PA-rez-Cruz-Oscar

Vista previa del material en texto

Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 
 INGENIERO BIOTECNÓLOGO 
 
 
 
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLO GÍA 
 
PROYECTO: 
 
“Grado de corrimiento del marco de lectura en funci ón al codón 
hambriento en la traducción del mRNA de una cepa de ficiente de 
peptidil-tRNA hidrolasa” 
 
PRESENTA: 
 
OSCAR PÉREZ CRUZ 
México, D. F. Mayo 2006 
 
DIRECTOR EXTERNO: Dr. Gabriel Guarneros Peña 
 
DIRECTOR INTERNO: Dra. Carmen Oliver Salvador 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
¨ El hombre encuentra a Dios detrás de cada puerta que la ciencia logra abrir ¨. 
 
Albert Einstein 
 
 
 
 
¨ El guerrero más poderoso es aquel que logra vencerse a sí mismo ¨. 
 
Nezahualcóyotl 
 
 
 
 
¨ Quien ha visto la esperanza no la olvida ¨. 
 
Octavio Paz 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
AAAAGRADECIMIENTOGRADECIMIENTOGRADECIMIENTOGRADECIMIENTOSSSS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo se realizó en el Centro de Investigaciones y de Estudios Avanzados 
del IPN en el Laboratorio 3 de Genética y Biología Molecular bajo la dirección del Dr. 
Gabriel Guarneros Peña, a quien agradezco infinitamente el tiempo, dedicación, 
facilidades y confianza depositadas en mí. 
 
Gracias a la M en C. Eva Jacinto Loeza quien me apoyo incondicionalmente en este 
trabajo y de quien recibí el fruto del conocimiento y la práctica. 
 
Gracias al apoyo del M en C Serafín Vivanco Domínguez quien colaboró para la 
culminación de éste trabajo. Gracias a la M en C Eva Martínez por sus tips, consejos y 
aliento. Gracias a todo el laboratorio por el apoyo brindado para el termino del presente 
trabajo. 
 
Gracias al apoyo del Técnico en Investigación Aurelio González Hernández del 
departamento de Genética y Biología Molecular. 
 
 
 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Gracias a la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología la cuál me ha dado 
las bases para la realización de éste proyecto y quien me proporcionó las armas para 
protegerme en el campo de batalla. 
 
Agradezco el apoyo de mi asesor interno la Dr. Carmen Oliver Salvador, quién ha sido 
una maravillosa persona y me apoyó en todo momento, me sirvieron sus consejos, 
correcciones y comentarios. A mi sinodal el M. en C. Claudio Garibay Orijel por el 
apoyo, comentarios y correcciones en el proyecto. 
 
Gracias por la instrucción recibida de todos los profesores de la UPIBI, en especial a la 
Prof. Rosa Isela de Nova Carbajal, Ing. Oscar Morales Galindo e Ing. Leobardo Ordaz 
Contreras. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
A Dios 
 
A ti es a quien primero agradezco porque eres principio y fin 
de todo, porque sólo tu inspiración divina me ayudo a terminar 
esta etapa en mi vida. Gracias por abrir y guiar siempre mi 
camino, gracias por todo lo que me das y por la oportunidad 
que me regalas de ser mejor a cada segundo. 
 
 
 
 
 
A mi Mamá 
 
Por que la inspiración de mis ideales y mis luchas eres tú, por 
que todo mi ser y formación te la debo a ti luchadora 
incansable, Dios en su infinita bondad me dio la madre 
perfecta. Te amo 
 
 
 
 
 
A mi Papá 
 
Gracias por estar conmigo en todo momento y apoyar mis 
decisiones, por alentar mi sed de conocimiento y por estar en 
esos momentos de desfallecimiento en los cuáles supiste 
levantarme para seguir el camino. Te amo 
 
 
 
 
 
A mi Hermana 
 
Eres la persona más importante en mi vida y la que siempre 
me ha dado el ejemplo, gracias por estar siempre cuando te 
necesito y por ser mi ángel guardián, no me alcanza este 
pedazo de papel ni todas las hojas de este trabajo para decir 
lo que significas para mi. Te Amo eternamente 
 
 
 
 
 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
A la Familia Cruz 
 
Gracias por despejar mi mente y alejarme temporalmente de 
las presiones y angustias, A mis tíos Elsita, Chuy, Pepe y 
respectivos gracias por las ocurrencias, convivencias y planes 
futuros, a mis primos por su acercamiento y distracciones. A 
todos los integrantes de la familia les doy las gracias. Por la 
felicidad y dicha que tuve al estar con mi abuelito Fausto a 
quien siempre tendré presente, y por Mamy Toña a quien 
siempre llevaré en el corazón. 
 
 
 
 
A la Familia Pérez 
 
Por estar siempre conmigo en cada etapa de mi vida y por lo 
que nos falta recorrer. A mis tías Chío, Chayito, Bombón e 
Hilda por su interés preocupación y cariño incondicional. A mi 
tío Carlos por su tenacidad en mis calificaciones e interés. A 
mis primos Pepe, Nalle, Rodo y Gera por que son mis 
hermanos y me hacen ver el otro lado de la moneda. A todos 
los integrantes de la familia les doy las gracias. Doy gracias a 
Dios por tener a mi Papa Pepe para festejar este triunfo y 
desde el cielo a Mamy Susy quien me ha sabido guiar. 
 
 
 
 
A mis Amigos 
 
Los cuales sin duda fueron pieza fundamental para cumplir 
esta meta. Gracias kika por darme ánimo y por levantarme 
cada vez que tropiezo, por esa luz que irradias y me 
transmites. Gracias Jenny por ser ese hombro en quien puedo 
recargarme y por ser mi mano derecha. Gracias Mari por 
hacerme tío, por tu felicidad y ocurrencias. Gracias Luis por 
que fuiste piedra angular en la culminación de este sueño, por 
tu apoyo incondicional y por estar al pendiente de mi persona, 
estudio y trabajo. A todos mis amigos mil gracias, a Paloma, 
Chelos, Denis, Tto, Papa, Miga y todos los demás. 
 
 
 
 
 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
ÍNDICE GENERAL 
 
 
1. INTRODUCCIÓN…………………………..………………………….......………………... 1 
 
 1.1 El RNA de transferencia (tRNA)…………………………….....……………….. 1 
 
 1.2 Estructura del tRNA………….……………………………...….…………….….. 3 
 
 1.3 Aminoacil tRNA sintetasas………………………………..……………………... 5 
 
 1.4 Traducción……………………...……...………….……………..……………….. 6 
 
2. ANTECEDENTES………...…………………………………………………..…………….. 9 
 
 2.1 Bypasing…………………………….………………………............................... 10 
 
 2.2 Frameshifting…………………………………………..……………..….……….. 11 
 
3. JUSTIFICACIÓN………......……………………………………………………..…………. 13 
 
4. OBJETIVOS……………..………………………………………………………….............. 14 
 
 4.1 Generales…………………………….……………..………………….…............ 14 
 
 4.2 Específicos……………………………………..………………………..……..…. 14 
 
5. METODOLOGÍA……………………………………………………………………............. 15 
 
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………………..… 16 
 
 6.1 Vector de expresión utilizado……………………………...…………………..... 16 
 
 6.2 Construcciones……………………………...…………………………................17 
 
 6.3 Secuenciación de las construcciones……………………...………………..…. 19 
 
 6.4 Evaluación del fenotipo de las cepas C92∆lac06 vs C92∆lac06pthts……..… 23 
 
 6.5 Evaluación del crecimiento óptimo de la cepa C92∆lac06pthts …………….... 23 
 
 6.6 Determinación cualitativa del cambio del marco de lectura……………......... 24 
 
 6.7 Determinación cuantitativa del cambio del marco de lectura…………...…… 27 
 
 6.7.1 Fondo Cromosomal C92∆lac06.……………………………….…............ 27 
 
 6.7.2 Fondo Cromosomal C92∆lac06pthts ………………………..................... 32 
 
 6.7.3 Comparación de las C92∆lac06 vs C92∆lac06pthts.…………………..... 36 
 
 6.8 Acumulación de peptidil-tRNA…………………………………………………… 39 
 
 6.8.1 Acumulación de peptidil-tRNALys………………………………………..... 39 
 
 6.8.1.1 Cuantificación de la acumulación de peptidil-tRNALys…………. 41 
 
 6.8.2 Acumulación de peptidil-tRNAThr………………………………………….. 43 
 
 6.8.2.1 Cuantificación de la acumulación de peptidil-tRNAThr…………. 44 
 
 6.8.3 Acumulación de peptidil-tRNAGly………………………………………..... 46 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
 6.8.3.1 Cuantificación de la acumulación de peptidil-tRNAGly……….…. 
 
