana 
celular. Cuando los receptores adrenérgicos son estimulados por las catecolaminas, 
se inicia una serie de cambios en la membrana, seguidos de una cadena de 
procesos intracelulares que culminan en una respuesta celular (Harrison, 2001). 
 
Como ya se mencionó, la noradrenalina es el principal neurotransmisor en el 
sistema nervioso simpático periférico; en tanto que la adrenalina es el producto 
primario de la secreción hormonal de la médula suprarrenal. Como las funciones 
mediadas por el sistema nervioso simpático son diversas, los fármacos que imitan, 
alteran o antagonizan sus actividades son útiles en el tratamiento de muchos 
trastornos clínicos, entre ellos la hipertensión, choque cardiovascular, arritmia, 
asma, etc. Aunque los efectos de estas dos catecolaminas son muy semejantes en 
algunos sitios, difieren en grado importante en otros. Por ejemplo, ambos 
compuestos estimulan el miocardio, la adrenalina dilata los vasos sanguíneos que 
llegan al músculo estriado, en tanto que la noradrenalina produce constricción de los 
vasos sanguíneos. 
 
La adrenalina, también llamada epinefrina, es una hormona vasoactiva secretada en 
situaciones de alerta por las glándulas suprarrenales. Es una monoamina derivada 
de los aminoácidos fenilalanina y tirosina (figura. 4) (Goodman-Hofman, 2003). 
 
 
Fig 4. Síntesis de catecolaminas. Esta síntesis se realiza en algunas zonas de la médula 
suprarrenal y el encéfalo. El paso que limita la velocidad en la síntesis de adrenalina es la 
conversión de tirosina en dopa, el cual llega a ser inhibido por el análogo de la tirosina 
denominado metirosina. 
 
Es un vasoconstrictor y estimulante cardiaco muy potente. El aumento en la presión 
arterial sistólica que se produce después de la liberación o administración de la 
adrenalina se debe a sus acciones ionotrópica y cronotrópicas positivas sobre el 
corazón (predominantemente receptores β) y la vasoconstricción inducida en 
muchos lechos vasculares (receptores α). 
 
La noradrenalina (también conocida como norepinefrina) es el principal mediador 
químico liberado por los nervios adrenérgicos posganglionares. La noradrenalina es 
un agonista potente al nivel de los receptores α y tieneefectos similares que la 
adrenalina sobre los receptores β1 en el corazón y potencia similar en los receptores 
α. La noradrenalina aumenta la resistencia periférica y la presión arterial sistólica y 
diastólica (Katzung, 2002). 
Tirosina 
Hidroxilasa 
Dopa 
descarboxilasa 
Dopa β -
hidroxilasa 
Feniletanolamina 
N-metiltransferasa 
 
 
Clasificación de los receptores adrenérgicos 
 
Para comprender los diversos efectos de estas catecolaminas que afectan a los 
receptores adrenérgicos debemos conocer la clasificación y propiedades de los 
receptores adrenérgicos. Aunque relacionados desde el punto de vista estructural, 
los receptores adrenérgicos regulan diversos procesos fisiológicos al controlar la 
síntesis o liberación de diferentes segundos mensajeros (Goodman-Hofmann, 
2003). 
 
Su clasificación en α y β surgió por primera vez de manera indirecta estudiando 
propiedades de la adrenalina y noradrenalina: se sabía que estos fármacos podían 
producir relajación o contracción del músculo liso según el sitio, la dosis y el agente 
elegido, por ejemplo la noradrenalina ejerce efectos excitadores en músculo liso, y la 
adrenalina puede funcionar como excitador y como inhibidor. Ahlquist (1948) 
propuso las designaciones de α y β para receptores ubicados en músculo liso. 
 
Esta primera clasificación se corroboró al identificar algunos antagonistas selectivos 
a nivel α-adrenérgico, en tanto que otros producen bloqueo β-adrenérgico selectivo 
(Goodman, 2003). Actualmente se clasifica a los receptores adrenérgicos en tres 
grupos principales denominados β, α1 y α2. Cada familia contiene tres o más 
subtipos y todos pertenecen a la familia de receptores acoplados a proteínas G. En 
el caso de la familia α1 esta se subdivide en tres α1A, α1B, y α1D, los cuales se 
encuentran acoplados a proteínas Gq 11; los receptores α2 se subdividen en α2A αB αC 
y se encuentran acoplados a proteínas Gi ;por último los receptores β se subdividen 
en β1, β2 y β3 acoplados estos a proteínas Gs. 
 
Los α1-adrenoreceptores (α1-AR) 
Los α1-adrenoreceptores (α1-AR) son proteínas de la membrana celular 
pertenecientes a la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Se 
dividen en tres subtipos α1A, α1B y α1D. 
 
Esta clase de receptores muestra una arquitectura característica, sobresaliendo la 
presencia de siete regiones hidrofóbicas que constituyen estructuralmente regiones 
transmembranales de 20 a 28 aminoácidos. Dado que la totalidad del receptor está 
formada por una sola cadena polipeptídica, los siete pases transmembranales 
forman tres asas extracelulares y tres intracelulares, el extremo amino terminal se 
localiza del lado extracelular y el carboxilo hacia la cara citosólica de la membrana 
(Figura.5). Las primera y segunda asas extracelulares contienen residuos de 
cisteina que forman enlaces disulfuro. 
 
Las regiones próximas a la membrana de la segunda y tercer asa intracelular están 
implicadas en el acoplamiento de la proteína G (García-Sáinz y Villalobos-Molina, 
2004). Existen diferencias marcadas en la longitud del amino terminal extracelular 
entre los tres subtipos del receptor, por ejemplo, el extremo amino del α1D es mucho 
más largo (aprox. 90 a.a.) que el α1A (25 a.a.) y el α1B -AR (42 a.a.). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Fig 5. Estructura de los receptores α1-AR. Proteínas de siete pases transmembranales 
en la membrana plasmática, su extremo carboxilo en el interior de la célula y su amino 
terminal extracelular. 
 
