Avaliação de Concentração de Arsênico em Água

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 
“EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE 
ARSÉNICO EN AGUA EMPLEANDO BIOSENSORES 
MICROBIANOS” 
T E S I S 
 
Q U E P A R A O B T E N E R E L G R A D O D E : 
MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS 
P R E S E N T A 
 
Q.B.P OLIVER VALENZUELA ROSAS 
 
 
Directoras de Tesis 
 
Dra. Enriqueta F. Amora Lazcano 
Dra. Sofía E. Garrido Hoyos 
MÉXICO, D.F. 2010 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Bioquímica Microbiana 
y el Laboratorio de Fitopatología del departamento de Microbiología en la 
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, bajo la dirección de la Dra. 
Enriqueta Feliciana Amora Lazcano y la Dra. Sofia Esperanza Garrido 
Hoyos. 
El sustentante fue becario del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología 
(CONACyT), en el periodo de Febrero 2008 a Diciembre 2009 y del 
Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) durante el 
mismo periodo. 
Este trabajo fue financiado por la Secretaría de Investigación y Posgrado 
(SIP) mediante los proyectos SIP-20080976 y SIP-20090553 para la Dra. 
Enriqueta Feliciana Amora Lazcano; para la Dra. Sofía Esperanza 
Garrido Hoyos el proyecto SEP/CONACYT- 2004-C01-47076. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Dra. Enriqueta Amora Lazcano por la confianza y paciencia depositada en mí para la 
realización de este proyecto y por ser más que mi maestra, mi segunda mamá en todos 
estos años. 
 
Dra. Sofía Garrido Hoyos por compartir sus conocimientos conmigo y por confiar en mí a 
pesar de no conocerme tanto. 
 
Dra. Thelma Villegas Garrido por la valiosa ayuda proporcionada para la interpretación de 
mis resultados 
 
A los sinodales por todas las observaciones realizadas a mi trabajo y los consejos 
proporcionados a lo largo de este tiempo. 
 
A mis compañeros, Selene, Claudia, Denisse, Francisco, Héctor, Josam y Ariana. 
 
A la nueva familia que me recibió con los brazos abiertos en su laboratorio Prof. 
Cristina, Dr. Luis, Prof. Isaac, Prof. José Luis y David. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
i 
 
ÍNDICE GENERAL 
 
Índice general i 
Índice de figuras iv 
Índice de tablas vii 
Abreviaturas viii 
Glosario ix 
Resumen x 
Abstract xi 
 
I. Introducción. 
 
 1.1 El Arsénico 1 
 1.2 Características químicas 1 
 1.3 Química del arsénico en el agua 2 
 1.4 Ciclo del arsénico 4 
 1.5 Fuentes ambientales de exposición 6 
 1.6 Efectos tóxicos del arsénico en el hombre 7 
 1.6.1 Toxicocinética 7 
 1.6.2 Absorción 7 
 1.6.3 Distribución 7 
 1.6.4 Biotransformación 8 
 1.6.5 Excreción 9 
 1.6.6 Toxicodinamia 9 
 1.7 Mecanismos de toxicidad 10 
 1.8 Efectos adversos 10 
 1.8.1 Efectos agudos 10 
 1.8.2 Efectos crónicos 11 
1.9 Presencia del arsénico en agua en diferentes estados 
 de la República Mexicana 12 
II. Antecedentes 14 
 
 2.1 Métodos de análisis del arsénico en el agua 14 
 2.1.1 Métodos convencionales 14 
 2.1.2 Métodos no convencionales 15 
 
ii 
 
 2.1.2.1 Wagtech Arsenator digital 15 
 2.1.2.2 Biosensores 16 
 2.1.2.2.1 Genes reporteros y usos 18 
 2.1.2.2.2 Ventajas y desventajas 22 
2.1.2.3 Biosensor para la detección de Arsénico en agua 
 (E. coli modificada) 22 
 2.1.2.3.1 Construcción de los biosensores 24 
 2.1.2.3.2 Fundamento de los biosensores 27 
 
III. Justificación 30 
 
IV. Objetivos generales 31 
 4.1 Objetivos particulares 31 
 
V. Materiales y métodos. 32 
 
 5.1 Muestra biológica 32 
 5.2 Medio de cultivo empleado 32 
 5.3 Solución patrón de arsénico 32 
 5.4 Muestras 32 
 5.5 Verificación de la pureza de las cepas 35 
 5.6 Conservación de las cepas 36 
 5.7 Cuantificación de arsénico en muestras de agua utilizando 
 la cepa de E. coli pMV132-arsR-ABS 36 
 5.8 Cuantificación de arsénico en muestras de agua utilizando 
 la cepa de E.coli pJAMA-arsR-ABS 39 
 5.9 Cuantificación de arsénico en agua por espectrofotometría en línea de absorción 
 atómica con generación de hidruros 40 
 5.10 Cuantificación de arsénico en agua utilizando 
 el Wagtech Arsenator Digital 41 
 5.11 Prueba semicuantitativa para la detección de arsénico en agua 
 en muestras de campo 42 
5.12 Parámetros estadísticos empleados 43 
 
 
iii 
 
VI. Resultados 44 
 
6.1 Cuantificación de arsénico en muestras de agua utilizando 
 la cepa de E. coli pMV132-arsR-ABS 44 
6.2 Cuantificación de arsénico en muestras de agua utilizando 
 la cepa de E.coli pJAMA-arsR-ABS 46 
6.3 Cuantificación de arsénico en agua por espectrofotometría en línea de absorción 
 atómica con generación de hidruros 48 
6.4 Cuantificación de arsénico en agua utilizando 
 el Wagtech Arsenator Digital 48 
6.5 Comparación de los métodos utilizados para evaluar la concentración de 
 arsénico en agua 49 
6.6 Concentraciones de las muestras problema 50 
6.7 Prueba semicuantitativa para la detección de arsénico 
 en agua en campo 52 
 
VII. Discusión 54 
VIII. Conclusiones 60 
IX Perspectivas 61 
X. Anexo 62 
XI. Bibliografía 69 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
iv 
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Página 
Figura 1 
 
Estructura química del gas 2-cloroetenildicloroarsina (tomado de URL-1). 
 
1 
Figura 2 
 
 
Representación esquemática de las estructuras químicas que presenta el 
arseniato (A) y arsenito (B) (tomado de URL-2, URL-3). 
 
2 
Figura 3 
 
Diagrama pH-Eh de especies de arsénico en agua (Ferguson y Galvis, 1972). 
 
3 
Figura 4 
 
Representación esquemática del ciclo del arsénico (modificado de 
(Mukhopadhyay et al., 2002). 
 
5 
Figura 5 
 
Origen del arsénico en restos minerales (tomado de (Liu et al., 2008). 
 
6 
Figura 6 
 
Biotransformación del arsénico inorgánico (modificado de Heck et al., 2009). 
 
8 
Figura 7 
 
Lesiones hipercromicas causadas por el consumo de arsénico en agua por 
periodos muy prolongados (Tomado de URL-5). 
 
11 
Figura 8 
 
 
Estados de la República Mexicana en la cual se han reportado concentraciones 
de arsénico en fuentes de abastecimientos de agua potable que sobrepasan la 
norma oficial. 
 
13 
Figura 9 
 
Método no convencional para la cuantificación de arsénico de la marca Wagtech 
Arsenator Digital Kit (tomado de URL-6). 
 
15 
Figura 10 
 
Representación esquemática de los eventos celulares que dan lugar a la 
expresión de la proteína reportera; el analito pasa a través de la membrana 
celular y se une a una proteína reguladora, activando la transcripción y 
traducción del gen reportero, tras la adición un sustrato externo se produce una 
señal fácil de medir (tomado de Daunert et al., 2000). 
 
17 
Figura 11 
 
Representación esquemática del operón de resistencia a arsénico, está 
conformado por tres genes estructurales (arsA,arsB, arsC) y dos genes 
reguladores (arsD , arsR). 
 
23 
Figura 12 
 
 
Representación esquemática del plásmido de E. coli pMV132-arsR-ABS 
(Stocker et al., 2003). 
 
25 
Figura 13 
 
Representación esquemática del plásmido de E. coli pJAMA-arsR-ABS (Stocker 
et al., 2003). 
 
26 
 
v 
 
Figura 14 
Principio del biosensor de E. coli pJAMA-arsR-ABS. (A) La proteína ArsR regula 
la expresión de los genes reporteros, esta se encuentra unida al sito operador/ 
promotor de arsR, cuando no hay presencia de arsénico. (B) Cuando se detecta 
la presencia de arsénico; ésta se une a ArsR cambiando la conformación de la 
proteína, haciendo que esta se despegue del sitio operador /promotor para la 
expresiónde los genes reporteros (luxA, luxB y lacZ) (Stocker et al., 2003). 
 
27 
Figura 15 
 
Representación esquemática de la reacción que lleva a cabo la β-galactosidasa 
en presencia del ONPG (URL-7). 
 
28 
Figura 16 
 
Reacción que lleva a cabo la luciferasa en presencia de su sustrato (n-decanal). 
 
29 
Figura 17 
 
Sistema óptico del luminómetro Fluoroskan Ascent Fl, Thermo Electron 
Corporation. 
29 
Figura 18 
 
Ubicación topográfica de las muestras manejadas en el estudio. 
 
34 
Figura 19 
 
Método químico de la marca Wagtech Arsenator digital para la cuantificación de 
arsénico en agua. 
 
40 
Figura 20 
 
Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo 
de incubación de 5 min a 28°C con la adición de SDS al 0.1%, los datos 
mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo. 
 
43 
Figura 21 
 
Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo 
de incubación de 10 min a 28°C con la adición de SDS al 0.1%, los datos 
mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo. 
 
44 
Figura 22 
 
Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo 
de incubación de 15 min a 28°C con la adición de SDS al 0.1%, los datos 
mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo. 
 
44 
Figura 23 
 
Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo 
de incubación de 10 min a 28°C sin la adición de SDS al 0.1%, los datos 
mostrados son el producto de 3 réplicas del ensayo. 
 
45 
Figura 24 
 
Curva tipo de E. coli pJAMA-arsR-ABS, la reacción se llevó a cabo en un tiempo 
de incubación una hora a 30°C en agitación, los datos mostrados son el 
producto de 3 réplicas del ensayo. 
 
46 
Figura 25 
 
Curva tipo de E. coli pJAMA-arsR-ABS, la reacción se llevó a cabo en un tiempo 
de incubación de dos horas a 30°C en agitación, los datos mostrados son el 
producto de 3 réplicas del ensayo. 
 