 
 
47 
 
 6.8.4 Comparación del grado de acumulación de peptidil-tRNA en el fondo 
cromosomal C92∆lac06..……………………………………..…………… 
 
49 
 
 6.8.5 Comparación del grado de acumulación de peptidil-tRNA en el fondo 
cromosomal C92∆lac06pthts.……………………………………………... 
 
50 
 
7. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ………………….………….……………………….. 52 
 
8. CONCLUSIONES…………………………………………………..……….……………….. 53 
 
9. RECOMENDACIONES PARA TRABAJO FUTURO ………..…………..……………….. 54 
 
10. MATERIALES Y MÉTODOS ………………………………..………………..……………. 55 
 
11. EQUIPO…………………………………………………….……………………...………… 66 
 
12. REFERENCIAS…………………………………………..…………………....................... 67 
 
 
 
ÍNDICE DE GRÁFICAS 
 
 
Gráfica No. 1: Curva de crecimiento para el fondo cromosomal C92∆lac06……………… 30 
Gráfica No. 2: Cuantificación de β-galactosidasa para el fondo cromosomal C92∆lac06.. 32 
Gráfica No. 3: Curva de crecimiento para el fondo cromosomal C92∆lac06pthts…………. 34 
Gráfica No. 4: Cuantificación de β-galactosidasa para el fondo cromosomal 
C92∆lac06pthts……………………………………………………………………………………. 36 
Gráfica No. 5: Cuantificación de β-galactosidasa para los fondos cromosomales 
C92∆lac06 vs C92∆lac06pthts…………………………………………………………………... 37 
Gráfica No. 6: Acumulación de peptidil-tRNA para Lys……………………………………… 42 
Gráfica No. 7: Acumulación de peptidil-tRNA para Thr……………………………………… 45 
Gráfica No. 8: Acumulación de peptidil-tRNA para Gly……………………………………… 48 
Gráfica No. 9: Comparación de la acumulación de peptidil-tRNA para las 
transformaciones realizadas en la cepa C92∆lac06…………………………………………. 49 
Gráfica No. 10: Comparación de la acumulación de peptidil-tRNA para las 
transformaciones realizadas en la cepa C92∆lac06pthts..…………………………………… 50 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
 
Figura No. 1: Representación del mecanismo en el que participa el adaptador……......... 2 
Figura No. 2: Estructura tridimensional de una molécula de tRNA típica……………......... 3 
Figura No. 3: Estructura en “hoja de trébol” de tRNA………………………………………... 4 
Figura No. 4: Representación de un aminoacil-tRNA………………………………………... 6 
Figura No. 5: Subunidad pequeña del ribosoma……………………………………………… 7 
Figura No. 6: Subunidad grande del ribosoma……………………………………………….. 7 
Figura No. 6: Proceso de traducción…………………………………………….………......... 8 
Figura No. 7: Mutante p118X150……..……………………….……………….……………… 11 
Figura No. 8: Secuencia en tripletes de las fusiones a β-galactosidasa……….….…........ 12 
Figura No. 9: Vector pEK-O-Frame.................................................................................... 16 
Figura No. 10: Secuenciación de la construcción para el codón hambriento treonina..…. 20 
Figura No. 11: Secuenciación de la construcción para el codón hambriento glicina…..…. 21 
Figura No. 12: Secuenciación de la construcción para el codón hambriento de lisina…… 22 
Figura No. 13: Fenotipo de la cepa C92∆lac06 y C92∆lac06pthts a 40º C………………... 23 
Figura No. 14: Actividades diferenciales dependientes del fondo cromosomal…………… 26 
Figura No. 15: Autorradiograma para la construcción pEK-AAG en los 2 fondos 
cromosomales…..………………………………………………………………………………… 
 
40 
Figura No. 16: Fosfo imagen del autorradiograma para la construcción pEK-AAG en los 
2 fondos cromosomales…………………………………………………………………………. 
 
41 
Figura No. 17: Autorradiograma para la construcción pEK-ACC en los 2 fondos 
cromosomales…………………………………………………………………………………….. 
 
43 
Figura No. 18: Fosfo imagen del autorradiograma para la construcción pEK-ACC en los 
2 fondos cromosomales…………………………………………………………………………. 
 
44 
Figura No. 19: Autorradiograma para la construcción pEKGGC en los 2 fondos 
cromosomales…………………………………………………………………………………….. 
 
46 
Figura No. 20: Fosfo imagen del autorradiograma para la construcción pEK-GGC en los 
2 fondos cromosomales…………………………………………………………………………. 
 
47 
 
 
 
 
 
ÍNDICE DE DIAGRAMAS 
 
 
Diagrama No. 1: Construcción de las secuencias pEK-AAG, pEK-ACC, pEK-GGC……... 18 
Diagrama No. 2: Secuencia en tripletes de las fusiones a β− galactosidasa……………… 19 
 
 
 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
 
Tabla No. 1: Transformación de las cepas C92∆lac06 y C92∆lac06pthts …………………. 24 
Tabla No. 2: Crecimiento de la cepa C92∆lac06 transformada con los plásmidos pEK-
AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 3h……………………………………….. 28 
Tabla No. 3: Determinación de β-galactosidasa en la cepa C92∆lac06 transformada con 
los plásmidos pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 3h………………… 28 
Tabla No. 4: Miliunidades de β-galactosidasa en la cepa C92∆lac06 transformada con 
los plásmidos pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 3h………………... 29 
Tabla No. 5: Crecimiento de la cepa C92∆lac06 transformada con los plásmidos pEK-
AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 5h……………………………………….. 29 
Tabla No. 6: Determinación de β-galactosidasa en la cepa C92∆lac06 transformada con 
los plásmidos pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 5h………………… 30 
Tabla No. 7: Miliunidades de β-galactosidasa en la cepa C92∆lac06 con los plásmidos 
pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC respectivamente para una cinética de 5h……………... 31 
Tabla No. 8: Crecimiento de la cepa C92∆lac06pthts transformada con los plásmidos 
pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 3h………………………………….. 32 
Tabla No. 9: Determinación de β-galactosidasa en la cepa C92∆lac06pthts transformada 
con los plásmidos pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 3h……………. 33 
Tabla No. 10: Miliunidades de β-galactosidasa en la cepa C92∆lac06pthts transformada 
con los plásmidos pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 3h……………. 33 
Tabla No. 11: Crecimiento de la cepa C92∆lac06pthts transformada con los plásmidos 
pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 5h………………………………….. 34 
Tabla No. 12: Determinación de β-galactosidasa en la cepa C92∆lac06pthts 
transformada con los plásmidos pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 
5h………………………………………………………………………………………………....... 35 
Tabla No. 13: Miliunidades de β-galactosidasa en la cepa C92∆lac06pthts con los 
plásmidos pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 5h…………………….. 35 
Tabla No. 14: Promedio de las tablas No. 4 y No. 7 en miliunidadesde β-galactosidasa 
para las cinéticas realizadas en la cepa C92∆lac06 con los plásmidos pEK-AAG, pEK-
ACC y pEK-GGC…………………………………………………………………………………. 36 
Tabla No. 15: Promedio de las tablas No. 10 y No.13 en miliunidades de β-
galactosidasa para las cinéticas realizadas en la cepa C92∆lac06pthts con los plásmidos 
pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC………….…………………………………………………... 37 
Tabla No. 16: Resta de las mUE para la cepa C92∆lac06pthts con respecto a la cepa 
C92∆lac06 dependiendo el codón hambriento. 38 
 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
 
 
Tabla No. 17: Porcentaje de corrimiento en el marco de lectura de la cepa 
C92∆lac06pthts con respecto a la cepa C92∆lac06 dependiendo el codón hambriento…. 39 
Tabla No. 18: Porcentaje de peptidil-tRNA en los dos fondos cromosomales para la 
construcción pEK-AAG……………………………………………….. 42 
Tabla No. 19: Porcentaje de peptidil-tRNA en los dos fondos cromosomales para la 
construcción pEK-ACC……………………………………………….. 45 
Tabla No. 20: Porcentaje de peptidil-tRNA en los dos fondos cromosomales para la 
construcción pEK-GGC………………………………………………. 48 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
RESUMEN 
 
 
 Se tiene conocimiento que el ribosoma traduce codones sucesivos en un mRNA. 
No obstante, ocasionalmente el complejo del peptidil-tRNA y el ribosoma pueden 
resbalar en la secuencia del mensajero sin traducir dicha secuencia, dando por 
consiguiente un cambio en el tamaño de la cadena peptídica. El frameshift, ocurre 
cuando el ribosoma pausa frente a un codón hambriento, moviendose aleatoriamente +1 
ó -1 sobre el mRNA y si en alguno de estos dos movimientos se encuentra con que el 
codón al que se movió codifica para el mismo aminoácido en el cual se había detenido 
(debido a que el siguiente triplete era un codón hambriento), provoca un cambio en el 
marco de lectura, reiniciando su lectura en ese codón. 
 