El mecanismo de transducción de señales utilizado por estos receptores consiste en 
el acoplamiento con proteínas G heterotriméricas que interaccionan con efectores 
específicos y como consecuencia se producen segundos mensajeros (Figura. 6.). 
Las proteínas G son una familia de proteínas formadas por las subunidades alfa (α), 
beta (β) y gama (γ). La subunidad α en su estado inactivo tiene unido un nucleótido 
de guanidina (GDP), y en su estado activo el GDP se recambia por GTP, y es por 
ello que reciben su denominación característica. 
 
Los α1-adrenorreceptores al ser activados por su ligando se acoplan y activan a una 
proteína Gα del tipo que regula de manera positiva a la fosfolipasa C, la cual 
hidroliza al fosfolípido de membrana fosfatidil inositol difosfato (PIP2), generando 
dos moléculas: el inositol trifosfato (IP3) y el diacilglicerol (DAG). El IP3 actúa sobre 
su receptor localizado en el retículo sarcoplásmico liberando Ca2+ hacia el 
citoplasma (Minneman, 1988; Hieble et. al., 1995); y el DAG activa a la proteína 
cinasa C (PKC). 
I 1 
I 2 
I 3 
 
NH2
COOH 
Intracelular 
Extracelular 
9 
9 
τ 
λ λ 
E 1 E 2 E 3 
Membrana 
plasmática 
 
 
 
Fig 6. Vía de señalización de los adrenoreceptores α1. 
Papel Fisiológico de los receptores α1 adrenérgicos 
 
Los α1-AR se localizan en sistema cardiovascular, genitourinario y sistema nervioso 
central, juegan un papel muy importante en la regulación de varios procesos 
fisiológicos, contracción de músculo liso, presión arterial, frecuencia cardiaca, etc. 
Se ha observado que estos receptores regulan la contracción de algunos órganos 
aislados y que regulan también el tono vascular en ensayos in vivo, por ejemplo, en 
ratas descerebradas y desmeduladas (Ibarra et al., 1997). 
 
Utilizando ensayos in vitro para cada uno de los tres subtipos de α1-AR, se observa 
una predominancia en la contracción de músculo liso vascular (Piascik et al., 1995; 
Villalobos-Molina et al., 1997). Estos datos sugieren que in vivo estos receptores 
juegan un importante papel en el mantenimiento de la presión arterial. 
α
PIP2 
IP3 
DAG
(+)
PKC
(+)
COOH 
NH2 Estímulo 
Membrana celular 
β
γ
PLC- β 
Ca2+ 
Ca2+
Planteamiento Experimental 
 
1.- Generación de anticuerpos policlonales contra los receptores α1-adrenérgicos, 
diseñando péptidos sintéticos 
Para este fin se obtuvieron las secuencias de cada uno de los receptores y se 
analizaron con diversas herramientas de bioinformática, como se describe en 
materiales y métodos. Finalmente se obtuvieron secuencias específicas para cada 
receptor, que no presentan similitud con algún receptor de la familia ni con alguna 
proteína conocida. 
 
2.- Caracterización de los antisueros utilizados 
Una vez obtenidas las secuencias, los péptidos se sintetizaron en una compañía 
que provee este servicio y se inmunizaron conejos para obtener los antisueros. 
Estos se probaron en ensayos de Western blot contra homogenados de diferentes 
tejidos de rata. 
 
3.- Localización y distribución de los tres subtipos de α1-AR en cultivos primarios de 
células de aorta torácica de ratas. 
Para determinar la distribución y localización de los tres subtipos de los α1-AR se 
realizaron cultivos primarios de células de aorta de ratas Wistar (W) adultas 
intactas, estos cultivos se analizaron con inmunofluorescencia utilizando 
microscopía confocal. 
 
Antecedentes 
 
Estamos interesados en estudiar los mecanismos celulares involucrados en la 
hipertensión que es el aumento en forma crónica de la presión arterial. 
 
Varios reportes demuestran la importancia de los receptores α1-adrenérgicos en el 
proceso hipertensivo; por ejemplo, utilizando la técnica de microarreglos de cDNA, 
se ha estudiado en músculo liso vascular la expresión de genes mediados por la 
estimulación de los α1-AR. Los genes que cambian su nivel de expresión codifican 
para proteínas involucradas en diversos aspectos de la fisiología celular (Wang, et 
al, 2004). Por otra parte, se ha observado que los α1D-AR se encargan de mediar la 
contracción de las arterias aorta, carótida y mesentéricas de ratas adultas 
espontáneamente hipertensas. 
 
 Los datos farmacológicos que soportan esta idea indican que aunque se expresan 
los tres subtipos de adrenoreceptors α1 en dichas arterias, los α1D son 
funcionalmente más relevantes (Villalobos-Molinae Ibarra, 1996). Además, se ha 
descrito que la contractilidad arterial en respuesta a agonistas selectivos de los 
receptores α1D-AR, es baja en la vasculatura de ratas prehipertensas y aumenta 
drásticamente cuando ya la hipertensión se ha establecido, estas obsevaciones 
sugieren un papel en la génesis de la hipertensión (Villalobos-Molina e Ibarra 1999). 
 
Por otra parte, utilizando anticuerpos neutralizantes se ha observado que al inhibir 
los α1A-AR en tejido renal y los α1D-AR en arterias femorales, se reduce 
considerablemente la contractilidad en respuesta a agonistas adrenérgicos 
(Hrometz et al., 1999). Estudios utilizando un ratón “knockout” para el α1D-AR han 
demostrado que este receptor regula directamente la presión arterial, al mediar 
importantes efectos de vasoconstricción (Tanoue et al., 2002). Además, se ha 
reportado que el receptor α1D-AR tiene un papel importante en el control de la 
presión sanguínea, así como en respuestas presoras in vivo (Bylund et al., 1994; 
Hieble et al., 1995). 
 