46 
Figura 26 
 
Curva tipo del espectrofotómetro de absorción atómica, con diferentes 
concentraciones conocidas de arsénico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM), 
las cuales fueron tratadas según lo marcado en la norma oficial mexicana. 
47 
 
vi 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 27 
 
Curva tipo de Wagtech Arsenator digital, la reacción se llevó a cabo en un 
tiempo de incubación una 20 min a 30°C, los datos mostrados son el producto 
de 3 réplicas del ensayo. 
 
48 
Figura 28A 
 
Prueba semicuantitativa para la detección de arsénico en agua empleando tiras 
de papel impregnadas con la cepa de E. coli pJAMA-arsR-ABS a diferentes 
concentraciones, A) 1.5 µL células y 20 µL Xgal (1mg/mL), B) 1.5 µL células y 
20 µL Xgal (5mg/mL), C) 3 µL células y 20 µL Xgal (1mg/mL). 
52 
Figura 28B 
 
Prueba semicuantitativa para la detección de arsénico en agua empleando tiras 
de papel impregnadas con la cepa de E. coli pJAMA-arsR-ABS a diferentes 
concentraciones D) 3 µL células y 20 µL Xgal (5mg/mL), E) 9 µL células y 20 µL 
Xgal (1mg/mL), F) 9 µL células y 20 µL Xgal (5mg/mL). 
53 
 
vii 
 
 ÍNDICE DE TABLAS 
Tabla 1 Comparación de la toxicidad aguda de los compuestos arsenicales (Hamdi et 
al., 2009). 10 
Tabla 2 Proteínas represoras, reacciones químicas y métodos de detección empleados 
en biosensores celulares (modificado de Daunert et al., 2000). 
19 
Tabla 3A Muestras de agua recolectadas de distintos lugares de la República Mexicana 
y Guatemala. 
33 
Tabla 3B Muestras de agua recolectadas de distintos lugares de la República Mexicana 
y Guatemala. 
34 
Tabla 4 Comparación de métodos analíticos, empleando pruebas iníciales de 
desempeño, con un nivel de confianza de p= 0.05 con n-2 grados de libertad. 
49 
Tabla 5 Resultados obtenidos de las muestras problemas, mediante la interpolación en 
las curvas tipo para cada método empleado. 
50 
Tabla 6 Promedio del porcentaje de recuperación (%R) para cada uno de los métodos 
probados. 
50 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
viii 
 
ABREVIATURAS 
 
 
 
A.C: Antes de Cristo. 
As: Arsénico. 
CNA: Comisión Nacional de Agua. 
D.O: Densidad óptica. 
DNA: Acido desoxiribonucleico. 
EAA: Espectrofotometria de absorción 
atómica 
Fe: Fierro. 
FI-HG-AAS: Espectrofotometría de 
Absorción Atómica con Generación de 
Hidruros. 
FMN: Flavina Mononucleótido. 
GFP: Proteína Verde Fluorescente. 
IMTA: Instituto Mexicano de 
Tecnología del Agua. 
IPTG: Isopropil β-D-
tiogalactopiranósido. 
L: Litro. 
L: Luria . 
mg: Miligramo. 
mL: Mililitro. 
OMS: Organización Mundial de la 
Salud. 
ONPG: o-Nitrofenil β-D 
Galactopiranosido. 
PCR: Reacción en Cadena de la 
Polimerasa. 
pH: Potencia de hidrogeno. 
RNApol: RNA polimerasa. 
rpm: Revoluciones por minuto. 
SDS: Dodecil Sulfato de Sodio. 
URL: Localizador Uniforme de 
Recursos. 
RLU: Unidades Relativas de Luz. 
µg: Microgramo. 
µM: Micromolar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ix 
 
GLOSARIO 
 
Carcinogénico: Sustancia o agente físico que puede causar cáncer. 
 
Carcinoma: Es una forma de cáncer con origen en células de tipo epitelial o 
glandular, de tipo maligno. 
 
Cianosis: La cianosis es la coloración azulada de la piel o de las membranas 
mucosas causada por una deficiencia de oxígeno en la sangre. 
 
Edema: Acumulación de líquido en el espacio tisular intercelular o intersticial, 
además de en las cavidades del organismo. 
 
Hiperemia: Aumento en la irrigación a un órgano o tejido. 
 
Hiperqueratosis: Trastorno caracterizado por el engrosamiento de la capa externa 
de la piel, que está compuesta de queratina. 
 
Hipoproteinemia: Disminución de la concentración de proteínas en la sangre. 
 
Hipovolemia: Disminución del volumen circulante de sangre debido a múltiples 
factores como hemorragias, deshidratación, quemaduras, entre otros. 
 
Mutagénico: Sustancia o agente físico que causa mutaciones, es decir, que altera de 
forma permanente el DNA de las células. 
 
Sorción: Retención de una sustancia por otra cuando están en contacto 
 
Teratogénico: Cualquier sustancia que produzca defectos de nacimiento no 
hereditarios. 
 
 
x 
 
RESUMEN 
 
El origen más común del arsénico es la oxidación de minerales con un alto contenido en este 
elemento, como pueden ser, la arsenopirita, la escorodita y la orpimenta que pueden 
aparecer en diferentes ambientes geológicos. La toxicidad del arsénico es conocida a través 
de reportes epidemiológicos de cánceres y problemas como la enfermedad de pie negro y 
lesiones cutáneas, relacionados con la exposición crónica a arsénico en agua para uso y 
consumo humano. En México se han identificado concentraciones de arsénico en fuentes de 
abastecimiento de agua que alcanzan valores de 2.348 mg/L, rebasando el límite máximo de 
la Norma Oficial Mexicana, 0.025 mg/L. Existen métodos para la cuantificación de arsénico 
en agua como la espectrofotometría de absorción atómica, Kits comerciales y el uso de 
biosensores. El objetivo de este trabajo es implementar los biosensores microbianos 
(Escherichia coli) por medio de técnicas que nos permitan la cuantificación de arsénico en 
muestras de agua de diversos orígenes. Se emplearon cepas transformadas de cepas E. coli 
pMV132-arsR-ABS y E. coli pJAMA-arsR-ABS la cual tienen insertado un plásmido que les 
confiere resistencia a la ampicilina así como genes reporteros que codifican para la β-
galactosidasa y luciferasa respectivamente. Se determinaron las condiciones óptimas de 
operación en base a una serie modificaciones a métodos propuestos por Stocker y Van Der 
Meer empleando soluciones conocidas de arsénico (0. 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM), 
posteriormente se evaluaron estos métodos junto con EAA y Wagtech Arsenator digital 
mediante un análisis estadístico, encontrándose que el EAA y Wagtech Arsenator digital 
presentan mayor sensibilidad así como intervalo de trabajo más amplio y demás no 
presentan ningún tipo de efecto matriz en comparación con los biosensoresprobados. Sin 
embargo a pesar de estas desventajas se encontró que estos métodos basados en 
biosensores presentaron un porcentaje de recuperación alta con muestras problemas 
recolectas en diferentes puntos de la república mexicana y Ciudad de México, lo que indica 
que estos pueden ser empleados como métodos alternativos para la cuantificación de 
arsénico de agua, los cuales no generan productos tóxicos y son menos costosos. Además 
se monto una prueba semicuantitativa con la cepa E. coli pMV132-arsR-ABS, sometiéndola a 
una mezcla de diferentes soportes, los cuales ayudan al microorganismo a sobrevivir al 
estrés tras la desecación después de colocarlos en tiras de papel Whatman 3M, estas 
mismas fueron sometidas a concentraciones de arsénico conocidas (0. 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 
0.6, 0.8 y 1.0 µM), encontrándose una buena respuesta con 3µL de células y 20 µL de Xgal 
5mg/mL 
 
xi 
 
ABSTRACT 
 
The most common source of arsenic is the oxidation of minerals with a high content of this 
element, for example, arsenopyrite, scorodite and orpimenta that may appear in different 
geological environments. The toxicity of arsenic is known through epidemiological reports of 
cancers and problems such as black foot disease and skin lesions associated with chronic 
exposure to arsenic in water for human use and consumption. In Mexico has found 
concentrations of arsenic in water sources that reach values of 2.348 mg / L, exceeding the 
ceiling of the Norma Oficial Mexicana, 0.025 mg / L. There are methods for the quantification 
of arsenic in water as atomic absorption spectrophotometry, commercial kits and the use of 
biosensors. The aim of this work is to implement the microbial biosensors (Escherichia coli) 
by means of techniques that allow us the quantification of arsenic in water samples from 
different origins. We used E. coli pMV132-arsR-ABS y E. coli pJAMA-arsR-ABS strains 
transformed, which they have inserted a plasmid that confers resistance to ampicillin and 
reporter genes coding for β-galactosidasa and luciferase, respectively. We determined the 
optimum operating conditions based on a number changes to methods proposed by Stocker 
and Van Der Meer using known solutions of arsenic (0. 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM), 
these methods were subsequently evaluated with EAA and Wagtech Arsenator digital by 
statistical analysis, finding that the EAA and Wagtech Arsenator digital have greater 
sensitivity and broader range of work and others do not have any effect compared with the 
parent biosensor tested. However was found that methods based of biosensors showed a 
high recovery rate problems with samples collected at different points of the Mexican 
Republic and Mexico City, indicating that these can be used as alternative 
methods quantification of arsenic in water, don’t generate toxic compounds and less 
expensive. In addition, a test amount with the strain semiquantitative E. coli pMV132-arsR-
ABS, subjecting a mixture of different materials, which help the organism to survive the stress after 
drying after they are placed on strips of Whatman 3M paper, the same were subject to known 
concentrations of arsenic (0. 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM), found a good answer with 
3µL cells and 20 µL of 5 mg / ml Xgal. 
 
1 
 
1. INTRODUCCIÓN 
 
1.1 El Arsénico 
Los compuestos arsenicales tienen una larga historia como agentes 
medicinales y venenos. Su uso fue descrito desde el año 400 A.C por 
Hipócrates, quien recomendó la aplicación de una pasta (AsS) para tratar 
ulceras cutáneas. Durante la edad media, el arsénico blanco (trióxido de 
arsénico) fue el veneno de elección, debido a su alta toxicidad. Durante la 
primera guerra mundial, se desarrollaron y utilizaron como armas químicas los 
gases arsenicales, entre ellos el gas Lewisita (Fig. 1) (2-
cloroetenildicloroarsina), que es un potente agente vesicante, irritante local y 
tóxico sistémico (Liu et al., 2008). 
A principios del siglo pasado, los arsenicales orgánicos se emplearon para 
combatir enfermedades como la tripanosomiasis y la sífilis mientras que 
algunos compuestos de arsénico inorgánico, se usaron para el tratamiento de 
enfermedades pulmonares. Su uso medicinal esta actualmente limitado a 
casos avanzados de la enfermedad del sueño y como componente de drogas 
antiparasitarias de uso tópico (Liu et al., 2008). 
 