 Para el estudio de este fenómeno se realizaron construcciones con la región en 
que se presume el ribosoma cambia su marco de lectura, en donde un corrimiento (-1) 
del ribosoma provoca la expresión de β-galactosidasa en células transformadas. Se 
realizaron tapices en cajas petri adicionadas con X-gal y se introdujeron discos con el 
inductor (IPTG), se incubaron a 32ºC durante 18h. Se hizo una cinética de crecimiento 
en medio mínimo e IPTG para posteriormente determinar cuantitativamente la actividad 
de β-galactosidasa. 
 
 Aunado a esto se detectó la acumulación de peptidil-tRNA por medio de un 
Northern blot de las muestras de peptidil-tRNA extraídas de las cepas transformadas. 
 
 Se encontró que el grado del desplazamiento del marco de lectura ribosomal es 
proporcional al nivel de acumulación del peptidil-tRNA. 
 
 
 
 
 
 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
GRADO DE CORRIMIENTO DEL MARCO DE LECTURA EN FUNCIÓ N AL CODÓN 
HAMBRIENTO EN LA TRADUCCIÓN DEL mRNA DE UNA CEPA DE FICIENTE DE 
PEPTIDIL-tRNA HIDROLASA 
 
 
1. INTRODUCCIÓN 
 
La capacidad de las células de mantener un elevado grado de orden dentro de 
un universo caótico, depende de la información genética que se expresa, se mantiene y 
a veces mejora, mediante los procesos genéticos básicos: la síntesis de proteínas y del 
RNA, la reparación del DNA y la recombinación genética. 
 
Las proteínas constituyen más de la mitad de la masa seca total de una célula, y 
su síntesis es de suma importancia para el mantenimiento, crecimiento y desarrollo de la 
célula. Depende de la colaboración entre diversos tipos de moléculas de RNA y empieza 
con una serie de etapas preparatorias. Primero, sobre el DNA que codifica la proteína 
que se va a sintetizar, se ha de copiar una molécula de RNA mensajero (mRNA). 
Mientras tanto, en el citoplasma, cada uno de los 20 aminoácidos a partir de los cuales 
se construirá la proteína, se han de unir a su molécula específica de RNA de 
transferencia (tRNA) y las subunidades del ribosoma sobre el cuál se va a generar la 
nueva proteína se han de volver a cargar con factores proteicos auxiliares. La síntesis 
de proteínas comienza cuando todos estos componentes se encuentran en el 
citoplasma y forman un ribosoma funcional. Cuando una molécula de mRNA se 
desplaza progresivamente a través de cada ribosoma, la secuencia de nucleótidos de la 
molécula de mRNA es traducida a la secuencia de aminoácidos correspondiente, 
produciendo una cadena proteica determinada especificada por la secuencia de DNA en 
su gen. 
 
 
1.1 El RNA de transferencia (tRNA) 
 
El conocimiento de la función genética del DNA permitió entender cómo las 
células traducen el lenguaje de la secuencia de bases en el lenguaje de los polipéptidos. 
 
1 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
Los ácidos nucleicos no unen específicamente aminoácidos, por lo cual, en 1955 
Crick propuso la hipótesis de la molécula adaptadora para explicar este proceso. Está 
hipótesis decía que la traducción ocurre a través de un adaptador y postulaba que cada 
un de estos adaptadores cargaba un aminoácido en específico y este adaptador es el 
que reconocía al codón correspondiente (véase Figura No.1). 
 
 
Polipéptido aa 1 aa 2 aa 3 
 
Adaptadores 
 
Acido nucleico 
 
 Codón 1 Codón 2 Codón 3 
 
Figura No. 1: Representación del mecanismo en el que participa e l adaptador. 
 
Investigaciones más profundas indicaron que esta molécula adaptadora que fue 
llamado RNA soluble (sRNA) es el tRNA, la molécula que adapta los aminoácidos a la 
naciente cadena (Alberts et al., 2002). 
 
Los tRNA´s se unen por uno de sus extremos a un codón específico de la 
molécula de mRNA y por el otro al aminoácido específico para ese codón (Alberts et al., 
2002), de esta forma permiten que los aminoácidos se alineen de acuerdo a la 
secuencia de nucleótidos de mRNA. 
 
Cada tRNA está diseñado para transportar uno sólo de los 20 aminoácidos que 
se utilizan para la síntesis de proteínas. Por ejemplo un tRNA que transporta glicina 
(tRNAGly) solamente puede transportar este aminoácido, y así sucesivamente. Cada uno 
de los 20 aminoácidos tiene como mínimo, un tipo de tRNA asignado, mientras que la 
mayoría de aminoácidos disponen de varios tipos de tRNA. 
 
La longitud de los tRNA´s varía de especie a especie y en los eucariontes de 
organelo en organelo, y va desde 60 hasta 95 nucleótidos (18-28 kD), pero la mayoría 
tiene 80 nucleótidos. 
 
2 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 1.2 Estructura del tRNA 
 
 
La función de una molécula de tRNA depende de su estructura tridimensional, 
que se halla plegada de forma muy precisa. Algunos tRNA´s se han cristalizado y por 
análisis de difracción de rayos X se ha podido determinar su estructura tridimensional 
completa (véase Figura No. 2). 
 
 
 
 
Figura No. 2 : Estructura tridimensional de una molécula de tRNA típica. 
 
 
Para plegar una molécula de tRNA se requiere tanto el apareamiento de bases 
complementarias como interacciones poco habituales entre bases. En la estructura 
nativa, el aminoácido se une a un extremo de la “L” mientras que el anticodónse 
localiza en el otro extremo (Figura No. 2). 
 
Las secuencias de nucleótidos de las moléculas de tRNA de muchos organismos 
diferentes revelan que las moléculas de tRNA pueden formar bucles y las zonas de 
bases apareadas necesarias para formar una estructura de “cruce de carreteras en 
forma de trébol” (véase Figura No. 3), y que posteriormente esta estructura se pliega 
adoptando la conformación en forma de L detectada en los análisis cristalográficos. 
3 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
Figura No. 3: Estructura en “hoja de trébol” de tRNA. 
 
Casi todos los tRNAs, presentan una estructura de trébol y tienen las siguientes 
características (Bruce et al., 2002): 
 
1.- Un grupo fosfato en extremo 5´. 
 
2.- Un brazo de 7 pares de bases que incluye al nucleótido 5´ y pueden contener pares 
de bases diferentes a los de Watson-Crick como G-U. A esta región se le denomina 
brazo aceptor o brazo del aminoácido, porque el aminoácido es llevado (cargado) en el 
OH libre del extremo 3´ de esta región. 
 
3.- Un brazo de 3 a 4 pares de bases que termina en un giro que frecuentemente 
contiene la base modificada dihidrouracilo, por lo cual se denomina brazo D . 
 
4.- Un brazo de 5 pares de bases que termina en un giro que contiene el anticodon, el 
triplete de bases que es complementario con el codon en el mRNA. A esta región se le 
denomina brazo del anticodon . 
 
4 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
5.- Un brazo de 5 pares de bases que termina en un giro que casi siempre contiene la 
secuencia TψC (en donde ψ representa pseudouridina), esta región es denominada 
brazo TψC o simplemente T. 
 
6.- Todos los tRNA´s terminan en una secuencia CCA con el OH del extremo 3´ libre. 
 
7.- Hay 15 posiciones invariables (siempre tienen la misma base) y 8 posiciones semi-
invariantes (contienen sólo una purina o pirimidina) que se presentan en los giros. 
 
El sitio de mayor variabilidad en los tRNAs se encuentra en el denominado brazo 
variable , que tiene de 3 a 21 nucleótidos y puede tener una región lineal de 7 o más 
pares de bases. 
 