En estudios previos se ha analizado la localización celular de los α1-AR en la arteria 
basilar de rata, demostrando que estos receptores se encuentran en el citoplasma 
muy cerca de la membrana nuclear, lo cual puede traer complicaciones para 
entender su modo de acción (McGrath et al., 1999). El análisis en modelos in vitro, 
ha generado observaciones que confirman esta distribución, por ejemplo en 
fibroblastos transfectados se ha descrito que el adrenoreceptor α1D se distribuye en 
la región citosólica, cerca de la membrana plasmática (Daly et. al., 1998). 
 
Por otra parte, la expresión exógena de los receptores α1A y α1B adrenérgicos, en 
células COS-7, mostró que el α1A-AR se localiza predominantemente en citoplasma 
celular, mientras que el α1B-AR se localiza en membrana celular (Hirasawa et al., 
1997; Sugawara et al., 2002). 
 
De los anteriores datos podemos elaborar una pregunta específica: ¿Por qué un 
receptor que está distribuido principalmente en el citosol resulta relevante en la 
fisiología cardiovascular? 
 
Recientemente se ha demostrado in vitro que los adrenoreceptores α1D pueden 
dimerizarse con otros receptores, particularmente con los adrenoreceptores α1B o β2, 
modificando su distribución, específicamente cualquiera de estas dos asociaciones 
incrementa la expresión del α1D-AR en la membrana celular (Finch, et al., 2005). 
Esta posible dimerización podría significar una nueva entidad funcional. Además 
explicaría por qué en muchas ocasiones es indetectable farmacológicamente en 
tejidos silvestres aislados (Hague, et al., 2004; Hague, et al., 2006). 
 
Todos estos datos ponen en evidencia la importancia de α1-AR en la hipertensión. 
En particular consideramos la importancia de un estudio de localización a nivel 
subcelular. En el presente trabajo se ha iniciado el abordaje de este tópico en un 
modelo fisiológico. En particular se han desarrollado las herramientas y los métodos 
específicos que son indispensables para estos estudios. 
 
 
 
Hipótesis 
 
Cada subtipo de los receptores adrenérgicos α1 contribuye de manera diferente a la 
regulación de la contracción vascular, por tanto, presentan diferente distribución 
celular. 
 
 
Objetivo General 
 
Explorar la localización celular de los receptores α1 adrenérgicos en cultivo primario 
de células de músculo liso vascular de la arteria aorta torácica. 
 
Objetivos Particulares 
 
• Generar anticuerpos policlonales contra los receptores de la familia α1-AR 
diseñando péptidos sintéticos y proteínas recombinantes. 
• Analizar las secuencias y obtener los péptidos que permitan generar 
anticuerpos específicos para cada subtipo. 
• Analizar en las bases de datos (NCBI, Swiss-prot) que los péptidos 
seleccionados sean exclusivos para los receptores y mutuamente 
excluyentes. 
• Obtener y probar los antisueros en ensayos Western Blot. 
• Describir la distribución celular de los tres subtipos de adrenoreceptores en 
células de músculo liso vascular intactas. 
 
 
Materiales y Métodos 
 
Generación de anticuerpos policlonales 
Para obtener anticuerpos contra cada uno de los subtipos de receptores α1-
adrenérgicos se realizó la búsqueda de las secuencias de cada proteína, en la base 
de datos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Para las especies Rattus 
norvegicus (rata) y Mus musculus (ratón), pues deseábamos obtener secuencias 
conservadas entre ambas especies. 
 
Estas secuencias fueron alineadas utilizando el algoritmo de Clustal Wallis 
(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) y se eligieron péptidos localizados en regiones no 
transmembranales, de acuerdo con la información obtenida de la base de datos de 
SWISS PROT (www.ebi.ac.uk/swissprot/), con el objetivo de que los péptidos no 
resultaran hidrofóbicos e insolubles en medio acuoso. Las secuencias de los 
péptidos obtenidos se analizaron en el programa BLAST 
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi), para asegurarnos que no 
presentaron una similitud elevada con alguna proteína conocida en mamíferos. Se 
tuvo especial cuidado en que dichas secuencias no existieran en otros receptores de 
la familia. 
 
Los péptidos fueron sintetizados y conjugados con la proteína “Keyhole Limpet 
Hemocyanin” (KLH), para aumentar su inmunogenicidad, por un laboratorio 
comercial (SIGMA, USA). Con estos péptidos (1 mg/kg de peso) se inmunizaron 
conejos cada 14 días durante 6 semanas. El antisuero se probó por Western Blot. 
 
Inmunización de conejos 
 
Se utilizaron conejos adultos de la cepa Nueva Zelanda, previo a la inmunización se 
realizó una sangría para la obtención de suero preinmune. Posteriormente se realizó 
el protocolo de inmunización siguiente: El péptido purificado (1 mg/kgpeso) se 
emulsificó con un volumen de adyuvante de Freund completo, en periodos de tres 
semanas se realizaron las inmunizaciones complementarias; para este fin el 
inmunógeno se preparó con adyuvante de Freund incompleto. 
 
Tres semanas después de la última inmunización se obtuvo el suero inmune de 
cada conejo, el cual fue estabilizado con 0.01% de azida de sodio. La especificidad 
de los antisueros fue determinada por comparación entre células transfectadas y 
homogenizados de riñón, aorta, cerebro e hígado de ratas Wistar machos de 12 
semanas. Estos ensayos se realizaron por Western blot en ratas Wistar machos de 
≈12 semanas. 
 