 
 
 
1.2 CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DEL ARSÉNICO 
 
El arsénico (As) es un elemento ubicuo, está clasificado como metaloide que 
junto con el nitrógeno y el fosforo, con los que comparte propiedades, 
pertenece al grupo V de la tabla periódica. En el estado oxidado, el As puede 
tener las valencias +3 [As(III)] y +5 [As(V)](Georgiadis et al., 2006). 
Fig 1 Estructura química del gas 2-cloroetenildicloroarsina (tomado de URL-1) 
 
2 
 
Los compuestos de As (III) forman derivados piramidales con un par de 
electrones no compartidos, lo que le permite formar complejos con ácidos de 
Lewis y metales de transición. En contraste, los compuestos de As (V) tienen 
una estructura trigonal bipiramidal, en los cuales los enlaces suelen ser más 
largos. El As (V) no tiene electrones no compartidos, lo que probablemente 
contribuye a su estabilidad en la naturaleza (Fig.2) ( Georgiadis et al., 2006). 
 
 
 
 
 
 
1.3 QUÍMICA DEL ARSÉNICO EN EL AGUA 
 
El arsénico puede estar presente en cuatro estados de oxidación en el agua; 
según las condiciones de óxido-reducción, como arseniato (As5+), arsenito 
(As3+), arsina (As3-) o su estado elemental (As0), pero generalmente se 
encuentra en las formas trivalente y pentavalente. 
 
Su carácter químico está determinado por el hecho de que cambia 
rápidamente de un estado de oxidación a otro, a través de reacciones químicas 
o biológicas que ocurren en el ambiente. Así, el control del equilibrio en la 
solubilidad y movilidad del arsénico depende de las condiciones de oxido-
reducción, el pH y la actividad biológica (Ferguson & Galvis, 1972). La 
especiación del arsénico en el agua, se muestra en la Figura 3, que presenta 
las diferentes especies de arsénico en función del pH y el potencial redox. 
 
 
A B 
Fig. 2 Representación esquemática de las estructuras químicas que presenta el arseniato (A) 
y arsenito (B) (tomado de URL-2, URL-3). 
 
3 
 
En la construcción de este diagrama se asume una sola fase (agua), siendo los 
únicos componentes el arsenato, el arsenito y los iones hidrógeno. Un aspecto 
sobresaliente del diagrama es que el As (III) se presenta como una especie 
soluble sin carga en el intervalo de pH neutro y el As (V) como anión para todo 
el intervalo de pH. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Las reacciones ácido–base del arsénico son muy rápidas, pero las de óxido-
reducción son lentas, a menos que se aplique un oxidante fuerte. Las 
investigaciones demuestran que el As (III) es estable por varios días en 
presencia de oxígeno, es decir, a un potencial redox lo suficientemente alto 
para causar la oxidación espontánea a As (V), por lo que esta se lleva a cabo 
lentamente. En aguas que contienen oxígeno, el As (V) es predominante, 
existiendo en formas aniónicas como H2AsO4-, HAsO42- o AsO43- en el pH 
común del tratamiento de agua (pH 5-12). 
 
 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
 
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
-0,20
-0,40
-0,60
-0,80
Eh (volts)
 
 
 3H AsO3
-3
AsO
2 3H AsO
-
4HAsO
=
-
4
H AsO2
4H AsO3
3
HAsO=
tot
AGUA CON PODER OXIDATIVO
AGUA CON PODER REDUCTIVO
pH
AsO
4
-3
 3
Fig. 3 Diagrama pH-Eh de especies de arsénico en agua (Ferguson y Galvis, 1972). 
 
4 
 
Bajo condiciones anóxicas, el As (III) es estable, con especies no iónicas 
(H3AsO3) y aniónicas (H2AsO3-), las cuales predominan por arriba y por debajo 
de un pH de 9.22, respectivamente. Soluciones fuertemente ácidas o alcalinas, 
asícomo la presencia de sales de cobre, carbón o altas temperaturas pueden 
incrementar la tasa de oxidación (Ferguson & Galvis, 1972). 
 
Sustancias como el cloro, el óxido de manganeso, el permanganato y otro tipo 
de oxidantes pueden transformar directamente el As (III) en As (V) en ausencia 
de oxígeno. Dentro de zonas oxigenadas, el As (V) es estable y puede 
permanecer en solución o coprecipitar con óxidos de hierro o manganeso si 
éstos se encuentran presentes. Altas concentraciones de ortofosfatos pueden 
competir con el As (V) por los sitios de sorción en esta zona, incrementando las 
concentraciones de arsénico soluble, así como su movilización (Ferguson & 
Galvis, 1972). 
 
La principal vía de dispersión del arsénico en el ambiente es el agua. Aún si se 
considera la sedimentación, la solubilidad de los arseniatos y arsenitos es 
suficiente para que este elemento se transporte en los sistemas acuáticos. La 
concentración del arsénico en aguas naturales frescas es muy variable y 
probablemente depende de las formas de arsénico en el suelo (URL-4). 
 
1.4 CICLO DEL ARSÉNICO 
Las industrias que son la mayor fuente de contaminación al ambiente con 
arsénico son: la quema de carbón, la metalúrgica y más recientemente la de 
los semiconductores; así como, la liberación de minerales ricos en arsénico por 
la industria minera (Fig. 4). 
 
 
 
 
5 
 
El arseniato es absorbido por organismos marinos que van desde el 
fitoplancton, algas, crustáceos, moluscos y peces; estos los convierten en 
pequeños compuestos orgánicos (tales como: el acido metilarsonico ó el acido 
dimetilarsinico) o se convierten en forma de depósitos orgánicos, los cuales 
son excretados al medio (Mukhopadhyay et al., 2002). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Sin embargo, algo de ese arsénico es retenido por el fitoplancton que lo 
metaboliza a compuestos orgánicos complejos. La transformación del arsénico 
inorgánico en compuestos liposolubles podría ser un mecanismo adaptativo 
para el fitoplancton marino, compensando así la limitada disponibilidad de 
nitrato. Algunas algas transforman los compuestos arsenicales en formas más 
complejas que son solubles en agua tal como los arsenosacáridos 
(dimetilarsenosacárido) o lípidos. Mientras que el fitoplancton y algunas 
macroalgas son productores primarios de arsénico orgánico complejo 
(Mukhopadhyay et al., 2002). 
 
Fig 4 Representación esquemática del ciclo del arsénico (modificado de 
(Mukhopadhyay et al., 2002). 
 
6 
 
Los peces y animales invertebrados acumulan el 99% del arsénico en su forma 
orgánica; los tejidos de algunos crustáceos y moluscos llegan a contener 
concentraciones de arsénico más altas que los peces. El compuesto de 
arsénico orgánico más comúnmente aislado de organismos marinos en la 
arsenobetaína (Fig. 4). Este está presente en algas, almejas, langostas, 
camarones y tiburones (Mukhopadhyay et al., 2002). 
 
No se conoce cuantos arsenolípidos y arsenosacáridos son convertidos en 
arsenobetaína en animales superiores marinos. Esta es degradada en los 
sedimentos marinos por los microorganismos que la transforman acido 
metilarsonico y arsénico inorgánico. 
 
1.5 FUENTES AMBIENTALES DE EXPOSICIÓN 
 
El arsénico se encuentra contenido en minerales como la arsenopirita (FeAsS), 
la escorodita (FeAsO4 2H2O) y la oropimenta (As2S3) (Fig. 5) las cuales se 
encuentran en diferentes ambientes geológicos (Peters & Blum, 2003; Scareck 
et al., 2004); este elemento también puede ser liberado al ambiente por la 
actividad volcánica, la erosión de depósitos minerales y por diversas 
actividades humanas (Liu et al., 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 5 Origen del arsénico en restos minerales (tomado de (Liu et al., 2008). 
Oropimenta Arsenopirita 
 
7 
 
1.6 EFECTOS TÓXICOS DEL ARSÉNICO EN EL HOMBRE 
 
1.6.1 TOXICOCINÉTICA 
Las principales vías de entrada del arsénico al organismo son el tracto 
gastrointestinal (TGI) por el consumo de agua y el respiratorio debido a la 
aspiración de aerosoles generados por la aspersión de plaguicidas o 
compuestos que lo contengan. La absorción por vía dérmica es baja y alcanza 
solamente el 2% (Heck et al., 2009). 
1.6.2 ABSORCIÓN 
En los seres humanos, y en la mayoría de las especies animales, la absorción 
de compuestos arsenicales a través del TGI es alta (95%) cuando se 
administran en solución acuosa. La absorción de arsénico por vía respiratoria 
depende del tamaño de las partículas inhaladas, de su solubilidad y de la forma 
química del compuesto. La principal forma química presente en el aire es el 
As(III), el cual es de origen antropogénico. Las partículas grandes se depositan 
en vías superiores, son removidas por el movimiento ciliar y transportadas al 
TGI, en donde son absorbidas dependiendo de su solubilidad. Las partículas 
menores a 7 mm se absorben en un 75 a 85 % (Heck et al., 2009). 
1.6.3 DISTRIBUCIÓN 
Los compuestos arsenicales tienden a acumularse principalmente en hígado, 
riñón, pulmón y bazo. El As(III) se une preferentemente a los grupos sulfhidrilo 
de las proteínas como la queratina, por lo que se deposita en pelo y uñas (Liu 
et al., 2008, Heck et al., 2009). 
 