1.3 Aminoacil tRNA sintetasas 
 
Es la molécula de tRNA y no el aminoácido que ésta lleva unido la que determina 
el lugar en el que será añadido el aminoácido durante la síntesis de proteínas. 
 
El mecanismo depende de la actividad de las enzimas denominadas aminoacil-
tRNA sintetasas, que acoplan cada aminoácido a su grupo de moléculas de tRNA 
apropiadas. Existe una enzima sintetasa diferente para cada aminoácido (Alberts et al., 
2002), una de ellas une glicina a todas las moléculas tRNAGly, otra une alanina a todas 
las moléculas tRNAAla, y así sucesivamente. 
 
La reacción de acoplamiento que genera una molécula de aminoacil-tRNA 
(véase Figura No. 4) está catalizada en dos etapas: a) la elección del aminoácido 
correcto para la unión covalente con su tRNA y b) la selección de los tRNAs cargados 
con sus aminoácidos específicos. 
 
 
5 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
Figura No. 4 : Representación de un aminoacil-tRNA. 
 
1.4 Traducción 
 
 En el transcurso de la síntesis de proteínas, la maquinaria de la traducción se 
desplaza en dirección 5´ a 3´ a lo largo de una molécula de mRNA, y lee la secuencia de 
nucleótidos de este mRNA de tres en tres bases. 
 
 Como se ha dicho cada aminoácido está especificado por un triplete de 
nucleótidos (codón) de la molécula de mRNA que se aparea con una secuencia de 3 
nucleótidos complementaria, el extremo anticodón de una molécula de tRNA 
determinada. Puesto que tan sólo una de las muchas tipos de moléculas de tRNA de 
una célula puede aparearse con cada codón, el codón determina el residuo de 
aminoácido específico que será añadido al extremo de la cadena polipeptídica en 
crecimiento. 
 
 El RNA está compuesto por cuatro tipos de nucleótidos, por lo que existen 64 
posibles secuencias diferentes de tres nucleótidos. 
 
 # de bases por codón 
���� 
 43 = 64 
�  
 bases diferentes tripletes de bases 
 
6 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
Tres de estas 64 secuencias no codifican ningún aminoácido, si no que 
determinan el final de una cadena polipeptídica; reciben el nombre de codones de 
terminación. Por lo tanto, quedan 61 codones para especificar únicamente 20 
aminoácidos diferentes. Por esta razón la mayoría de los aminoácidos están 
representados por más de un codón por lo que se dice que el código genético es 
degenerado. 
 
 Las reacciones de la síntesis de proteínas necesitan de una compleja maquinaria 
catalítica que las guíe. Éste y todos los demás acontecimientos de la síntesis de 
proteínas están catalizados por los ribosomas, que son grandes complejos de moléculas 
de RNA y proteínas. 
 
Los ribosomas de procariotas son muy similares a los de eucariotas en cuanto 
diseño y función. Cada uno de ellos está compuesto por una subunidad pequeña (Figura 
No.5) y una subunidad grande (Figura No. 6), que se mantienen juntas formando un 
complejo de una masa de varios millones de daltons. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura No. 5: Subunidad pequeña del ribosoma. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura No. 6 : Subunidad grande del ribosoma. 
 
 
7 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
La subunidad pequeña se une al mRNA y a las moléculas de tRNA, mientras que 
la subunidad grande cataliza la formación de los enlaces peptídicos. 
 
Durante la traducción, el mRNA pasa a través del ribosoma, de tal forma que 
cada codón se une específicamente a su tRNA correspondiente (véase Figura No. 6). 
 
 
 
 CADENA NACIENTE 
 DE PROTEÍNA 
 
 1 +NH3 
 
 2 +NH3 
 
3 6 
 
 OH 4 5 residuo 
 
 
tRNA 
 
 RIBOSOMA 
 
 
 mRNA 5´ 3´ 
 
 
 movimiento del ribosoma 
 
 
 
Figura No. 6: Proceso de traducción. Síntesis ribosomal de un polipéptido dirigido por mRNA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
+NH3 
8 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
2. ANTECEDENTES 
 
Se tiene conocimiento que el ribosoma traduce codones sucesivos en un mRNA. 
No obstante, en otro modelo alternativo el complejo del peptidil-tRNA y el ribosoma 
pueden resbalar en la secuencia del mensajero sin traducir dicha secuencia, dando por 
consiguiente un cambio en el tamaño de la cadena peptídica (Barak et al., 1996). Hay 
dos mecanismos que explican estos eventos conocidos como: bypassing y frameshift. 
 
 Estos dos eventos son favorecidos con elementos importantes como secuencias 
parecidas Shine-Dalgarno localizadas en el Open Reading Frame (ORF) del mRNA, 
interacciones no covalentes en el mRNA que provocan plegamientos entre bases 
complementarias que dan lugar a la formación de un tallo asa (Licznar et al., 2003), pero 
entre los más importantes destacan la presencia de un codónhambriento (Barak et al., 
1996). Se dice que un codón está hambriento cuando el aminoacil-tRNA que lo 
decodifica esta ausente o en baja concentración. 
 
 Recientemente se han realizado experimentos, los cuales revelan que un codón 
hambriento se puede generar si se limita la disponibilidad de tRNA (Lindsley et al., 
2003). Esta condición se obtuvo con la inducción de minigenes, los cuales proveen un 
camino para secuestrar isoaceptores específicos de tRNA como peptidil-tRNA. Un 
minigen es una secuencia de DNA que codifica un oligopéptido. El minigen utilizado 
consta de 3 codones, los cuales son: codón de inicio, codón para el aminoácido que se 
quiere reducir la concentración de tRNA aminoacilado (excepto de inicio/paro) y codón 
de paro. 
 
Los minigenes al ser expresados pueden provocar un aumento considerable en 
la concentración del peptidil-tRNA para el aminoácido que expresan, promoviendo la 
probabilidad de tener un codón hambriento. 
 
Un mecanismo de limitar la aminoacilación del tRNA es por medio de la 
inhibición parcial de la peptidil-tRNA hidrolasa (Pth) la cual es una enzima esencial para 
la viabilidad de Escherichia coli. La participación de la Pth en el metabolismo es 
hidrolizar los peptidil-tRNAs que se caen de forma prematura de los ribosomas durante 
9 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
la síntesis de proteínas y por lo tanto permitir el reciclamiento de los tRNAs en la mitad 
del proceso. 
 
Existen dos mutantes bien caracterizadas en el gen que codifica la enzima Pth 
una denominada termosensible: pthts, que corresponde a la sustitución de una Gly (en 
posición 101) a Asp, provocando que se vuelva una enzima inestable. Cuando se lleva 
acabo el crecimiento de la E. coli que porta esta mutación a temperaturas no permisivas, 
la mutante acumula peptidil-tRNAs y la célula muere por escasez de tRNA. A 40º C se 
acumula el peptitil-tRNA en las células y la síntesis de proteínas es inhibida después de 
5 minutos (Cruz et al., 2003). 
 
Diferentes familias isoaceptoras de tRNA se acumulan como peptidil-tRNA a 
diferentes tiempos. Dos son significativamente bajas: las familias aceptoras de glicina y 
cisteína. Cinco son rápidamente acumulados: las familias aceptoras de lisina, treonina, 
isoleucina, histidina y aspartato (Menninger et al., 1978). 
 
La otra mutante, pth rap, que corresponde a la sustitución de una Arg (en la 
posición 134) a His no permite el crecimiento vegetativo de fago λ bajo condiciones que 
permiten el crecimiento exponencial de la célula. Ambas mutaciones provocan una 
reducción sustancial de la actividad de la enzima en extractos celulares. 
 
 2.1 Bypassing. 
 
Este evento se logra cuando el ribosoma al estar leyendo el mRNA se para en un 
triplete debido a que en el siguiente hay un codón hambriento, deslizándose hasta 
encontrar un codón que codifica para el mismo aminoácido en el cual se había parado, 
provocando el acortamiento de la proteína en cuestión. El bypassing es un evento que 
puede ser iniciado aparentemente por secuencias ordinarias con la condición de que el 
ribosoma se pare frente a un codón hambriento. Este efecto esta particularmente 
marcado en mutantes deficientes del gen relA, cuyo producto participa globalmente en 
acortar la vida del tRNA aminoacilado (Lindsley et al., 2003). 
 