Western Blot 
 
Las proteínas de los homogenados (50 µg/carril) se obtuvieron mecánicamente con 
un homogenizador, en buffer RIPA: 10 mM Tris-HCl pH 7.4, EDTA 1 mM, NaCl 150 
mM, Triton 0.1 %, SDS 0.1% y Mini Complete (mezcla de inhibidores de proteasas) 
(Roche). La concentración total de proteína de los extractos se determinó mediante 
ensayo de Lowry. Las muestras para la electroforesis se diluyeron en un volumen de 
buffer Laemlli 2X, se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida al 10% 
en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Los geles fueron transferidos a 
membranas de PVDF, utilizando el sistema de transferencia semi seca Trans-Blot ® 
SD (BIO RAD). La transferencia se realizó por 1 hr a 15V fijos y corriente abierta. 
Las membranas se bloquearon durante 1 hr a temperatura ambiente, en una 
solución : 20 mM Tris, pH 7.4, 0.1% Tween 20 (TBS-T) que contiene 5% de leche 
deshidratada, se lavaron en TBS-T y se incubaron con el anticuerpo primario (suero 
de conejo anti-α1A-AR, α1B-AR o α1D-AR) toda la noche a 4°C en una dilución 
1:3000. Después las membranas se lavaron con TBS-T y se incubaron 1 hr a 
temperatura ambiente con el anticuerpo secundario suero de cabra anti conejo 
conjugado con HRP (Zymed) en TBS-T con 5% de leche deshidratada con una 
dilución 1:10000. Después de lavarse, las membranas fueron reveladas por 
autoradiografía utilizando un sustrato quimioluminiscente. 
 
Obtención de proteína Recombinante. 
 
Se obtuvo la construcción de una proteína de fusión conla glutatión-S-transferasa, 
la cual se utilizaría como inmunógeno. Ésta se obtuvo por la inserción de un 
fragmento de la secuencia codificante del receptor α1D que corresponde a la región 
carboxilo en el vector pGEX4T. El segmento insertado fue amplificado por PCR, 
utilizando como templado la secuencia completa del cDNA (Graham, 1998), y 
oligonucleótidos específicos que contienen los sitios de restricción EcoRI y BAMHI, 
que permitieron subclonar el fragmento en el plásmido pGEX4T. Una vez obtenida 
la construcción GST-α1D AR, se transformó en bacterias E. coli de la cepa JM103. 
 
Cultivo de células de músculo liso vascular. 
 
Se extrajeron arterias aortas torácicas de ratas adultas Wistar (W) (de acuerdo con 
métodos previamente publicados por (Zhuo-Wei et al., 1995; Faber et al., 2001)) . El 
endotelio se retiró manualmente y se realizó un tratamiento con colagenasa II (1 
mg/ml) durante 10 min. para retirar la capa adventicia. Las células de la capa 
muscular se disgregaron por digestión enzimática con una mezcla de colagenasa II-
elastasa (5 mg/ml-0.05 mg/ml); se cultivaron en medio ISCOVES con 5% de suero 
bovino fetal y antibiótico-antimicótico (GIBCO ®) 1X en una atmósfera humidificada 
de 95% aire y 5% CO2 a 37 °C. Se mantuvieron en cultivo durante ≈ 5 días. 
 
Ensayos de Inmunohistoquímica. 
 
De cultivos al 80% de confluencia, se fijan las células durante 1hr. en formaldehído 
al 3% en una solución buffer de PBS 1X (NaCl 0.14M, KCl 0.3mM, Na2HPO4 0.01M, 
KH2PO4 0.2mM) pH 7.4, se realizaron 3 lavados en buffer PBS 1X y se neutralizaron 
con NH4Cl2 durante 10 min. Posteriormente, se permeabilizaron con tritón 1%, se 
realizaron 3 lavados en Buffer PBS 1X y se realizó el bloqueo doble con un buffer 
PBS 1X , suero bovino 5%, tritón 1% durante 1hr y una solución de albúmina- PBS 
al 1% durante 1hr. Después del bloqueo se agregó el primer anticuerpo (1:500) para 
el receptor α1A AR y el α1B AR y (1:200) para el α1D AR en solución de bloqueo, se 
dejó incubando toda la noche a 4º C. 
 
A continuación, las preparaciones se lavaron con PBS 1X y se marcó con el 
anticuerpo secundario 1:200 (anti-IgG de conejo acoplado a fluoresceína), 
incubando durante 2 hrs en completa oscuridad, se realizaron nuevamente tres 
lavados con Buffer PBS 1X y dos lavados con PBS-tritón 1%. Finalmente, se 
marcaron con un tercer anticuerpo acoplado a rodamina (anti-actina), incubando a 
temperatura ambiente durante 20 minutos. Se realizaron de la misma forma los 
lavados en PBS 1X y PBS-Tritón 1%. Las preparaciones se montaron sobre 
portaobjetos de cristal para microscopía en un resina ENTELLAN y se guardaron en 
oscuridad a 4°C. Las células marcadas se observaron en un microscopio confocal 
(Leica ®). 
 
Resultados 
 
Generación de anticuerpos policlonales 
El primer paso para desarrollar los anticuerpos fue definir una región apropiada; esta 
debería ser citoplásmica o extracelular, pues la hidrofobicidad de las regiones 
transmembranales afectaría la solubilidad en un medio acuoso. Con este fin 
localizamos las secuencias de estas proteínas en la base SWISS-PROT y 
empleamos la predicción estructural que esta base de datos contiene (Tabla 1). 
 
Con esta información elegimos regiones hidrofílicas, que se encuentran en zonas no 
conservadas. Para los subtipos α1B-AR y α1D-AR se escogieron secuencias que 
corresponden a una sección del carboxilo terminal; en el caso del α1A –AR se 
seleccionó una secuencia que corresponde a una zona del amino terminal. 
 
 Rattus norvegicus Mus musculus 
 NCBI SWISSPROT NCBI SWISSPROT 
α1A-AR 017191 P43140 038489 P97718 
α1B-AR 016991 P15823 031442 P97717 
α1D-AR 024483 P23944 038488 P97714 
Tabla 1. Número de acceso de la base de datos de SWIIS-PROT y del NCBI utilizadas para 
el diseño de péptidos inmunogénicos. 
 