 
 
8 
 
1.6.4 BIOTRANSFORMACIÓN 
El metabolismo del arsénico se realiza principalmente en hígado y, aunque su 
mecanismo no está bien establecido, se propone que en él intervienen dos 
procesos: 
 Reacciones de reducción que convierten el As (V) en As (III), 
 Reacciones de metilación oxídativa que transforman el As (III) en especies 
metiladas (Fig. 6). 
El proceso de metilación propuesto es la reducción del As (V) a As (III); 
seguida, de la adición del primer grupo metilo para obtener ácido monometil-
arsónico (MMA); seguida de una reducción de MMA(V) a MMA(III) antes de la 
segunda metilación, lo que produce el ácido dimetil-arsinico (DMA). Se ha 
propuesto a la S-adenosilmetionina como donador de los grupos metilo y al 
glutatión reducido (GSH) como principal agente reductor transportador del 
arsénico (Thomas et al., 2007). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig 6 Biotransformación del arsénico inorgánico (modificado de Heck et 
al., 2009) 
 
9 
 
Existen varios factores que pueden influir en la capacidad de metilación del 
arsénico, entre ellos: la dosis, el tiempo de exposición y una dieta alta en 
metionina y proteínas azufradas. 
Se ha encontrado un incremento significativo de DMA que son excretados en la 
orina de individuos que han estado expuestos crónicamente a altas 
concentraciones de arsénico en agua de consumo (Heck et al., 2009). 
1.6.5 EXCRECIÓN 
El arsénico se elimina principalmente por el riñón en forma de DMA (50-70 %) 
y un 20% se excreta sin metilar en la orina (Fig. 6). Las proporciones relativas 
de As(III), As(V), MMA y DMA en la orina pueden variar, dependiendo de la 
forma química, el tiempo de exposición, la dosis y la especie animal expuesta 
(Drobná et al., 2005, Liu et al., 2008). 
En comparación con el hombre, en la mayoría de las especies animales la 
excreción de MMA es muy baja (<4 %) mientras que, en la rata, la retención y 
distribución de arsénico difieren de las observadas en otras especies, pues la 
mayoría del DMA formado se une a los eritrocitos (Drobná et al., 2005). 
1.6.6 TOXICODINAMIA 
La toxicidad del arsénico es compleja pues depende de la vía de exposición, 
del estado de valencia y de la forma química (inorgánica u orgánica) del 
compuesto. El arsénico inorgánico es el responsable de la mayoría de los 
casos de intoxicación en humanos. El gas Arsina es considerado como la 
forma más tóxica del arsénico, debido a que actúa como un potente agente 
hemolítico, sin embargo, este gas difícilmente alcanza niveles tóxicos en el 
ambiente (Drobná et al., 2005). Generalmente las sales inorgánicas de As (III) 
son mas toxicas que las de As (V) (Tabla 1) y la solubilidad de los compuestos 
de arsénico inorgánico está relacionada con su toxicidad (Hamdi etal., 2009). 
 
 
10 
 
 
CCoommppuueessttoo DDLL5500 ((mmgg//KKgg)) AAnniimmaall//VVííaa 
AArrsseenniittoo ddee ssooddiioo 44..55 RRaattaa//iinnttrraappeerriittoonneeaall 
AArrsseenniiaattoo ddee ssooddiioo 1144--1188 RRaattaa//iinnttrraappeerriittoonneeaall 
MMMMAA 11 880000 RRaattaa//OOrraall 
DDMMAA 11 220000 RRaattaa//OOrraall 
AArrsseennoobbeettaaiinnaa 11 00000000 RRaattaa//OOrraall 
1.7 MECANISMOS DE TOXICIDAD 
El mecanismo más importante para explicar la toxicidad de los compuestos 
arsenicales trivalentes es a través de su afinidad por los grupos sulfhidrilo de 
las proteínas. Las enzimas son particularmente afectadas si el grupo –SH está 
ubicado en un sitio critico para su actividad. El As(V) puede substituir al grupo 
fosfato en las reacciones que son catalizadas enzimáticamente, afectando 
procesos como la producción del ATP y la síntesis del DNA; sin embargo, el 
daño que produce es difícil de evaluar pues el As(V) se reduce a As(III) en el 
organismo (Ratnaike.,2003). 
1.8 EFECTOS ADVERSOS 
1.8.1 EFECTOS AGUDOS 
Los efectos característicos de la exposición aguda al arsénico son alteraciones 
gastrointestinales, cardiovasculares, nerviosas, renales y hepáticas. Es posible 
observar vasodilatación e hiperemia, edema debido al daño capilar, con caída 
de la presión arterial, lo que a menudo conduce a un estado de choque. 
También ocurre perdida de los movimientos voluntarios, confusión, psicosis, 
delirio, coma y muerte. Otras manifestaciones incluyen cambios de la piel, 
como hiperpigmentaciones y la aparición de líneas transversales blanquesinas 
en la uñas. Algunos compuestos arsenicales, como el trióxido de arsénico, son 
muy irritantes (Ratnaike., 2003). 
 
Tabla 1 Comparación de la toxicidad aguda de los compuestos arsenicales (tomado de Hamdi 
et al., 2009) 
 
11 
 
1.8.2 EFECTOS CRÓNICOS 
Los efectos de la exposición crónica al arsénico dependen de la vía de 
exposición y se presentan en varios sistemas incluyendo piel, sistema 
cardiovascular, vías respiratorias, riñón, hígado y sistema nervioso. El arsénico 
es un agente teratogénico, mutagénico y carcinogénico. Los efectos crónicos 
más importantes se resumen a continuación (Ratnaike, 2003). 
LESIONES CUTÁNEAS 
La exposición crónica al arsénico en el agua de consumo causa lesiones muy 
características; se presentan hipocromías e hipercromías (Fig. 7) 
principalmente en las partes no expuestas del cuerpo, hiperqueratosis 
palmoplantar y papular en cualquier parte del cuerpo, así como lesiones 
ulceradas compatibles con un diagnostico de carcinoma epidermoide (McCarty 
et al., 2007, Rosen et al., 2009). 
 
 
 
 
 
 
ALTERACIONES EN EL SISTEMA CARDIOVASCULAR 
La exposición crónica por inhalación de compuestos de arsénico inorgánico 
afecta el sistema cardiovascular, pues altera las contracciones del miocardio y 
causa arritmias cardiacas. Se presentan dilatación e incremento de la 
permabilidad capilar, lo que ocaciones hipovolemia, hipoproteinemia. 
Fig. 7 Lesiones hipercromicas causadas por el consumo de arsénico en agua por 
periodos muy prolongados (URL-5). 
 
12 
 
En poblaciones expuestas a arsénico en el agua de consumo en Taiwan (Lui et 
al., 2003); Estados Unidos (Peters y Blum, 2003) y la India (Ahmed et al., 2004) 
se han descrito efectos vasculares periféricos caracterizados por cianosis y 
pérdida progresiva de la circulación en las extremidades, que pueden finalizar 
en gangrena seca, mejor conocida como enfermedad del pie negro (States et 
al., 2009). 
MUTAGENICIDAD Y CÁNCER 
El arsénico inorgánico está clasificado por la Agencia Internacional de 
Investigación sobre el Cáncer (IARC) como un agente carcinogénico. Los 
trabajadores expuestos a arsénico por vía aérea presentan un incremento en 
cáncer de pulmón, mientras que la exposición oral a arsénico incrementa el 
riesgo de presentar cáncer de piel, aunque también se presentan tumores en 
vejiga, riñón, hígado y pulmón (Liu et al., 2008, States et al., 2009, Heck et al., 
2009). 
1.9 PRESENCIA DEL ARSÉNICO EN AGUA EN DIFERENTES ESTADOS DE 
LA REPÚBLICA MEXICANA 
 
En México (Fig. 8) se han identificado concentraciones de arsénico en fuentes 
de abastecimiento de agua potable (Baja California Sur, Chihuahua, Coahuila, 
Durango, Guanajuato, Hidalgo y Morelos) que alcanzan valores de 2.348 mg/L, 
rebasando el límite máximo permisible de la Norma Oficial Mexicana, 0.025 
mg/L (NOM-127-SSA1-1994; CNA, 2000). 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Se estima que alrededor de 500,000 habitantes de las zonas rurales que 
habitan los estados anteriormente nombrados se encuentran expuestos a 
concentraciones de arsénico mayores de 0.05 mg/L por el agua que ingieren 
(Del Razo, et al., 1990; Cebrían et al., 1994; Rodríguez et al., 1996). 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 8 Estados de la República Mexicana en la cual se han reportado concentraciones de 
arsénico en fuentes de abastecimientos de agua potable que sobrepasan la norma oficial. 
 
 
14 
 
2 ANTECEDENTES 
 
2.1 MÉTODOS DE ANÁLISIS DEL ARSÉNICO EN AGUA 
 
2.1.1 MÉTODOS CONVENCIONALES 
 
La espectroscopia en línea de absorción atómica con generación de hidruros 
(Flow injection hybride generation atomic absortion spectroscopy, FI-HG-AAS), 
la cual se basa en la conversión del As+3 a un hidruro volátil en presencia de 
borohidruro de sodio, el hidruro generado es arrastrado por una corriente de 
gas inerte (argón ó nitrógeno) a una celda de cuarzo a temperatura elevada en 
la que se realiza la atomización de la muestra, de esta manera los átomos 
tienen la capacidad de absorber una cantidad discreta de energía luminosa de 
una sola longitud de onda (193,7 nm), siendo esta proporcional a la 
concentración de arsénico presente en la muestra (NOM-117-SSA1-1994). 
 
Los métodos con “kits” comerciales más utilizados son: 1) Arsen-test (Merck) el 
cual trabaja a concentraciones menores de 10 µg/L o mayores de 100 µg/L. 
Además, durante su desarrollo se produce gas de arsina que es muy tóxico. 
La parte más débil de éste método es la escala de color y los tubos de reacción 
que son de cristal. 2) Hach, tiene una gama de colores más amplia y la escala 
de concentraciones es entre 10 y 70 µg/L. Los tubos de reacción tienen una 
tapa, la cual atrapa el gas arsina producido en la determinación (Erickson, 
2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
2.1.2 MÉTODOS NO CONVENCIONALES 
 
2.1.2.1 Wagtech Arsenator digital 
 
El Wagtech Arsenator digital (Fig. 9) permite determinar concentraciones de 
arsénico en un intervalo de 2-100 μg/L. A concentraciones mayores de 100 
μg/L se realiza por comparación de tonalidad con una carta estándar de 
colores (100-500 μg/L). 
El equipo utiliza dos reactivos A1 (ácido sulfámico en polvo) y A2 (borohidruro 
de sodio en tableta); dos filtros de prueba, uno en el frasco con etiqueta negra 
el cual está revestido de bromuro de mercurio y el otro en el frasco con 
etiqueta roja que contiene un filtro revestido con yoduro de potasio que actúa 
como depurador y absorbente del exceso de gas arsina liberado en la reacción. 
La prueba se realiza en un recipiente de reacción cerrado y el método químico 
se basa en una variación del método Gutzeit, que consiste en reducir el 
arsénico (V) a arsénico (III) con el ácido sulfámico (Reactivo A1) ya que el 
arsénico presente en la muestra puede encontrarse en estado de oxidación (III) 
y/o (V) y no puede medirse en su forma soluble; posteriormente, se agrega el 
borohidruro de sodio generándose la arsina por acción del hidrógeno 
proveniente de los compuestos arsenicales. La arsina reacciona con un papel 
recubierto de bromuro de mercurio (Br2Hg) formando complejos coloridos. 
(Erickson, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 Fig 9 Método no convencional para la cuantificación de arsénico de la marca Wagtech 
Arsenator Digital Kit (tomadode URL-6) 
 
16 
 
2.1.2.2 BIOSENSORES 
 
Un biosensor ó bioreportero es un dispositivo de medición que está 
conformado por un componente de detección biológico que es capaz de 
reconocer cambios físicos o químicos, unido o acoplado a un elemento de 
transducción que produce una señal medible en respuesta a cambios en el 
ambiente (Daunert et al., 2000). Los biosensores pueden clasificarse en tres 
tipos, basados en el componente de detección: 
 Moleculares 
 Celulares 
 Tisulares 
 
Los biosensores moleculares utilizan componentes subcelulares ó 
macromoléculas como elementos de detección. Estos elementos incluyen 
anticuerpos, ácidos nucleídos, enzimas, canales iónicos y bicapas lipidicas. 
Los biosensores basados en tejidos y células, se obtienen a partir de aislados 
de células enteras (bacterias, animales, plantas) o tejidos intactos (Daunert et 
al., 2000). 
 