 
 
10 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 2.2 Frameshifting (Cambio del marco de lectura) 
 
Otro evento que puede ocurrir es el frameshift, el cual se lleva a cabo cuando el 
ribosoma se para frente a un codón hambriento, moviendose aleatoriamente +1 ó -1 
sobre el mRNA (esta región es llamada secuencia resbalosa) y si en alguno de estos 
dos movimientos se encuentra con que el codón al que se movió codifica para el mismo 
aminoácido en el cual se había detenido (debido a que el siguiente triplete era un codón 
hambriento), provoca un cambio en el marco de lectura, reiniciando su lectura en ese 
codón. Al cambiar el marco de lectura en el mRNA provoca un cambio en todos los 
aminoácidos siguientes, dando como resultado un polipéptido diferente (Gallant et al., 
1998). 
 
 En trabajos anteriores (E. Jacinto, en preparación) se ha aislado una mutante del 
gen pth la cual suprime el fenotipo de la cepa pthts a 40ºC cuando se induce con IPTG 
(isopropil β-D-tiogalactopiranósida). 
 
Esta mutante fue secuenciada y los resultados revelaron que había ocurrido una 
deleción de una adenina en el codón 118, lo cual genera un corrimiento del marco de 
lectura con codones de paro en las posiciones 150, 160 y 180. (véase Figura No.7). 
 
 
 
Figura No. 7: Mutante p118 XXXX150. Deleción de una alanina en el codón 118 de p118X150 
 
 
El análisis de western blot reveló que se produce una proteína del tamaño de la 
Pth silvestre, esto sería posible si en la secuencia se genera un corrimiento del marco 
de lectura que lo regresara a la fase original, el cual podría suprimir los 3 codones de 
paro y generar una proteína activa con el tamaño de la silvestre. 
 
El fragmento probable donde se encuentra el corrimiento de (-1) que contiene la 
secuencia resbalosa T TTC fue fusionado al reportero lac z, donde la síntesis de β-
UAG 
150 160 180 
1 50 100 118 
A 
UAA UGA 
11 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
galactosidasa depende del corrimiento (-1), el resultado de estos experimentos 
revelaron que sí hubo actividad de β-galactosidasa, lo cual corrobora que ocurrió un 
desplazamiento (-1) en el marco de lectura original. 
 
 
El mecanismo propuesto de lo que ocurre en la traducción de la cepa mutante es 
el que se muestra en la Figura No. 8 
 
 
A) 
Marco de lectura (0) 
pEK118-150χχχχ 
 
 
B) 
Marco de lectura (-1) 
pEK118-150χχχχ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura No. 8: Secuencia en tripletes de las fusiones a ββββ-galactosidasa . A) En la parte superior de cada 
triplete su correspondiente aminoácido en el marco de lectura (0) para la construcción pEK118-150χ B) 
Subrayado con una línea se muestra el presunto sitio del corrimiento del marco de lectura (-1) en la 
construcción pEK118-150χ, con la flecha se indica el codón hambriento ACC y debajo de cada triplete 
iniciando en la flecha se encuentra indicada la secuencia de aminoácidos correspondiente al marco de lectura 
(-1). 
 Thr Phe Thr Val Tyr Ala Ser Glu Ser Val Ile Arg Ala Ile Lys Ile Lys Leu Ser Val Leu Cys Stop 
 ACT TTC ACC GTT TAC GCA TCG GAA TCG GTC ATC CGG GCG ATA AAA ATA AAG TTG TCG GTT TTG TGT TAG 
 Thr Phe... 
.....AC TTT CAACC CCGT TTA CGC ATC GGA ATC GGT CAT CCG GGC GAT AAA AAT AAA GTT GTC GGT TTT GTG TTA GGG 
 
 
 His Arg Leu Arg Ile Gly Ile Gly His Pro Gly Asp Lys Asn Ly s Val Val Gly Phe Val Leu Gly 
12 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
 
 
3. JUSTIFICACIÓN 
 
 
 
 
 Durante el evento de traducción el ribosoma puede cambiar su marco de lectura 
en el mensajero desplazándose(+1) ó (-1) respecto al marco (0). 
 
 
 En laboratorio se ha demostrado que en una cepa deficiente en Pth el ribosoma 
puede cambiar el marco de lectura a (-1) con respecto al marco (0) durante la 
traducción. Debido a lo anterior se quiere demostrar si existen diferencias cuantitativas 
del desplazamiento del ribosoma en el marco de lectura dependiendo el codón 
adyacente a la secuencia resbalosa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
4. OBJETIVOS 
 
 
 
 
 4.1 General. 
 
• Demostrar que en una cepa deficiente de peptidil-tRNA hidrolasa durante la 
traducción del mRNA el ribosoma puede cambiar su grado de corrimiento en el 
marco de lectura dependiendo el codón adyacente a la secuencia resbalosa. 
 
 
 
 4.2 Específicos 
 
• Demostrar que en la cepa C92∆lac06pthts el grado de corrimiento en el marco de 
lectura varía en función del codón adyacente a la secuencia T TTC. 
 
• Cuantificar el grado de corrimiento en el marco de lectura de la cepa 
C92∆lac06pthts. 
 
• Demostrar que el corrimiento del marco de lectura en la cepa C92∆lac06pthts 
está correlacionado con la acumulación del peptidil-tRNA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
5. METODOLOGÍA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Transformar las cepas* 
C92∆lac06 y C92∆lac06pthts 
con los plásmidos 
anteriormente mencionados. 
Evaluar crecimiento a 
diferentes temperaturas. 
Cinética de crecimiento. 
Cinética de crecimiento. 
Medir actividad de β-galactosidasa. 
*Estas cepas fueron enviadas por el laboratorio del Dr. Gallant en la Universidad de Seattle en Washington. 
Realizar tapices en cajas para 
obtener un análisis cualitativo. 
Construcción de los plásmidos : 
pEK-AAG 0F, pEK-AAG, pEK-
ACC y pEK-GGC. 
 
Nothern Blot. 
Extracción del vector 
pEK-0-Frame. 
Purificación del vector pEK -0-
Frame e hibridación de 
oligonucleótidos para su ligación. 
 
Ligación del vector y del 
oligonucleótido. 
Corte con enzimas de restricción. 
15 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
 6.1 Vector de expresión utilizado. 
 
 El vector de expresión utilizado para hacer todas las construcciones fue el pEK-
0-Frame (Gallant et al., 1998) está mostrado en la Figura No. 9. A dicho vector se le 
introdujeron regiones de control que afectan a la transcripción y traducción, para permitir 
la expresión de alto nivel de los genes clonados, con el objeto de describir los efectos 
que se producen en la traducción de proteínas. 
 
pEK-0-Frame.
7654 pb.
lacI Q
1623 Bsu361
2223 BspD I
2223 Cla I 
2585 Dra I
Sac I
Sun I 4171
SpI 4412
1171 Stop
1296 
Frag. de lac Y
4461 Stop
91
 in
i c
io
 d
e 
la
cI
q
O
R
I
ββββ L
act
am
asa
lac
Z
6524
5531
MCS
1347 Asp718
1347 Kpn I
1370 HinD III
1384 Sal I
1390 BamH I
1395 Sma I
1395 Xma I
1400 EcoR I
7450 Inicio
Sca I 7140
Th111 I 5513
pEK-0-Frame.
7654 pb.
lacI Q
1623 Bsu361
2223 BspD I
2223 Cla I 
2585 Dra I
Sac I
Sun I 4171
SpI 4412
1171 Stop
1296 
Frag. de lac Y
4461 Stop
91
 in
i c
io
 d
e 
la
cI
q
O
R
I
ββββ L
act
am
asa
lac
Z
6524
5531
MCS
1347 Asp718
1347 Kpn I
1370 HinD III
1384 Sal I
1390 BamH I
1395 Sma I
1395 Xma I
1400 EcoR I
1347 Asp718
1347 Kpn I
1370 HinD III
1384 Sal I
1390 BamH I
1395 Sma I
1395 Xma I
1400 EcoR I
7450 Inicio
Sca I 7140
Th111 I 5513
 
 
 
 
 
Figura No. 9: Vector pEK -0-Frame . Vector de expresión utilizado para la construcción de los 
plásmidos pEK-AAG 0F, pEK-AAG, pEK-ACC, pEK-GGC 
16 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
Este vector tiene clonado el gen completo de lac z con su propio promotor y es 
inducible con IPTG, LacIQ es el represor. En todas las construcciones hechas en este 
vector la actividad de β-galactosidasa depende de un marco de lectura (-1). 
 