 
Se realizó un alineamiento entre especies por el algoritmo de Clustal Wallis 
(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) para determinar que las secuencias elegidas fueran 
idénticas para rata y ratón (Figura. 7). 
 
 
 
 
 
 Alineamiento rata vs ratón del receptor α1A-AR. 
 
 AA1araton 
MVLLSENASEGSNCTHPPAQVNISKAILLGVILGGLIIFGVLGNILVILSVACHRHLHSV 60 
 AA1arata 
MVLLSENASEGSNCTHPPAPVNISKAILLGVILGGLIILGVLGNILVILSVACHRHLHSV 60 
 ******************* ******************:**************** 
 
 A1araton 
THYYIVNLAVADLLLTSTVLPFSAIFEILGYWAFGRVFCNIWAAVDVLCCTASIMGLCII 120 
 A1arata 
THYYIVGLAVADLLLTSTVLPFSAIFEILGYWAFGRVFCNIWAAVDVLCCTASIMGLCII 120 
 
******.***************************************************** 
 Alineamiento rata vs ratón del receptor α1B-AR. 
 
 A1brata 
SASPSPGYLGRGTQPPVELCAFPEWKPGALLSLPEPPGRRGRLDSGPLFTFKLLGDPESP 480 
 A1braton 
SASPSPGYLGRGTQPPVELCAFPEWKPGALLSLPEPPGRRGRLDSGPLFTFKLLGEPESP 479 
 
*******************************************************:**** 
 
 A1brata GTEGDTSNGGCDTTTDLANGQPGFKSNMPLAPGHF 515 
 A1braton GTEGDASNGGCDTTTDLANGQPGFKSNMPLAPGHF 514 
 *****:***************************** 
 
 Alineamiento rata vs ratón del receptor α1D-AR. 
 
 A1draton SLRLREWRLLGPLQRPTTQLRAKVSSLSHKFRSGGARRAETACALRSEVEAVSLNVPQDG 540 
 A1drata ASALREWRLLGPLQRPTTQLRAKVSSLSHKIRSG-ARRAETACALRSEVEAVSLNVPQDG 539 
 : ***************************:*** ************************* 
 
 A1draton AEAVICQAYEPGDLSNLRETDI 562 
 A1drata AEAVICQAYEPGDYSNLRETDI 561 
 ************* ******** 
 
Fig 7. Alineamientos entre las especies Rattus norvegicus y Mus musculus para cada 
subtipo de receptor adrenérgico α1, como se puede observar las secuencias elegidas son 
idénticas entre ambas especies. 
 
Una vez que se obtuvo el alineamiento entre especies se realizó un análisis de 
búsqueda de secuencias similares en el programa BLAST 
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi), en este caso, la secuencia de interés 
es comparada con una base de datos donde se incluye todas las proteínas 
conocidas 
Este tipo de análisis permite predecir si el inmunógeno reconocerá alguna secuencia 
similar en otra proteína. Así mismo, permite pronosticar si existirá reconocimiento 
cruzado entre receptores de la misma familia. A continuación se presenta un 
ejemplo del análisis del BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 
(Figuras 8 y 9). 
 
 
 
Fig. 8. Imagen de la página en línea del programa BLAST donde se obtiene un análisis de 
similitud de secuencias. Como puede observarse el resultado de los alineamientos entre las 
dos especies de rata y ratón mantienen 100% de similitud. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 9. Imagen de la página en línea del programa BLAST donde se obtiene un análisis de 
similitud de secuencias. De igual forma este análisis permite identificar si existen otras 
proteínas, en otras regiones, que sean parecidas a las secuencias solicitadas, como se 
puede observar en la imagen (flecha) no existe reporte de otras proteínas que contengan 
estas secuencias, esto quiere decir que los anticuerpos son exclusivos del receptor. 
Los resultados observados con la aplicación BLAST mostraron que no hay 
proteínas conocidas que compartan las secuencias utilizadas con una similitud 
significativa. Además, no existen regiones homólogas en los receptores de la misma 
familia. Estos datos nos permiten sugerir que los anticuerpos poseerán una alta 
especificidad. Las secuencias finales de los péptidos inmunogénicos se muestran en 
la siguiente tabla (Tabla.2). 
 
α1a-AR ratón-rata amino terminal MVLLSENASEGSN 
α1b-AR ratón-rata carboxilo terminal SNMPLAPGHF 
α1d-AR ratón-rata carboxilo terminal AEAVICQAYE 
Tabla. 2 Secuencia de los péptidos obtenidos para cada unos de los tres subtipos de α1-
AR que se utilizaron como inmunógenos. 
 
 
Pruebas para Antisueros 
En primera instanciase realizó un ensayo con suero preinmune, de esta manera 
corroboramos que antes de la inmunización los análisis de Western Blot no generon 
ninguna señal. El ensayo fue negativo, en los Western Blot (datos no mostrados). 
 
Antisuero α1A-AR 
Utilizando este suero realizamos Western blot sobre homogenados de riñón y aorta 
(Figura. 10), en este caso el ensayo revela dos bandas en el carril correspondiente a 
riñón y una sola en el carril de aorta, de acuerdo a la literatura el peso esperado es 
de 58 kDa, como se observa en ambos carriles (riñón y aorta) hay una banda del 
peso esperado. 
 
 
 
 Fig 10. Western Blot utilizando el antisuero contra el receptor α1A. 
 
Antisuero α1B. 
 
En este caso se utilizaron homogenados de aorta y células C9 transfectadas con el 
receptor α1B en este ensayo se observan las dos bandas, el peso esperado es de 85 
kDa lo cual concuerda en los dos casos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig 11 . Western Blot para el antisuero α1B-AR. 
 