Las ventajas de los biosensores moleculares, son su alta especificidad, 
selectividad y reacción rápida. Sin embargo, estos sistemas no proveen 
información verídica sobre la biodisponiblidad del analito. Por otra parte, la 
extracción y aislamiento de macromoléculas acorta su vida, las cuales pueden 
ocasionar reacciones (Daunert et al., 2000). 
 
A través de la ingeniería genética, los biosensores celulares, pueden presentar 
una alta especificidad y selectividad por el analito y ser estables en diversos 
ambientes, incluyendo variaciones en el pH y temperatura. Una de las ventajas 
de estos sistemas es su capacidad de proporcionar datos fisiológicos 
importantes en respuesta al analito, así como su biodisponibilidad (Daunert et 
al., 2000). 
 
17 
 
Los biosensores tisulares se componen de varios tipos de células, estos 
proporcionan datos funcionales del analíto, sin embargo este tipo de sistemas 
son generalmente menos estables y por lo tanto su aplicación es limitada 
(Daunert et al., 2000). Los biosensores celulares se pueden clasificar de 
acuerdo a la respuesta al elemento de detección, como son: cambios en el 
metabolismo celular, pH, expresión de genes alterados en organismos 
genéticamente modificados. 
 
 Estos biosensores basados en la tecnología del DNA recombinante, puede 
provocar una respuesta en presencia del analito por medio del acoplamiento de 
los genes de detección con un reportero por medio de una fusión de genes, la 
cual producirá una señal fácil de medir (Daunert et al., 2000). 
 
Los genes de detección están compuestos por proteínas reguladoras y 
secuencias promotoras de DNA cromosómico o plasmidico. La especificidad de 
estos elementos por el analito, confiere selectividad al sistema, mientras que la 
proteína reportera determina el límite de detección y sensibilidad. Como 
observamos en la figura 10, el analito disponible pasa a través de la membrana 
celular, por transporte activo o pasivo y se une a la proteína reguladora, 
activando así la transcripción del gen reportero que se traduce el mRNA, dando 
así una proteína reportera, esta genera una señal en presencia del sustrato ó 
estimulo externo (Daunert et al., 2000). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.10 Representación esquemática de los eventos celulares que dan lugar a la expresión de la 
proteína reportera; el analito pasa a través de la membrana celular y se une a una proteína 
reguladora, activando la transcripción y traducción del gen reportero, tras la adición un sustrato 
externo se produce una señal fácil de medir (tomado de Daunert et al., 2000). 
 
18 
 
2.1.2.2.1 GENES REPORTEROS Y USOS 
 
La expresión de genes reporteros produce una señal fácil de medir, que puede 
ser distinguida de la actividad de proteínas endógenas. Para usos analíticos, 
los genes reporteros o sus respectivas proteínas a menudo se unen a 
elementos de detección que reconocen al analito y así confiere selectividad al 
sistema, mientras que las proteínas reporteras producen señales, las cuales se 
pueden medir, confiándole una alta sensibilidad. Estos elementos de detección 
pueden ser enzimas, receptores, anticuerpos (Daunert et al., 2000, Van Der 
Meer et al., 2004). 
 
Para que un gen pueda ser usado como reportero, es necesario que cumpla 
algunas condiciones; primero, la cuantificación ó actividad de su expresión 
tiene que ser llevado a cabo usando un ensayo simple. Segundo, la cantidad o 
actividad de la proteína represora tiene que ser el reflejo del analito estudiado. 
 
Se han desarrollado biosensores celulares con genes reporteros en el estudio 
de una amplia variedad de analitos endógenos y exógenos; estos incluyen 
metales pesados tales como el antimonio, arsénico, mercurio, cadmio, cobalto, 
níquel, cromo, cobre y zinc; también compuestos orgánicos (benceno, tolueno, 
xileno, naftaleno), antígenos virales ó bacterianos que afectan el aparato 
respiratorio del hombre y por ultimo una variedad de sustancias endógenas 
que incluyen azucares y aminoácidos. A continuación mencionaremos los 
genes reporteros más usados en biosensores celulares (Daunert et al., 2000). 
 
Cloranfenicol transferasa (CAT) 
 
El CAT es derivado de Escherichia coli, esta fue la primera de las proteínas 
usadas como reporteros en el monitoreo de la transferencia de genes, así 
como identificar y medir mecanismos moleculares de toxicidad asociados a 
carcinógenos (Daunert et al., 2000). 
 
19 
 
β-galactosidasa (β-gal) 
 
Proveniente de Escherichia coli, la β-gal, esta codificada por el gen lac z; la 
enzima cataliza la hidrólisis de β-galactósidos. La β-gal es usada como 
proteína reportera que ha sido utilizada en el estudio de la transcripción y 
traducción genética. Se han desarrollado biosensores con este gen reportero, 
el cual ha permitido identificar una variedad de analitos que incluyen metales 
pesados, sales toxicas, en ambientes naturales (Daunert et al., 2000). 
 
Por medio de la cristalografía de rayos x se ha identificado que la β-gal es un 
tetrámero compuesto por un 40% de β-plagadas, 35% de α-hélices, 13% de 
espirales y un 12 % de horquillas aleatorias. Existen varios métodos de 
detección de para la β-gal, entre las cuales tenemos métodos colorimétricos, 
histoquímicos, fluorescentes, luminiscentes y electroquímicos (Tabla 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Las estrategias de detección dependen del sustrato usado, el más empleado 
es el ONPG (o-nitrofenil β-D-galactopiranósido) para la detección colorimétrica. 
También tenemos al Xgal (5-bromo-4-cloro-3-indolil β-galactósido) que está 
adaptado principalmente a métodos de detección histoquímicos (Daunert et al., 
2000). 
hvCOOHROHFMNOCHORFMNH +−++→+−+ 222
CoAdiacetilCoAacetilacetil
acetilCoACATacetil
CoACATacetilacetilCAT
 CAT 3,1 CAT 1
CAT 1 3
 3CoA 
+−→+−
−↔+−
+−→+
Tabla 2 Proteínas represoras, reacciones químicas y métodos de detección empleados en 
biosensores celulares (modificado de Daunert et al., 2000). 
 
20 
 
Luciferasa bacteriana (Lux) 
 
Luciferasa es el nombre genérico para la enzima que cataliza la reacción de 
emisión de luz. Esta liberación de luz es llevada a cabo por algunos 
organismos que contienen a esta enzima. El término para describir este 
fenómeno se le conoce como bioluminicencia. Los organismos bioluminicentes 
incluyen bacterias, algas e insectos entre otros. En este caso nos enfocaremos 
a la biolumicencia bacteriana, en el que hay tres géneros representativos: 
Vibrio, Photobacterium y Xenorhabdus. La luciferasa bacteriana cataliza la 
oxidación de la flavina mononucleotida reducida (FMNH2) a monoflavina 
oxidada (FMN) en presencia de aldehídos grasos de cadena larga y 
transformándola en oxigeno. Esta reacción da como resultado la emisión de 
una luz azul-verdosa. 
 
Todas la luciferasa bacterianas son proteínas heterodiméricas, compuestas por 
dos subunidades, una α (40KDa) y una β (37KDa) cuya secuencia de 
aminoácidos puede variar hasta un 45% y 55% entre especies bacterianas. 
(Daunert et al., 2000, Meighen., 1991). 
 
Las subunidadesα y β de la luciferasa bacteriana son codificadas por los 
genes luxA y luxB respectivamente, localizandose en el operón lux, donde 
además están tres genes adicionales (luxC, luxD, luxE) que codifican 
proteínas asociadas para formar una reductasa para la síntesis de ácidos 
grasos así como su reciclado. Estos cinco genes están conservados en todas 
las especies identificadas de este grupo bacteriano. La expresión de los genes 
luxA y luxB en una célula hospedera, es suficiente para una señal de 
bioluminicencia, sin embargo la expresión de los cinco genes representa una 
ventaja ya que no se requiere de la adición de un sustrato (Meighen, 1991). 
 
 
 
21 
 
Al fusionar el operón lux con sus respectivos promotores y la expresión del 
mismo en células hospederas ha permitido aplicar como un marcador de 
exposición de algunos contaminantes como metales pesados, compuestos 
orgánicos y el ion nitrato, en bioensayos con células completas. Aunque la 
luciferasa bacteriana es útil para una detección muy precisa, su aplicación es 
limitada en sistemas con células eucariotas, debido a que estas enzimas son 
sensibles a temperaturas superiores a los 30ºC (Daunert et al., 2000). 
 
Proteína verde fluorescente (GFP) 
 
La Proteína verde fluorescente (GFP) es una fotoproteína que ha sido aislada y 
clonada de la medusa Aequorea victoria. La principal ventaja de la GFP como 
proteína reportera es su autofluorescencia, su uso no requiere la adición de 
cofactores o sustratos exógenos para producir luz. Esta es el resultado de la 
formación de un cromóforo imidazolinona. La formación de este cromóforo 
ocurre por modificaciones pos-traduccionales, resultado de la ciclización de 3 
residuos de aminoácidos de la proteína (Ser65-Tyr66-Gly67) (Daunert et al., 
2000). 
 
La GFP tiene numerosas cualidades lo que la hacen ideal como gen reportero, 
esta se ha utilizado para medir la expresión de genes, así como identificar 
células transformadas, también se ha usado como reportero en biosensores 
celulares con fibra óptica para la detección de L-arabinosa. Este sistema es 
altamente selectivo ya que es capaz de discriminar esteroisómeros de D-
arabinosa de una amplia variedad de pentosas y hexosas (Daunert et al., 
2000). 
 
 
 
 
 
 
22 
 
2.1.2.2.2 VENTAJAS Y DESVENTAJAS 
 
La mayor ventaja de los biosensores es tienen la capacidad de detectar la 
biodisponiblidad del contaminante, lo que permite una evaluación más precisa 
del sitio y de los riesgos potenciales involucrados (Strosnider, 2003). 
 
Además los biosensores son rápidos, seguros, menos costosos esta al 
compararlos con los métodos químicos convencionales: tal es el ejemplo del 
espectrofotómetro de absorción atómica. Los resultados obtenidos a partir de 
los biosensores son comparables con los métodos tradicionales; además, 
pueden ser aplicados en trabajo de campo (Strosnider, 2003). 
 