Para hacer las construcciones se realizaron dos cortes con enzimas de 
restricción en el vector pEK-0-Frame. Las endonucleasas de restricción utilizadas fueron 
Hind lll y BamH l (New England Biolabs 2000-2001). El tipo de corte de ambas enzimas 
se muestra a continuación: 
 
 
 Hind lll 
5´. . . A A G C T T . . . 3´ 
3´. . . T T C G A A . . . 5´ 
 
 
 
 
 
 BamH l 
5´. . . G G A T C C . . . 3´ 
3´. . . C C T A G G . . . 5´ 
 
 
 6.2 Construcciones 
 
 Los codones que se utilizaron para realizar las construcciones se escogieron 
tomando como referencia la acumulación de peptidil-tRNA de las familias de 
aminoácidos (Menninger et al., 1978), con el fin de tener datos representativos para 
poder correlacionar el corrimiento del marco de lectura en experimentos posteriores con 
la acumulación de peptidil-tRNA. Se escogió Lisina, que es el primer aminoácido en 
tener el mayor porcentaje de acumulación de peptidil-tRNA (a los 6 min. tiene el 75% de 
acumulación), Treonina que es el segundo aminoácido en tener mayor porcentaje de 
acumulación de peptidil-tRNA (a los 12 min. tiene el 75% de acumulación), Glicina que 
es el penúltimo aminoácido en tener menor porcentaje de acumulación de peptidil-tRNA 
(a los 40 min. tiene el 25% de acumulación), 
 
 Se realizaron tres construcciones (Véase Diagrama No. 1): 
 
• La primera construcción lleva insertada la secuencia resbalosa T TTC (E. 
Loeza, en preparación) con la secuencia adyacente (codón hambriento) de 
lisina (AAG), a esta construcción se le nombró pEK-AAG. 
 
17 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
• La segunda construcción lleva insertada la secuencia resbalosa (T TTC) con la 
secuencia adyacente de treonina (ACC), a esta construcción se le nombró pEK-
ACC. 
 
• La tercera construcción lleva insertada la secuencia resbalosa (T TTC) con la 
secuencia adyacente de glicina (GGC), a esta construcción se le nombró pEK-
GGC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Estas construcciones sólo se diferencian por el codón hambriento adyacente a la 
secuencia T TTC, esto con el fin de proporcionar las mismas condiciones para los 
experimentos posteriores. En el Diagrama No. 2 se muestran las secuencias de dichas 
fusiones. 
 
 La finalidad de estas construcciones es evidenciar el posible cambio en el marco 
de lectura, ya que en el segundo codón río abajo del codón hambriento se encuentra un 
codón de paro, por lo tanto si no hay corrimiento en el marco de lectura del mRNA se 
termina el proceso de traducción, dando por consiguiente una cadena polipeptídica 
corta y anulando la síntesis de la proteína reportera β-galactosidasa. 
 
T TTC GGC GTT TAG G 
laci q lac z 
T TTC AAG GTT TAG G 
T TTC ACC GTT TAG G 
β−β−β−β− lactamasa 
pEK-AAG 
 
 
pEK-ACC 
 
 
pEK-GGC 
1370 
Hind III 
AUG 
O P SD 
Diagrama No. 1: Construcción de las secuencias pEK-AAG, pEK -ACC, pEK -GGC. A partir del 
vector de expresión pEK-0-Frame por los sitios de restricción Hind III y Bam Hl se insertó el 
oligonucleótido correspondiente a la secuencia en la que se presume hay corrimiento del marco de 
lectura. O=Operador, P=Promotor, SD= Shine-Dalgarno. Estas construcciones son inducidas con 
IPTG. 
1390 
 BamH l 
18 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNAde una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 En el caso contrario; esto es, que haya un desplazamiento (-1) en el marco de 
lectura ribosomal del mRNA provoca la anulación del codón de paro, dando por 
consiguiente la síntesis de la proteína reportera β-galactosidasa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 6.3 Secuenciación de las construcciones 
 
 Estas construcciones fueron secuenciadas para asegurarse de tener el orden 
correcto de los nucleótidos y así evitar cualquier fuente de error. Estas secuenciaciones 
se muestran en las Figuras No. 10, 11, y 12 para los codones hambrientos de treonina y 
glicina respectivamente. 
AAA GTA AGC TTT TTC AAG GTT TAG GGA TCC CCG GGA ATT 
 Lys Val Thr Phe Phe Lys Val Stop 
 Phe Gin Gly Leu Gly Leu Pro Gly Asn 
l 
AAA GTA AGC TTT TTC ACC GTT TAG GGA TCC CCG GGA ATT 
 Lys Val Thr Phe Phe Thr Val Stop 
 Phe His Arg Leu Gly Leu Pro Gly Asn 
ll 
AAA GTA AGC TTT TTC GGC GTT TAG GGA TCC CCG GGA ATT 
 Lys Val Thr Phe Phe Gly Val Stop 
 Phe Arg Arg Leu Gly Leu Pro Gly Asn 
lll 
Diagrama No. 2: Secuencia en tripletes de las fusiones a β−β−β−β−galactosidasa. Se encuentra cada 
triplete con su correspondiente aminoácido en el marco de lectura (0) para las construcciones pEK-
AAG (l), pEK-ACC (ll) y pEK-GGC (lll), con letras azules se indica la secuencia que corresponde al 
vector, y subrayado con una línea punteada se muestra el presunto sitio de corrimiento del marco 
de lectura (-1) en las construcciones pEK-AAG (l), pEK-ACC (ll) y pEK-GGC (lll). En letras rojas se 
muestra el codón hambriento AAG (l), ACC (ll) y GGC (lll). Y el corrimiento del marco de lectura (-1) 
se encuentra evidenciado por las líneas debajo de cada aminoácido 
19 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura No. 10: Secuenciación de la construcción para el codón ham briento de treonina. 
 TThhrr 
20 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura No. 11: Secuenciación de la construcción para el codón ham briento de glicina. 
 GGllyy 
21 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura No. 12: Secuenciación de la construcción para el codón ham briento de lisina. 
22 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
6.4 Evaluación del fenotipo de las cepas C92 ∆∆∆∆lac06 vs 
C92∆∆∆∆lac06pthts 
 
 El primer paso fue evaluar el fenotipo de las cepas (Figura 13). Se encontró que 
la cepa C92∆lac06 crece de una forma uniforme a una temperatura de 40º C, mientras 
que la cepa C92∆lac06pthts muere a la misma temperatura. De la misma forma las 
cepas C92∆lac06 pEK-AAG, C92∆lac06 pEK-ACC, y C92∆lac06 pEK-GGC crecieron de 
manera uniforme, mientras que las cepas C92∆lac06pthts pEK-AAG, C92∆lac06pthts 
pEK-ACC, y C92∆lac06pthts pEK-GGC tuvieron nulo crecimiento. 
 
 a) b) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 c) d) 
 
 
 
 
 
 
 
6.5 Evaluación del crecimiento óptimo de la cepa C9 2∆∆∆∆lac06pth ts 
 
Se evaluó el crecimiento óptimo de la cepa C92∆lac06pthts, ya que como se 
mencionó anteriormente debido al fenotipo de la cepa, ésta muere a una temperatura 
Figura No. 13: Fenotipo de la cepas C92 ∆∆∆∆lac06 y C92 ∆∆∆∆lac06pth ts a 40º C. Las cepas C92∆lac06 
y C92∆lac06pthts (a) se transformaron con los siguiente plásmidos: pEK-AAG (b), pEK-ACC (c) y 
pEK-GGC (d) respectivamente. Las placas se incubaron a 40ºC por 18h. 
23 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
de 40º C. Para escoger la temperatura a la cuál se realizaron los experimentos 
posteriores se tomó en cuenta que cumpliera con las siguientes consideraciones: 
 
• El crecimiento de la cepa C92∆lac06pthts debe ser similar a la cepa C92∆lac06, 
esta condición permite que los resultados obtenidos sean comparables debido a 
que el número de células viables a temperaturas altas es menor. 
• La temperatura elegida debe ser la mayor posible. 
 
A una temperatura de 32º C o menor a ésta se encontró un crecimiento homogéneo 
entre las dos cepas antes descritas, por lo tanto los experimentos se realizaron a 32ºC. 
 