Antisuero α1D 
La inmunogenicidad del antisuero se probó utilizando homogenados de hígado, 
riñón y aorta como se observa en la Figura 12. Utilizando nuestro antisuero, 
para los tres homogenados se observó una sola banda de ~70 kDa que 
corresponde al peso esperado. Este resultado se comparó contra un Western 
Blot realizado contra otro anticuerpo (Figura. 12 B) cuya inmunogenicidad ya ha 
sido demostrada por marcaje de fotoafinidad e inmunoprecipitación (García-
Sainz et al.,2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Fig. 12. A) Resultados del ensayo Western Blot para el antisuero α1D-AR; B) 
Resultados de ensayo Western Blot utilizando un antisuero cuya especificidad ha sido 
formalmente demostrada (García-Sainz et al.,2001). 
 
 
 
 
 
 
A B 
Construcción de una proteína de fusión como una alternativa para generar 
anticuerpos contra el receptor α1D. 
 
Aunque el diseño de un péptido imunogénico es una opción viable para obtener 
anticuerpos en conejos, se planteó el diseño de una proteína de fusión de los 
últimos 50 aminoácidos del carboxilo terminal del receptor α1D, con la Glutatión-
S-transferasa, debido a que este receptor es el de mayor interés para nuestro 
laboratorio. Dicha proteína de fusión además de ser inmunogénica, permite otras 
posibilidades en el estudio de receptores, por ejemplo, en ensayos de ¨pull 
down¨, técnica ampliamente aplicada en el estudio de interacciones proteína-
proteína; o para estudiar la fosforilación in vitro de proteínas, etc. Aunque no se 
realizó la inducción de la proteína, se llevó a cabo la construcción en el vector 
pGEX-4T, donde se encuentra el ORF completo de la GST y 50 aa del carboxilo 
terminal del receptor α1D. 
 
Para realizar la construcción se diseñaron cebadores para amplificar un 
fragmento de 200 pares de bases del carboxilo terminal del receptor α1D. En el 
diseño de estos cebadores se incluyeron las secuencias de corte para las 
enzimas EcoRI y BamHI, que servirán para la clonación del fragmento en el 
plásmido pGEX-4T que ya contiene la secuencia de la GST, siendo un sistema 
ampliamente utilizado para la generación de proteínas recombinantes. Las 
secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 3. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FUSDF (Sentido) 
Posición 1981 a 2011 que corresponde a la 
secuencia: 024483 del Gen BANK, en esta cadena 
se encuentra la secuencia de corte de la 
enzima de restricción BamH1 . 
5´atctcgagggatccagcctgtcccataaga 3´ 
FUSDR (Antisentido) 
Posición 2145 a 2180 que corresponde a la 
secuencia: 024483 del Gen Bank}, en esta cadena 
se encuentra la secuencia de corte de la enzima 
de restricción EcoR1. 
 
 
5´tactgcaggaattctcaaatgtcagtctctcggag3´ 
Tabla 3. Cebadores utilizados para amplificar un fragmento del receptor α1D-AR. 
 
 
Como templado se utilizó la secuencia del cDNA completo del receptor 
subclonado en el plásmido pMT2. Se realizaron pruebas de estandarización de 
temperatura para la amplificación del fragmento utilizando la PCR en gradiente a 
cinco diferentes temperaturas 48°C, 50°C, 52°C y 54°C. Como se observa en la 
(Figura.13.), en todos los casos la amplificación del inserto es exitosa, sin 
embargo se decidió trabajar a 52°C. 
 
 
Fig.13. Imagen que muestra una amplificación en gradiente de temperaturas del 
receptor α1D-AR. 
 
 
El producto de PCR fue digerido con EcoRI y BamHI y se subclonó en el vector 
pGEX4T. La construcción fue utilizada para transformar bacterias E. coli . El 
tamizaje de las colonias se realizó por PCR (Figura 14.). Se seleccionaron las 
colonias que marcaron positivas PGEX4T-α1d y se purificó el DNA plasmídico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 14. La imagen muestra una banda de ~200pb que corresponde al tamaño del 
inserto del receptor α1d-AR en colonias bacterianas E.coli JM103 (C1-C4) y en 
plásmidos purificados (P1-P2). 
 
Cultivo de células de músculo liso vascular. 
 
Para llevar al cabo nuestros estudios, se establecieron cultivos primarios de 
células de músculo liso vascular por digestión enzimática. Como se describe en 
materiales y métodos el primer tratamiento fue con Colagenasa II para retirar la 
capa adventicia y posteriormente se usó una mezcla de Colagenasa II y Elastasa 
para disgregar las células musculares. En nuestros cultivos (Figura. 15) se puede 
detectar la expresión de alfa actina de músculo liso por inmunohistoquímica 
(Figura.16), esta proteína es un marcador de este tipo celular. 
 
 
 
Fig. 15. Fotografía de cultivo primario de células de músculo liso vascular después de 
72 hr. de incubación a 37°C (63X). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 16. Cultivo primario de células de músculo liso vascular. Fotografía de 
microscopía confocal, las células están marcadas con un anticuerpo contra α-actina de 
músculo liso. 
 
 
Inmunocitoquímica 
 
En primer lugar se realizaron dos testigos para asegurarnos de que no existiera 
inespecificidad de los anticuerpos (Figura 17.). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig 17. Cultivos primarios de células de músculo liso vascular de aorta de rata Wistar. 
(A)Fotografía de microscopía de campo claro. (B) Fotografía de una muestra 
observada con microscopio confocal, no se observa fluorescencia, esta muestra está 
tratada únicamente con anticuerpo secundario (anticonejo FITC). 
 