Sin embargo, el funcionamiento de estos sistemas es limitado, además es 
difícil determinar las condiciones del procedimiento en el rendimiento de los 
biosensores, tales como temperatura, pH, tiempo de incubación, medio de 
cultivo, reactivos empleados, sin embargo con la ayuda de la ingeniería 
genética se pueden hacer algunas mejoras a estos sistemas, superando así 
algunos de estos factores (Strosnider, 2003). 
 
2.1.2.3 BIOSENSOR PARA LA DETECCIÓN DE ARSÉNICO EN AGUA (E. 
coli modificada) 
 
El uso de biosensores microbianos puede ser una alternativa para la detección 
de arsénico en agua potable, para tal efecto se utilizó a Escherichia coli, la cual 
posee un mecanismo de resistencia natural al arsenito, arsenato. Que esta 
codificada en el plásmido de E. coli R773, este tiene un operón denominado 
ars, formado por una serie de genes estructurales (arsA, arsB y arsC) y dos 
genes reguladores (arsR y arsD) (Fig. 11). 
 
 
23 
 
La expresión de los genes reguladores da como resultado ArsR la cual controla 
los niveles básales de la proteína de expresión y ArsD controla los niveles 
máximos de esta misma proteína (Daunert et al., 2000, Stoker et al., 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
En ausencia de arsenito, el represor ArsR está unido al sito operador/promotor 
del operón ars y evita la expresión de los genes estructurales. Cuando el 
arsenito entra en la célula por una arsenito reductasa, interacciona con ArsR 
uniéndose a ésta, ocasionando un cambio en la conformación del represor lo 
que trae como consecuencia la disociación de ArsR del sito operador/promotor 
y subsecuentemente hay una elevada expresión de los genes del operón ars 
(Stoker et al., 2003). 
 
Las bacterias nativas contienen el operón ars, el cual no produce por si solo 
una señal analítica útil, por tal motivo Stoker et al (2003) adicionaron por medio 
de técnicas de biología molecular un marcador que estando unido al gen arsR 
produzca la expresión de una proteína fácilmente medible (Stoker et al., 2003). 
 
Fig 11 Representación esquemática del operón de resistencia a arsénico, está conformado 
por tres genes estructurales (arsA,arsB, arsC) y dos genes reguladores (arsD , arsR). 
 
24 
 
Actualmente, el uso de biosensores posee una alta demanda debido a su 
exactitud, precisión y facilidad de uso, así como a su prácticamente nula 
generación de productos tóxicos. (Erickson, 2003; Stocker et al., 2003). 
 
2.1.2.3.1 CONSTRUCCIÓN DE LOS BIOSENSORES 
 
BIOSENSOR CON EL GEN REPORTERO Lac Z 
 
El biosensor fue construido en E.coli DH5α. La parte sensible de sensor deriva 
del gen arsR proveniente del plásmido pBGD23, que contiene clonado el 
fragmento del operón de resistencia al arsénico. Usando la reacción en cadena 
de la polimerasa (PCR) se amplio el gen arsR del plásmido pBGD23 
incluyendo el promotor arsR y excluyendo la parte arsD. 
 
Los iniciadores usados en la PCR fueron: ArsRfor640 (5´ccc ttt cgt ctt ttc caag 
3´; 129 pb rioarriba del inicio de arsR e introduciendo un sito HindIII) y 
ArsRrev1120 (5´aac ata tga att cag gca aat ttt ttag 3´, obteniendo un codón de 
terminación de arsR e introduciendo un sitio único EcoRI). Los fragmentos 
fueron clonados dentro de pGEM-T-Easy (Promega Corp., Catalys AG, 
Wallisenllen, Switzerland) produciendo ArsR regulable en la expresión del gen 
lac z. El fragmento fue recuperado del plásmido cortando con HindIII y EcoRI. 
El fragmento arsR fue ligado en pMV132, que contiene los promotores de la 
β galactosidasa. Después se llevo a cabo la transformación en E. coli dando 
como producto al plásmido pMV-arsR. 
 
Para reducir la formación en la expresión del promotor arsR, fue clonada una 
segunda copia de DNA del sito de unión a ArsR y su respectivo gen reportero 
(lac Z). El sito de unión de ArsR fue amplificado por PCR con los iniciadores 
001126 (5´gaa ttc caa gtt atc tca cct acc 3´, 124 pb río arriba del inicio de 
arsR) y 010834 (5´aat tca cata ac caa aaa cgc ata tga tg 3´, 52 pb rio arriba de 
arsR). 
 
25 
 
Posteriormente el fragmento fue clonado con pGEM-T-Easy, el fragmento de 
60 pb fue recuperado y cortado con EcoRI. El fragmento fue insertado en el 
plásmido pPR-arsR (proveniente de la fusión de arsR con una proteína de 
fluorescencia verde ó gfp), dando origen a pPR-arsR-ABS. 
 
Para la obtención del plásmido pMV132-arsR-ABS (Fig. 12), el cual se utilizó 
en ese estudio, fue cortado el plasmido pPR-arsR-ABS con SphI y SpeI 
recuperando el fragmento arsR-ABS. Posteriormente este fragmento se ligó al 
plásmido pMV132 cortando con EcoRI (Stocker et al., 2003). 
 
 
 
 
BIOSENSOR CON LOS GENES LUX A y LUX B COMO REPORTEROS 
 
El biosensor fue construido en E.coli DH5α. La parte sensible de sensor deriva 
del gen arsR proveniente del plásmido pBGD23, que contiene clonado el 
fragmento del operón de resistencia al arsénico. Usando la PCR fue 
amplificado el gen arsR del plásmido pBGD23 incluyendo el promotor arsR y 
excluyendo la parte arsD. 
 
Los iniciadores usados fueron:ArsRfor640 (5´ccc ttt cgt ctt ttc caag 3´; 129 pb 
rioarriba del inicio de arsR e introduciendo un sito HindIII) y ArsRrev1120 
(5´aac ata tga att cag gca aat ttt ttag 3´, obteniendo un codón de terminación 
de arsR e introduciendo un sitio único EcoRI). 
Fig. 12 Representación esquemática del plásmido de E. coli pMV132-arsR-ABS 
(Stocker et al., 2003). 
 
26 
 
Los fragmentos fueron clonados dentro de pGEM-T-Easy (Promega Corp., 
Catalys AG, Wallisenllen, Switzerland) produciendo ArsR regulable en la 
expresión del gen reportero. El fragmento fue recuperado del plásmido 
cortando con SphI y SpeI. El fragmento arsR fue insertado en pJAMA8, cortado 
con SphI y XbaI, el cual contiene promotores de los genes de la luciferasa 
(genes lux A y lux B) provenientes de Vibrio harveyi. 
 
Para reducir la formación en la expresión del promotor arsR, fue clonada una 
segunda copia de DNA del sito de unión a ArsR y su respectivo gen reportero 
(lux A y lux B). El sito de unión de ArsR fue amplificado por PCR con los 
iniciadores 001126 (5´gaa ttc caa gtt atc tca cct acc 3´, 124 pb río arriba del 
inicio de arsR) y 010834 (5´aat tca cata ac caa aaa cgc ata tga tg 3´, 52 pb rio 
arriba de arsR). 
 
Posteriormente el fragmento fue clonado con pGEM-T-Easy, el fragmento de 
72 pb fue recuperado y cortado con EcoRI. El fragmento se insertó en el 
plásmido pPR-arsR (proveniente de la fusión de arsR con una proteína de 
fluorescencia verde ó gfp), dando origen a pPR-arsR-ABS. Para la obtención 
del plásmido pJAMA-arsR- ABS, el cual se utilizó en este estudio, fue cortado 
el plásmido pPR-arsR-ABS con SphI y SpeI recuperando el fragmento arsR-
ABS. Posteriormente este fragmento fue ligado al plásmido pJAMA8 cortando 
con SphI y XbaI (Fig.13) (Stocker et al., 2003). 
 
 
 
 
 
Fig. 13 Representación esquemática del plásmido de E. coli pJAMA-arsR-ABS 
(Stocker et al., 2003). 
 
27 
 
2.1.2.3.2 FUNDAMENTO DE LOS BIOSENSORES 
 
Como podemos observar en la figura 14B, el gen arsR controla la expresión de 
los genes reporteros (luxA, luxB y lacZ), así como la expresión de los mismos. 
La expresión del gen nos da como resultado una proteína represora (ArsR), la 
cual se une en ausencia de arsenito a su sitio específico que se encuentra río 
arriba del promotor. Cuando la célula entra en contacto con el arsenito, este se 
une a ArsR cambiando su conformación ocasionando que la proteína se 
separe del sito de unión permitiendo que la RNApol transcriba los genes 
reporteros los cuales llevan a cabo la expresión de la luciferasa y/o β 
galactosidasa (Stocker et al., 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 14 Principio del biosensor de E. coli pJAMA-arsR-ABS. (A) La proteína ArsR regula la expresión 
de los genes reporteros, esta se encuentra unida al sito operador/ promotor de arsR, cuando no hay 
presencia de arsénico. (B) Cuando se detecta la presencia de arsénico; ésta se une a ArsR 
cambiando la conformación de la proteína, haciendo que esta se despegue del sitio operador 
/promotor para la expresión de los genes reporteros (luxA, luxB y lacZ) (Stocker et al., 2003). 
 
 
28 
 
En la figura 14A, el principio es similar, la diferencia radica que en este caso se 
encuentran dos sitios de unión a ArsR, los cuales están ubicados, uno río abajo 
de arsR y el segundo se encuentra río arriba del mismo gen. Cuando la célula, 
no detecta la presencia de arsenito, la proteína represora esta unida en los dos 
sitios antes mencionado impidiendo la transcripción y subsecuentemente la 
síntesis de los genes reporteros (Stocker et al., 2003). 
 
La cantidad sintetizada a partir del gen LacZ ó de los genes lux A y B 
dependerá de: 
 
a. La cantidad de arsenito detectada por las células. 
b. El tiempo de exposición de las células al arsenito. 
c. La constitución genética de la célula de E.coli usada. 
 
La actividad de β-galactosidasa puede ser cuantificada de diferentes maneras, 
una de las más simples es usando un sustrato específico para la enzima que 
permita la formación de color (Fig. 15). Este, puede ser medido un 
espectrofotómetro (Stocker et al., 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 15 Representación esquemática de la reacción que lleva a cabo la β-
galactosidasa en presencia del ONPG (URL-7). 
 