6.6 Determinación cualitativa del cambio del marco de lectura 
 
El primer paso que se realizó fue hacer a las cepas C92∆lac06 y C92∆lac06pthts 
competentes, esto con la premisa de tener transformantes en los pasos subsecuentes, 
una vez que se obtuvieron se procedió a realizar las transformaciones descritas en la 
Tabla No. 1 
 
Cepa s/plásmido pEK-AAG 0F pEK-AAG pEK-ACC pEK-GGC 
C92∆lac06 √ √ √ √ √ 
C92∆lac06pthts √ √ √ √ √ 
 
 
 Las cepas C92∆lac06 y C92∆lac06pthts sin plásmido son controles negativos 
que se utilizaron en los experimentos, debido a que son cepas lacZ- (esto significa que 
no tiene el gen que codifica para la-β-galactosidasa). 
 
 De igual forma se preparó un control positivo, en el cual la actividad de β-
galactosidasa es resultante de la expresión del mRNA lacZ en el marco cero (pEK-
AAG-0F). 
 Una vez transformadas ambas cepas se realizaron tapices en cajas petri, se uso 
IPTG para la inducción del vector. Al agregar 5-Bromo-3-indol-β-D-galactosidasa (X-gal) 
Tabla No. 1: Transformación de las cepas C92 ∆∆∆∆lac06 y C92 ∆∆∆∆lac06pth ts. 
24 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
se evidencía la presencia del la proteína reportera β-galactosidadasa, dando por 
consiguiente un halo azul alrededor del inductor. 
 
 En caso de que no haya actividad de la enzima β-galactosidasa los tapices 
permanecen sin coloración. 
 
En la Figura No. 14 se observan los tapices realizados con la cepa C92∆lac06 
(fila l) y con la cepa C92∆lac06pthts (fila ll) sin transformar (inciso a), transformadas con 
los plásmidos pEK-AAG (inciso b), pEK-ACC (inciso c) y pEK-GGC (inciso d) donde la 
coloración azul sugiere un corrimiento del marco de lectura ribosomal (-1). 
 
En la fila l el inciso a es control negativo debido a que no fue transformada. En el 
inciso b el tapiz muestra una coloración azul alrededor del inductor más intensa de 
todas los tapices de la fila, lo que sugiere un cambio en el marco de lectura ribosomal 
muy frecuente. En el inciso c el tapiz muestra una coloración azul alrededor del inductor 
moderadamente intensa, lo que sugiere un cambio en el marco de lectura ribosomal 
frecuente. En el inciso d el tapiz muestra una discreta coloración azul alrededor del 
inductor, lo que sugiere un cambio en el marco de lectura ribosomal poco frecuente. Por 
lo tanto la cepa C92∆lac06pthts aunqueno debe tener acumulación de peptidil-tRNA los 
resultados obtenidos sugieren que realiza un cambio en el marco de lectura ribosomal 
de forma natural. 
 
En la fila ll el inciso a es control negativo debido a que no fue transformada. En 
el inciso b el tapiz muestra una coloración azul alrededor del inductor más intensa de 
todas los tapices de la fila, lo que sugiere un cambio en el marco de lectura ribosomal 
muy frecuente. En el inciso c el tapiz muestra una coloración azul alrededor del inductor 
moderadamente intensa, lo que sugiere un cambio en el marco de lectura ribosomal 
frecuente. En el inciso d el tapiz muestra muy poca coloración azul alrededor del 
inductor, lo que sugiere un cambio en el marco de lectura ribosomal poco frecuente. Por 
lo tanto la cepa C92∆lac06pthts al tener acumulación de peptidil-tRNA realiza un cambio 
en el marco de lectura ribosomal sugerido por la coloración azul en los tapices. 
 
25 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Al analizar los dos fondos cromosomales en las cepas C92∆lac06 y 
C92∆lac06pthts (inciso a fila I y II respectivamente) no muestran coloración, debido a 
que son LacZ-, y como se mencionó son controles negativos. 
I Il 
a 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
b 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
c 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
d 
Figura No. 14: Actividades diferenciales dependientes del fondo c romosomal. C92∆lac06 (l), 
C92∆lac06 pthts (ll), sin transformar (a), transformadas con los plásmidos: pEK-AAG (b), pEK-ACC (c), 
pEK-GGC (d). El inductor IPTG (4mM) fue colocado en los discos centrales de papel filtro y las placas se 
incubaron a 32º C por 18h. 
26 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
Las cepas transformadas con el plásmido pEK-AAG (inciso b filas I y II) sugieren 
que el corrimiento del marco de lectura para la cepa C92∆lac06pthts es mayor que el 
grado de corrimiento en el marco de lectura para la cepa C92∆lac06, esto se atribuye a 
que en el primer fondo cromosomal hay acumulación de peptidil-tRNA debido a la 
disminución en la actividad de la enzima peptidil-tRNA hidrolasa favoreciendo la 
formación de un codón hambriento que proporciona condiciones idóneas para el 
corrimiento del marco de lectura. 
 
En conjunto, para las cepas transformadas con el plásmido pEK-ACC (inciso c 
filas I y II), y pEK-GGC (inciso d filas I y II) sugieren un mayor grado de corrimiento en el 
marco de lectura para la cepa C92∆lac06pthts evidenciado por la coloración azul 
alrededor del inductor más intensa que la coloración obtenida por cepa C92∆lac06. 
 
6.7 Determinación cuantitativa del cambio en el mar co de lectura. 
 
La coloración azul de los tapices sugirió un cambio en el marco de lectura 
ribosomal, por lo tanto se decidió cuantificar estos resultados para poder así establecer 
el porcentaje del cambio del marco de lectura para cada cepa. Las cepas apropiadas se 
crecieron en medio líquido para poder determinar la actividad de la enzima β-
galactosidasa. 
 
6.7.1 Fondo Cromosomal C92 ∆∆∆∆lac06 
 
En la Tabla No. 2 se muestran los datos de absorbancia para el crecimiento de 
las cepas C92∆lac06pEK-AAG, C92∆lac06 pEK-ACC y C92∆lac06 pEK-GGC, leídos en 
un espectrofotómetro con una longitud de onda de 600nm. El crecimiento de la cepa fue 
en medio mínimo M63 y se incubaron a una temperatura de 32º C con una agitación 
constante de 250rpm, las alícuotas se tomaron cada media hora durante un total de 3 
horas. 
Para curva de crecimiento ver Gráfica No. 1. 
 
27 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 
pEK-AAG 0,250 0,372 0,482 0,603 0,740 0,811 0,813 
pEK-ACC 0,260 0,386 0,498 0,630 0,756 0,830 0,834 
pEK-GGC 0,260 0,368 0,470 0,585 0,688 0,800 0,819 
 
 Una vez que se tomaron las alícuotas se procedió a determinar la presencia de 
β-galactosidasa, por la técnica de ONPG (para procedimiento ver materiales y métodos) 
las muestras se leyeron en un espectrofotómetro con una longitud de onda de 420nm, y 
los datos obtenidos se muestran en la Tabla No. 3. 
 
 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 
pEK-AAG 0,014 0,023 0,042 0,070 0,107 0,220 0,322 
pEK-ACC 0,002 0,007 0,030 0,045 0,064 0,094 0,163 
pEK-GGC 0,000 0,000 0,005 0,007 0,019 0,039 0,080 
 
 
 Para obtener las unidades de β-galactosidasa por ml de medio se utilizó la 
siguiente ecuación: 
 
 
 
 
 
 
 
 Debido a que las unidades de enzima que se obtuvieron son muy escasas, el 
resultado anterior se multiplica por 1000, esto con el fin de obtener miliunidades de 
enzima (muE) por ml de medio. En la Tabla No. 4 se muestra la cuantificación de β-
galactosidasa para la cepa C92∆lac06 con las respectivas transformaciones realizadas 
y en los tiempos en los que se monitoreo la cinética. 
 
 
 
Tabla No. 3: Determinación de ββββ-galactosidasa en la cepa 
C92∆∆∆∆lac06 transformada con los plásmidos pEK-AAG, pEK-A CC y 
pEK-GGC para una cinética de 3h. 
Tabla No. 2: Crecimiento de la cepa C92 ∆∆∆∆lac06 transformada con los 
plásmidos pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinét ica de 3h. 
Unidades (Absorbancia a 420nm) 
 de = 
 enzima (Tiempo de reacción) (Alícuota tomada para la reacción) (Absorbancia a 600nm) 
28 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 
pEK-AAG 1,47 1,63 2,29 3,05 3,81 7,13 10,45 
pEK-ACC 0,20 0,48 1,59 1,88 2,23 2,97 5,17 
pEK-GGC 0,00 0,00 0,28 0,31 0,73 1,28 2,57 
 
 
Se necesitó tener un intervalo mayor de datos para poder establecer un 
porcentaje de corrimiento en el marco de lectura entre las cepas transformadas 
C92∆lac06, por lo tanto se realizó una cinética de crecimiento con una duración de 
cinco horas (esta cinética se hizo por duplicado). 
 