Inmunocitoquímica para el receptor α1A-AR en cultivos de células de 
músculo liso vascular. 
Como puede observarse en la figura 18 A, la actina delimita cada una de las 
células, lo que nos permitirá ubicar la expresión de receptor. Por otra parte, el 
marcaje con el anticuerpo contra el receptor α1A-AR reveló la localización de la 
proteína principalmente en la membrana plasmática (Figura.18 B, flecha 
blanca), y en menor grado en el citoplasma (Figura.18 B, flecha amarilla). Se 
analizaron 5 cuadrantes de 5 preparaciones distintas. 
 
 
A 
B 
 
 
Fig 18. Fotografía de cultivo celular primario de músculo liso vascular de aorta de rata 
Wistar. (A).Se observa el anticuerpo para actina (rojo) marcando la totalidad de la 
célula (B) El anticuerpo contra el α1A-AR (verde) se localiza en membrana 
citoplasmática y en citoplasma. 
 
Inmunocitoquímica para el receptor α1B-AR en cultivos de células de 
músculo liso vascular. 
 
De manera análoga a los marcajes anteriores, la actina nos permite delimitar 
las células en el cultivo (Figura.19A). En este caso se realizó el marcaje con el 
anticuerpo contra el receptor α1B el cual reveló la expresión de esta proteína en 
región citoplásmica (Figura 19B flecha). Resulta interesante el hecho de que la 
expresión enla membrana celular sea baja. De la misma manera, se 
analizaron 5 cuadrantes distintos de 5 preparaciones diferentes; para cada 
receptor se analizaron cultivos celulares de 10 ratas Wistar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig 19. Inmunocitoquímica en cultivos primarios de músculo liso vascular, el 
marcaje se realizó contra (A) actina y (B) receptor α1B-AR. 
 
 
Inmunocitoquímica para el receptor α1D-AR en cultivos de células de 
músculo liso vascular 
 
Se realizó el marcaje en células de músculo liso vascular contra la proteína del 
receptor α1D. Al igual que con los otros receptores se marcó el citoesqueleto de 
actina, para observar la célula completa y se observó que la cantidad del 
receptor es alta, comparado con los otros subtipos, siendo particularmente 
abundante en el citoplasma (Figura. 20B, flechas blancas)y además claramente 
se encuentra en la membrana celular (Figura. 20B, flechas amarillas). 
 
Es evidente que un estudio detallado usando a profundidad las posibilidades de 
la microscopía confocal, así como el doble marcaje con marcadores de vesículas 
y otros receptores es necesario. Se analizaron 5 cuadrantes distintos de 5 
preparaciones diferentes; para cada receptor se analizaron cultivos celulares de 
10 ratas Wistar. 
 
 
 
Fig 20. Fotografía de cultivo celular primario de músculo liso vascular de aorta de rata 
Wistar. A) Se observa el anticuerpo contra actina (rojo) marcando la totalidad de la 
célula B) Marcaje con el anticuerpo contra el α1D-AR (verde). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Análisis y Discusión 
 
Los α1-adrenoreceptores son proteínas de la membrana celular que 
pertenecen a la familia de receptores acoplados a proteínas G. En las regiones 
transmembranales se encuentran las zonas más conservadas y presentan 
variabilidad en sus regiones amino y carboxilo; esta característica nos sugirió 
utilizar estas zonas para diseñar péptidos inmunogénicos. Además las regiones 
amino y carboxilo terminal son regiones hidrofílicas, lo que sugiere que los 
péptidos tendrán mejor solubilidad en medio acuoso a diferencia de las 
regiones no polares que conforman los pases transmembranales. 
 
Para los receptores α1B-AR y α1D-AR se escogió la región del carboxilo 
terminal, para el receptor α1A-AR se seleccionó la región del amino terminal. 
 
Los péptidos para cada receptor fueron analizados con los recursos 
bioinformáticos descritos antes y confirmamos que las secuencias 
seleccionadas son excluyentes entre cada subtipo y que pueden ser utilizadas 
para dos modelos biológicos (rata y ratón), pues presentan 100% de identidad 
con los receptores de ambas especies. Además, el análisis del perfil de 
hidrofobicidad nos indicó que estos péptidos no sufren el denominado ¨colapso 
hidrofóbico¨ al colocarlos en medio acuoso por lo que son solubles. 
 
Con estos péptidos se inmunizaron conejos Nueva Zelanda, en todos los casos 
se obtuvo suero preinmune y se utilizó en ensayos de Western Blot, lo cual nos 
aseguró que no existían anticuerpos en el conejo que reconocieran proteínas 
en los homogenizados de rata. Una vez que se obtuvieron los primeros 
antisueros, se probaron por Western Blot contra homogenizados de algunos 
órganos de ratas Wistar adultas, 
 
Para el subtipo α1A-AR se utilizaron homogenizados de riñón y de aorta, en 
ambos casos se observó un banda de ≈58 kDa, para riñón se encuentra, 
además, una banda de ≈80 kDa (Figura.10). De acuerdo con la literatura 
existente (Vázquez-Prado, et al., 2000) la banda presente en ambas muestras 
corresponde al receptor. Además, no existe ambigüedad en la identificación de 
la banda con el peso molecular adecuado. 
Por otro lado para la detección de α1B-AR se realizó un ensayo utilizando 
células transfectadas con este receptor y homogenizados de aorta; en ambos 
casos se muestra una banda de ≈85 kDa lo cual concuerda con la literatura 
(Vázquez-Prado, et al., 1997) (Fig.11). Por último para el caso del α1D-AR se 
realizaron ensayos en paralelo con otro anticuerpo cuya especificidad ya ha 
sido corroborada por marcaje de fotoafinidad con antagonistas selectivos 
radiomarcados (García-Sainz, et. al., 2001), sobre homogenados de hígado, 
riñón y aorta. Los resultados de los ensayos nos muestran para los dos casos 
una banda de ≈75 kDa (Figura.12 A y B). 
 
En resumen, las observaciones realizadas por Western Blot indican que las 
bandas reactivas observadas con los antisueros corresponden a los receptores 
α1 adrenérgicos. 
 