29 
 
La actividad de luciferasa puede ser cuantificada por medio de una reacción de 
luminiscencia (Fig. 16). El sustrato específico para la enzima es el n-decanal 
que en presencia de oxigeno produce un ácido, agua y luz (Meighen, 1991). 
Este, puede ser medido empleando un luminómetro (Fluoroskan Ascent FL, 
Thermo Electron Corporation) el cual posee un sistema óptico (Fig. 17), y 
consta de una lámpara de halógeno, un filtro de excitación, un espejo y un 
fotomultiplicador, que capta la luz emitida desde el micropozo y reflejada a 
través de un espejo que la desvía hacia un filtro de excitación llegando así al 
fotomultiplicador, el cual nos dará una señal de lectura (Thermo Electron 
Corporation). 
 
Luciferasa + n- decanal (C10H20O) + O2 H2O + R-COOH + hv 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 16 Reacción que lleva a cabo la luciferasa en presencia de su sustrato (n-decanal). 
Fig. 17 Sistema óptico del luminómetro Fluoroskan Ascent Fl ( Thermo Electron Corporation). 
Lámpara de halógeno 
Filtro de excitación 
Espejo 
Micropozo 
Fotomultiplicador 
 
30 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 JUSTIFICACIÓN 
 
 Se ha reportado que en diferentes regiones de nuestro país el agua de 
consumo excede los niveles de Arsenico permitidos; esto aunado a los 
reportes que demuestran que la exposición a este elemento a través de la 
ingesta de agua de consumo, da lugar a cambios en la pigmentación y textura 
de la piel; a enfermedades vasculares periféricas y a trastornos 
gastrointestinales. Se considera necesario evaluar las concentraciones de este 
metal con técnicas que ofrecen un respuesta mas rápida, eficaz y segura, 
siendo una aopcion el uso de biosensores microbianos (E.coli modificada), ya 
que los métodos convencionales (espectrofotómetro de absorción atómica y 
“kints” comcerciales) producen sustancias toxicas y peligrosas durante el 
proceso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
 
 
 
 
4 OBJETIVO GENERAL 
 
 Implementar el uso de biosensores microbianos (Escherichia coli) que nos 
permitan la cuantificación de arsénico en muestras de agua de diversos 
orígenes. 
 
 
 
 
4.1 OBJETIVOS PARTICULARES 
 
 Encontrar las condiciones adecuadas para la cuantificación de arsénico en 
agua de una manera rápida, eficaz y segura con las cepas E. coli pMV132-
arsR-ABS y E. coli pJAMA-arsR-ABS. 
 
 Evaluar la concentración de arsénico en las muestras problema con los 
biosensores y comparar los resultados con los obtenidos a través de las 
técnicas en las cuales se utilizan el Wagtech Arsenator digital ó el 
espectrofotómetro de absorción atómica con generación de hidruros. 
 
 Desarrollar pruebas semicualitativas para la detección de arsénicos para la 
detección de arsénico en agua, en campo. 
 
 
 
 
 
 
32 
 
5 MATERIALES Y MÉTODOS 
 
5.1 MUESTRA BIOLÓGICA 
 
Se utilizaron las cepas modificadas de E. coli pMV132-arsR-ABS y E. coli 
pJAMA-arsR-ABS, las cuales poseen genes reporteros Lac Z y Lux AB, 
respectivamente, ambas cepas fueron proporcionadas por el Dr. Jan Roelof 
Van Der Meer del Instituto Federal Suizo de Ciencia y Tecnología Ambiental, 
Dübendorf Suiza. 
 
5.2 MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO 
 
Se empleo el medio Luria (L) (ver anexo) para mantener y propagar las cepas 
bacterias, las cuales fueron utilizadas para las determinaciones de arsénico en 
agua. 
 
5.3 SOLUCIÓN TIPO DE ARSÉNICO 
 
Se preparó una serie de diluciones a partir de una solución tipo de Arsénico, la 
cual contiene 1 g de As/ L (13 mM) (J. T. Baker, Deventer, The Netherlands) 
las concentraciones utilizadas fueron: 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM.Las diluciones se hicieron con agua de grado II para HPLC (Harms et al., 2005). 
 
5.4 MUESTRAS 
 
Cada muestra fue recolectada en dos envases de plástico con tapones del 
mismo material de un litro, uno se ocupo para la cuantificación de arsénico de 
acuerdo a la norma oficial mexicana (NOM-117-SSA1-1994) y el otro se utilizo 
para la determinación de arsénico usando los biosensores y el Wagtech 
Arsenator digital. 
 
33 
 
El muestreo se realizó tomando un poco del agua que se va a analizar, se 
cierra el envase agitandose fuertemente para enjuagar, esta operación se 
realizó dos o tres veces y enseguida se tomó la muestra, la cual se colocó en 
una hielera con bolsas refrigerantes o bolsas de hielo para su transporte al 
laboratorio. Las muestras provinieron de lugares donde se ha reportado ó no la 
existencia de arsénico en el agua (Tabla 3 y Fig.18) (Ngo et al., 2002; CNA, 
2000). 
 
 
 
No. 
Muestra Lugar de procedencia 
M1 Delegación Gustavo A. Madero, México, D.F 
M2 Cuemanco, Delegación Xochimilco, México, D.F 
M3 Ecatepec, Estado de México. 
M4 Delegación Miguel Hidalgo, México, D.F 
M5 Chapultepec, Delegación Miguel Hidalgo, México, D.F 
M6 Cuemanco, Delegación Xochimilco, México, D.F 
M7 Hígado, Pachuca, México. 
M8 Yurecuaro, Michoacán, México. 
M9 Tenancingo, Toluca, Estado de México. 
M10 Ixtapa de la sal, Toluca, Estado de México. 
M11 Cuautitlan Izcali, Estado de México. 
M12 Ciudad de Nezahualcoyotl, Estado de México. 
M13 Ciudad de Nezahualcoyotl, Estado de México. 
M14 Torreón, Coahuila, México. 
M15 Torreón, Coahuila, México. 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 3A Muestras de agua recolectadas de distintos lugares de la República Mexicana y 
Guatemala 
 
34 
 
 
 
 
 
No. 
Muestra Lugar de procedencia 
M16 Torreón, Coahuila, México. 
M17 Torreón, Coahuila, México. 
M18 Torreón, Coahuila, México. 
M19 Torreón, Coahuila, México. 
M20 Mixco, Guatemala, Centro América. 
M21 Mixco, Guatemala, Centro América. 
M22 Torreón, Coahuila, México. 
M23 Torreón, Coahuila, México. 
M24 Torreón, Coahuila, México. 
M25 Torreón, Coahuila, México. 
M26 Torreón, Coahuila, México. 
P6 Torreón, Coahuila, México. 
P10 Torreón, Coahuila, México. 
P23 Torreón, Coahuila, México. 
P32 Torreón, Coahuila, México. 
P65 Torreón, Coahuila, México. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 3B Muestras de agua recolectadas de distintos lugares de la República Mexicana y 
Guatemala 
 
35 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5.5 VERIFICACIÓN DE LA PUREZA DE LAS CEPAS 
 
Para la cepa E. coli pMV132-arsR-ABS, se tomó una asada y se sembró por 
estría cruzada en medio L con 50 µg/mL ampicilina, adicionado con Xgal (20 
µg/mL) a 37ºC por 48 horas. Posteriormente se revisó el crecimiento y la 
morfología de las colonias, estas hidrolizan al X-gal por medio de la β-
galactosidasa a galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxindol. Este último es 
oxidado a 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-indigo, un compuesto azul insoluble. 
Fig.18 Ubicación topográfica de las muestras manejadas en el estudio 
http://es.wikipedia.org/wiki/Galactosa�
 
36 
 
La cepa E. coli pJAMA-arsR-ABS se sembró por estría cruzada en medio L 
(ver anexo) con y sin de ampicilina (50 µg/mL) a 37ºC por 48 horas. 
Posteriormente se revisó el crecimiento y la morfología colonial. Se realizó el 
mismo procedimiento con una cepa silvestre de E. coli como testigo. 
 
5.6 CONSERVACIÓN DE LAS CEPAS 
 
Para mantener las cepas de E. coli pMV132-arsR-ABS y E. coli pJAMA-arsR-
ABS se inoculó una asada de cada microorganismo en 5 mL de medio L con 
50 µg/mL de ampicilina a 37ºC, se dejó en un cultivo de toda la noche, 
posteriormente se tomó un mL del cultivo y se transfirió a un matraz 
Erlenmeyer que contenía 50 mL del mismo medio el cual se incubó a 37ºC en 
agitación, ajustando a una concentración celular de 1 x 108 cel/mL. 
 
El cultivo se colocó en un baño de hielo durante 15 min, posteriormente se le 
adicionó 10 mL de glicerol frío (87% v/v), la mezcla se dividió en alícuotas de 
1.0 mL en tubos eppendorf de 2 mL; estos se transfirieron a una mezcla 
hielo/etanol durante un minuto, posteriormente se colocó en un congelador a -
72ºC para su conservación. 
 
5.7 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN MUESTRAS DE AGUA 
UTILIZANDO LA CEPA DE E. coli pMV132-arsR-ABS 
 
La metodología utilizada fue propuesta, por Van Der Meer et al., 2004 se 
hicieron las modificaciones necesarias para adaptarla a nuestras condiciones 
de trabajo. 
 
Se tomó un vial congelado de la cepa E. coli pMV132-arsR-ABS la cual se 
descongelo a temperatura ambiente, se realizó una dilución 1:10 con medio L 
fresco. En un tubo eppendorf, se adicionaron 500 µL de la suspensión celular 
diluida y 500 µL de la muestra problema. 
 
37 
 
Los ensayo se realizaron en tubos de vidrio de 13 x 100 mm y se incubaron a 
37°C por 60 minutos en una plataforma rotatoria a 120 rpm, posteriormente se 
colocó en baño de hielo por 10 minutos, después se centrifugó a 13 000 rpm 
por 2 minutos, se elimino el sobrenadante y se adicionaron 500 µL del 
regulador P frio (ver anexo). 
 
Se resuspendieron las células nuevamente con 500 µL de regulador P frio y se 
centrifugaron a 13 000 rpm por 2 minutos, se desecho el sobrenadante e 
inmediatamente se les adicionó 100 µL de regulador P frio. El paquete celular 
se resuspendió; de la suspensión se tomaron 50 µL colocándose en un tubo 
eppendorf nuevo y se les adiciono 700 µL de regulador Z (ver anexo), 80 µL de 
cloroformo y 40 µL de SDS al 0.1 % (ver anexo); se agitó en vortex a máxima 
velocidad por 20 segundos y se incubó 20 minutos a temperatura ambiente, 
después se agregaron 150 µL de ONPG 4 mg/mL (ver anexo) y se incubó 
nuevamente a 28°C, observándose la aparición de color, inmediatamente se 
detuvo la reacción agregando 400 µL de carbonato de sodio 1M (ver anexo). 
Por último se extrajo el sobrenadante y se midió la D.O en un 
espectrofotómetro (BioMateTM 3 Series Spectrophotometers, Termo Spectronic) 
a 420 nm. 
 