Uno de los objetivos fundamentales de este trabajo fue determinar la 
localización de cada receptor en células de músculo liso vascular, 
específicamente de la arteria aorta, para esto desarrollamos cultivos primarios 
de este tejido para realizar inmunohistoquímica. Para comprobar que las 
células obtenidas y cultivadas son células musculares de la capa media de la 
aorta medimos alfa actina de músculo liso, que es un marcador de células 
musculares, > 98% de las células observadas fueron positivas a este marcador. 
Cabe resaltar que las células del epitelio vascular o del endotelio no expresan 
alfa actina de músculo liso. 
 
Para los ensayos de inmunohistoquímica primero se realizaron marcajes 
control, pues era importante asegurarnos de que no existiera fluorescencia 
inespecífica por parte del anticuerpo fluoresceinado anticonejo FITC (Figura 
17). No se detectó marcaje inespecífico atribuible al anticuerpo secundario. 
 
Utilizando los antisueros específicos pudimos observar que el receptor α1A-AR 
(Figura 18) se localiza principalmente en la membrana celular y en menor 
cantidad en el citoplasma, en estudios anteriores utilizando como modelo 
células COS-7 transfectadas con el receptor se ha descrito que el α1A-AR se 
localiza predominantemente en el citoplasma (Hirasawa et.al., 1997; Sugawara 
et al., 2002). Otros estudios utilizando células HEK con expresión exógena del 
receptor se ha descrito que se localiza en la membrana celular (Chalothorn et 
al., 2002). 
 
El receptor α1B-AR (Figura 19) se localiza, principalmente, en la región del 
citoplasma incluyendo la región perinuclear. Estudios previos indican que se 
localiza en el citoplasma celular de células transfectadas HEK-293 (Chalothorn 
et al., 2002), otros reportes indican localización cercana a núcleo en zonas muy 
delimitadas en células COS-7 transfectadas con α1B-AR (Hirasawa et al., 1997). 
Estos datos son consistentes con nuestras observaciones y abren la 
interrogante de cuál podría ser el papel de este receptor si no se encuentra en 
la membrana celular. Debemos resaltar que las descripciones previas fueron 
realizadas en líneas celulares transfectadas, en este caso nosotros empleamos 
un sistema nativo. 
 
Para el receptor α1D-AR obtuvimos imágenes que nos muestran que se localiza 
en la región citoplasmática y en la membrana celular (Figura 20), estos 
resultados concuerdan con la literatura, donde se ha descrito que este receptor 
se localiza en la zona perinuclear y en la membrana celular de fibroblastos de 
rata (Daly, 1998) y de células HEK-293 transfectadas (Hague, et al., 2004; 
Chalothorn et al., 2002). 
 
Una aportación de nuestro trabajo es que en el caso de los tres receptores 
estudiados, se observa lo que se había descrito en sistemas de expresión 
exógena, debido a que nuestro sistema no ha sido modificado para expresar 
ninguna molécula no tenemos problemas con aspectos como los niveles de 
expresión y puede ser utilizado como un sistema idóneo para caracterizar cómo 
se regula la localización de estos receptores y así entender porque son 
fisiológicamente relevantes. 
 
Los datos obtenidos en este proyecto proveen las herramientas para un estudio 
puntual acerca de la importancia fisiológica de la localización de receptores en 
células de músculo liso vascular, de acuerdo a los datos existentes el receptorα1D tiene un papel en el mantenimiento de la presión arterial y en la 
patogénesis de la hipertensión, en este caso su distribución celular debe de 
estar modulada diferencialmente en individuos hipertensos, los mecanismos 
que regulan este proceso no han sido estudiados. 
 
 
Conclusiones 
 
Los α1-adrenoreceptores son proteínas de la membrana celular que pertenecen 
a la familia de receptores acoplados a proteínas G. En el sistema 
cardiovascular juegan un papel muy importante, en la regulación de la 
contracción de músculo liso vascular, y por ende en la regulación de la presión 
arterial. Fue esta la razón por la que diseñamos anticuerpos específicos para 
cada subtipo de receptor. 
 
Para los receptores α1B-AR y α1D-AR se escogió la región del carboxilo 
terminal, para el receptor α1A-AR se seleccionó la región del amino terminal. 
Con estos péptidos obtuvimos anticuerpos que fueron probados, por ensayo 
Western Blot para cada subtipo en diferentes órganos de ratas Wistar y 
exitosamente obtuvimos especificidad entre ellos y estos fueron usados para 
determinar la localización celular de los receptores adrenérgicos. 
 
Pudimos observar que el receptor α1A-AR se localiza principalmente en la 
membrana celular y en menor cantidad en el citoplasma. El receptor α1B-AR, se 
localiza principalmente en la región del citoplasma incluyendo la región 
perinuclear y por último el receptor α1D-AR que se localiza en la región 
citoplasmática y en la membrana celular. 
 
Es importante señalar que la aportación más importante de nuestro trabajo es 
el modelo de estudio que utilizamos, ya que estudios previos se han realizado 
en células transfectadas y en este caso se realizó en células de músculo liso 
vascular; este modelo puede acercarnos un poco más a la realidad. 
 
 
 
 
 
 
Perspectivas 
 
Nosotros proponemos estudiar la distribución celular de los tres subtipos de 
receptores α1-AR con distintos estímulos hormales (angiotensina, 
norepinefrina, bradicinina, etc) y observar si existe una relocalización de éstos 
ya que existen reportes sobre el efecto de estos estímulos en tejidos 
vasculares (Ibarra, et al., 1997). Así mismo el estudio de la posible dimerización 
entre el α1D-AR y el α1B-AR, este último como un posible receptor “chaperon” 
que translocaria al α1D-AR a la membrana celular y expresara su función 
(Finch, et al., 2005). Este fascinante tema de estudio puede llevarnos a 
prevenir y resolver en un futuro la patogénesis de la hipertensión. 
 
 
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