Las modificaciones que se hicieron fueron las siguientes: 
 
Caso 1 
 
Se cambió el tiempo de incubación al momento de agregar la muestra con 
arsénico a las células pasando de 60 a 120 min y se decido fijar un tiempo de 
incubación después de la permeabilización de las células con 80 µL de 
cloroformo y 40 µL de SDS al 0.1 %, que fue de 30 minutos, transcurrido ese 
tiempo se agrego 150 µL de ONPG 4 mg/mL, en este punto fue requerido 
establecer un tiempo de incubación de 5 minutos a 28°C. 
 
 
38 
 
Caso 2 
 
Las condiciones antes mencionadas fueron las mismas a excepción del tiempo 
de incubación después de la adición de ONPG 4 mg/mL que fue de 10 minutos 
a 28°C. 
 
Caso 3 
 
El tiempo de incubación tras la permeabilización de las celular, no cambio, solo 
se modificó el tiempo de incubación tras la adición del ONPG 4 mg/mL que fue 
de 15 min a 28°C. 
 
Caso 4 
 
Se decidió eliminar el SDS al 0.1% en la permeabilización de las células, así 
como cambiar el tiempo de incubación después de la adición del ONPG 4 
mg/mL, que fue de 10 min. 
 
En todos los casos, se construyeron curvas tipo con diferentes 
concentraciones de arsénico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM) a partir 
de una solución tipo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
39 
 
5.8 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN MUESTRAS DE AGUA 
UTILIZANDO LA CEPA DE E. coli pJAMA-arsR-ABS 
 
La técnica propuesta por Stocker et al.,(2003) fue también modificada hasta 
obtener resultados confiables de acuerdo a nuestras condiciones de trabajo. 
Se tomó uno de los tubos congelados de la cepa E. coli pJAMA-arsR-ABS, se 
colocó en un baño con agua a 25°C y una vez descongelada, en una 
microplaca negra (Corning Incorporated, Costar) de 96 pozos se colocaron 50 
µL de las células descongeladas en cada uno de los pozos a utilizar, en esto se 
agregaron 100 µL de cada una de las concentraciones que compone la curva 
tipo la cual fue elaborada a partir de una solución tipo de arsénico (J.T. Baker, 
Deventer, The Netherlands) y las muestras problema. La microplaca se cubrió 
e incubó a 35°C en agitación (190 rpm) por treinta minutos. Posteriormente se 
adicionaron 25 µL de n- decanal 2mM a cada uno de los pozos (ver anexo). La 
microplaca se incubó nuevamente con agitación durante 3 minutos. Se midió la 
intensidad de luz con un tiempo de integración de 10 segundos en el 
luminómetro (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Electron Corporation). Los 
resultados de las muestras problema, se interpolaron en la curva tipo (0, 0.05, 
0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM de arsénico) para obtener la concentración de 
arsénico, la cantidad de arsénico presente en las muestras es directamente 
proporcional a la cantidad de luz emitida. 
 
Las modificaciones realizadas a la técnica fueron las siguientes: 
 
Caso 1 
 
Se realizó una dilución 1:2.5 de la suspensión bacteriana descongelada, 
tomando de ella 25 µL. El tiempo de incubación se incremento de 30 minutos a 
una hora a 30°C. 
 
 
 
40 
 
Caso 2 
 
Las condiciones antes mencionadas se conservaron excepto el tiempo de 
incubación que fue de dos horas a 30°C. 
 
Como se ha mencionado, los resultados obtenidos a partir de muestras 
problemas, para ambas cepas de E. coli, se compararon con resultados 
obtenidos a través de técnicas usadas por normas oficiales y aquellas 
recomendadas por las OMS, como son la espectrofotometría de absorción 
atómica con generación de hidruros y el Wagtech Arsenator digital. 
 
 
5.9 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN AGUA POR 
ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON GENERACIÓN 
DE HIDRUROS. 
 
 
Para esta metodología se construyó una curva tipo con diferentes 
concentraciones de arsénico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM), a las 
cuales previamente se les adicionó ácido nítrico concentrado hasta obtener un 
pH menor a 2, posteriormente se siguió el protocolo marcado por la noma 
oficial mexica (NOM-117-SSA1-1994) empleando un espectrofotómetro de 
absorción atómica (Marca Varian, Modelo Spectra AA220). Este procedimiento 
fue aplicado también a las muestras problema. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
5.10 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN AGUA UTILIZANDO EL 
“WAGTECH ARSENATOR DIGITAL” 
 
Para este método se procedió a agregar 50 mL de la muestra en un matraz de 
125 mL, posteriormente se adicionó cuidadosamente un sobre con el reactivo 
A1 (ver anexo) evitando que el reactivo quedara adherido a las paredes del 
matraz y mezclar hasta disolver el reactivo. Se colocaron los filtros respectivos 
en la tarjeta negra y roja, estos capturaran el producto de la reacción, y se 
pondrán en la trampa de arsénico, se agrego una pastilla con el reactivo A2 
(ver anexo) en el matraz e inmediatamente se tapó con la trampa de arsénico y 
se dejo incubar durante 20 min. Transcurrido este tiempo, se retiro la tarjeta 
negra y se colocó en la ranura del fotómetro que previamente se calibró 
usando una tarjeta negra con un filtro nuevo, una vez hecho esto se espero el 
resultado (Fig. 19). Los pasos mencionados anteriormente fueron aplicados 
tanto a las muestras problemas así como a la elaboración de una curva tipo 
con diferentes concentraciones de arsénico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 
µM). 
 
 
 
Fig. 19 Método químico de la marca Wagtech Arsenator digital para la cuantificación de 
arsénico en agua. 
 
42 
 
5.11 PRUEBA SEMICUANTITATIVA PARA LA DETECCIÓN DE ARSÉNICO 
EN AGUA EN CAMPO 
 
 
Se tomó uno de los tubos congelados de la cepa E. coli pJAMA-arsR-ABS, se 
colocó en un baño con agua a 25°C, una vez descongelada la muestra se 
sembró por estría cruzada en medio L con ampicilina (100 µg/mL) y se incubó 
a 37°C por 48 horas, transcurrido ese tiempo se tomó una colonia y se sembró 
en 50 mL de medio L con ampicilina (100 µg/mL) posteriormente se incubó a 
37°C por 16 horas obteniendo una densidad celular de 1.8 x 1010 cel/mL . El 
cultivo se centrifugó a 5000 rpm por 10 min, se eliminó el sobrenadante al cual 
se le adicionaron 2 mL de regulador de fosfatos pH 7, se resuspendió el 
paquete celular y se volvió a centrifugar, se eliminó el sobrenadante y se 
obtuvo el paquete celular. Por otro lado, se preparo una mezcla de los 
siguientes soportes (Stocker et al., 2003): 
 
Soporte Cantidad 
Gelatina al 15% 400 µL 
Peptona de caseína al 1% 250 µL 
Ascorbato de sodio al 1% 200 µL 
Extracto de levadura al 1% 250 µL 
Rafinosa al 5% 300 µL 
Glutamato al 5% 300 µL 
 
Todo se homogenizó perfectamente, posteriormente. A estos se le adicionó por 
separado 1.5, 3 y 9 µL de la suspensión celular y se impregnaron en tiras de 
papel Whatman 3M de 5 cm x 0.45 mm estériles, las tiras se dejaron secar por 
2 hrs, después se sumergieron en 100 µL de cada una de las soluciones que 
contenían arsénico (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µM de arsénico). Se 
incubaron a 60 min a temperatura ambiente. Pasado este tiempo se le adicionó 
a cada tira 20 µL de Xgal 1 mg/mL ó 5 mg/mL, se incubó por 30 min a 
temperatura ambiente. 
 
43 
 
Se observó la presencia de un color azul índigo, la intensidad fue directamente 
proporcional a la cantidad de arsénico presente en la muestra. 
 
5.12 PARÁMETROS ESTADÍSTICOS EMPLEADOS (VER ANEXO) 
 
Los parámetros empleados en el análisis estadísticos de las curvas tipo son: 
intervalo de linealidad, intervalo de trabajo, lectura estadística del blanco (YB), 
sensibilidad (S), error estándar de la regresión (Sy/x), limite de detección (LD), 
limite de cuantificación (LC), limite de decisión (Ld) y centro de gravedad de la 
recta (Xprom,Yprom) (Miller y Miller, 2002). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
44 
 
6 RESULTADOS 
 
 
6.1 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN MUESTRAS DE AGUA 
UTILIZANDO LA CEPA DE E. coli pMV132-arsR-ABS 
 
En las figuras 20, 21, 22 y 23, se muestran las diferentes curvas tipo obtenidas 
al modificar el método propuesto por Van Der Meer et al.,(2004) empleando la 
cepa de E. coli pMV132-arsR-ABS, para así llegar a las condiciones de trabajo 
que nos dieron los datos más confiables (Fig. 23). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 20 Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevó a cabo con un tiempo 
de incubación de 5 min a 28°C con la adición de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el 
producto de 3 réplicas del ensayo. 
 
45 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 22 Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo de 
incubación de 15 min a 28°C con la adición de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el 
producto de 3 réplicas del ensayo 
Fig. 21 Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo de 
incubación de 10 min a 28°C con la adición de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el 
producto de 3 réplicas del ensayo 
 
46 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6.2 CUANTIFICACIÓN DE ARSÉNICO EN MUESTRAS DE AGUA 
UTILIZANDO LA CEPA DE E.coli pJAMA-arsR-ABS 
 
Las figuras 24 y 25, muestran las variantes a las condiciones propuestas por el 
método de Stocker et al,(2003) empleando la cepa de E. coli pJAMA-arsR-
ABS, observándose una curva tipo con una r2 de 0.997, por lo que 
consideramos que es confiable. 
 
 
 
 
Fig. 23 Curva tipo de E. coli pMV132-arsR-ABS, el ensayo se llevo a cabo en un tiempo de 
incubación de 10 min a 28°C sin la adición de SDS al 0.1%, los datos mostrados son el 
producto de 3 réplicas del ensayo 
 
47 
 
Fig. 24 Curva tipo de E. coli pJAMA-arsR-ABS, la reacción se llevó a cabo en un 
tiempo de incubación una hora a 30°C en agitación, los datos mostrados son el 
producto de 3 réplicas del ensayo. 
Fig. 25 Curva tipo de E. coli pJAMA-arsR-ABS, la reacción se llevó a cabo en un 
tiempo de incubación de dos horas a 30°C en agitación, los datos mostrados son el 
producto de 3 réplicas del ensayo.