En la Tabla No. 5 se muestran los datos de absorbancia para el crecimiento de 
las cepas C92∆lac06pEK-AAG, C92∆lac06pEK-ACC y C92∆lac06pEK-GGC, leídos en 
un espectrofotómetro con una longitud de onda de 600nm. El crecimiento de la cepa fue 
en medio mínimo M63 (para composición ver materiales y métodos) y se incubaron a 
una temperatura de 32º C con una agitación constante de 700rpm, las alícuotas se 
tomaron cada media hora durante un total de 5 horas (para procedimiento ver 
materiales y métodos). 
 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 3.5h 4h 4.5h 5h 
pEK-AAG 0,108 0,143 0,199 0,266 0,365 0,495 0,663 0,894 1,070 1,086 1,086 
pEK-ACC 0,110 0,153 0,227 0,314 0,426 0,617 0,844 0,968 0,975 0,995 0,995 
pEK-GGC 0,051 0,072 0,196 0,154 0,217 0,312 0,432 0,625 0,853 0,966 0,971 
pEK-AAG 0,096 0,132 0,188 0,264 0,307 0,482 0,652 0,883 1,000 1,062 1,079 
pEK-ACC 0,066 0,090 0,125 0,108 0,233 0,318 0,466 0,658 0,919 0,980 0,981 
pEK-GGC 0,106 0,138 0,204 0,271 0,375 0,524 0,704 0,944 0,982 0,980 0,983 
 
 
 
Ver curva de crecimiento en la Gráfica No. 1 
 
 
 
 
Tabla No. 4: Miliunidades de ββββ-galactosidasa en la cepa C92 ∆∆∆∆lac06 
transformada con los plásmidos pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC 
para una cinética de 3h 
Tabla No. 5: Crecimiento de la cepa C92 ∆∆∆∆lac06 transformada con los plásmidos pEK-AAG, 
pEK-ACC y pEK -GGC para una cinética de 5h. 
29 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,53,0 3,5 4,0 4,5 5,0
t (h)
A
s 
60
0n
m
 
 
 
 
 
 
 Una vez tomadas las alícuotas se procedió a determinar la presencia de β-
galactosidasa, por la técnica de ONPG las muestras se leyeron en un 
espectrofotómetro con una longitud de onda de 420nm, y los datos obtenidos se 
muestran en la Tabla No. 6. 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 3.5h 4h 4.5h 5h 
pEK-AAG 0,000 0,004 0,007 0,012 0,021 0,061 0,109 0,168 0,239 0,324 0,398 
pEK-ACC 0,000 0,000 0,006 0,011 0,017 0,039 0,072 0,107 0,133 0,198 0,273 
pEK-GGC 0,000 0,000 0,001 0,002 0,003 0,006 0,010 0,025 0,038 0,069 0,086 
pEK-AAG 0,000 0,004 0,008 0,014 0,023 0,063 0,115 0,171 0,240 0,341 0,421 
pEK-ACC 0,000 0,000 0,003 0,003 0,009 0,019 0,041 0,072 0,128 0,180 0,255 
pEK-GGC 0,000 0,000 0,000 0,001 0,005 0,007 0,014 0,028 0,048 0,077 0,094 
 
 
Tabla No. 6: Determinación de ββββ-galactosidasa en la cepa C92 ∆∆∆∆lac06 transformada con los 
plásmidos pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC para una cinét ica de 5h. 
Gráfica No. 1: Curva de crecimiento para el fondo cromosomal C92 ∆∆∆∆lac06. Se muestra la cepa 
C92∆lac06 transformada con los plásmidos:. pEK-AAG, pEK-ACC, y pEK-GGC, se 
realizó por duplicado 
30 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 Para obtener las unidades de β-galactosidasa por mL de medio se utilizó la 
ecuación mostrada anteriormente. 
 
En la tabla No. 7 se muestra la cuantificación de la actividad de β-galactosidasa 
para la cepa C92∆lac06 transformada con respectivas construcciones y realizada 
durante 5h. 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 3.5h 4h 4.5h 5h 
pEK-AAG 0,0 1,6 2,1 2,7 3,4 7,2 9,7 11,1 13,1 17,5 21,6 
pEK-ACC 0,0 0,0 1,6 2,1 2,3 3,7 5,0 6,5 8,1 11,7 16,1 
pEK-GGC 0,0 0,0 0,3 0,8 0,8 1,1 1,4 2,4 2,6 4,2 5,2 
pEK-AAG 0,0 1,8 2,5 3,1 4,4 7,7 10,4 11,4 14,1 18,9 23,0 
pEK-ACC 0,0 0,0 1,4 1,6 2,3 3,5 5,2 6,4 8,2 10,8 15,3 
pEK-GGC 0,0 0,0 0,0 0,2 0,8 0,8 1,2 1,7 2,9 4,6 5,6 
 
 
 
 En la Gráfica No. 2 se muestra la síntesis de β-galactosidasa para el fondo 
cromosomal C92∆lac06 para cinética de 3h y 5h (esta última realizada por duplicado). 
 
 La cepa C92∆lac06 pEK-AAG tuvo la síntesis más alta de β-galactosidasa, 
poniendo de manifiesto que tiene mayor frecuencia en el corrimiento del marco de 
lectura. En el caso de la cepa C92∆lac06 pEK-ACC representada con un cuadrado, 
tiene menor síntesis de β-galactosidasa que la anterior, pero mayor que la cepa 
C92∆lac06 pEK-GGC representada con un triángulo, ésta última sugiere tener el menor 
grado de corrimiento en el marco de lectura que las dos anteriores. 
Tabla No. 7: Miliunidades de ββββ-galactosidasa en la cepa C92 ∆∆∆∆lac06 con los plásmidos 
pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC respectivamente para una cinética de 5h. 
31 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
0
5
10
15
20
25
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
t (h)
m
uE
/m
L
 
 
 
 
 
6.7.2 Fondo Cromosomal C92 ∆∆∆∆lac06pth ts 
 
En la Tabla No. 8 se muestran los datos de absorbancia para el crecimiento de 
las cepas C92∆lac06pthts pEK-AAG, C92∆lac06pthts pEK-ACC y C92∆lac06pthts pEK-
GGC, leídos en un espectrofotómetro con una longitud de onda de 600nm. El 
crecimiento de la cepa fue en medio mínimo M63 y se incubaron a una temperatura de 
32º C con una agitación constante de 700rpm, las alícuotas se tomaron cada media 
hora durante un total de 3 horas. 
 
 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 
pEK-AAG 0,125 0,193 0,266 0,306 0,480 0,547 0,680 
pEK-ACC 0,230 0,286 0,334 0,463 0,606 0,670 0,736 
pEK-GGC 0,204 0,289 0,360 0,459 0,570 0,756 0,859 
 
 
Tabla No. 8: Crecimiento de la cepa C92 ∆∆∆∆lac06pth ts 
transformada con los plásmidos pEK-AAG, pEK-ACC y p EK-
GGC para una cinética de 3h. 
Gráfica No. 2: Cuantificación de ββββ -galactosidasa para el fondo cromosomal C92 ∆∆∆∆lac06. Se 
muestra la cepa C92∆lac06 transformada con los plásmidos:. pEK-AAG, pEK-ACC, y 
. pEK-GGC. Se realizó por triplicado (uno a 3h y dos a 5h para cada construcción). 
32 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 Una vez tomadas las alícuotas se procedió a determinar la presencia de β-
galactosidasa, por la técnica de ONPG las muestras se leyeron en un 
espectrofotómetro con una longitud de onda de 420nm, y los datos obtenidos se 
muestran en la Tabla No. 9. 
 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 
pEK-AAG 0,011 0,026 0,056 0,075 0,150 0,199 0,299 
pEK-ACC 0,012 0,018 0,025 0,052 0,078 0,112 0,166 
pEK-GGC 0,001 0,004 0,008 0,015 0,032 0,048 0,076 
 
 
 Para obtener las unidades de β-galactosidasa por mL de medio se utilizó la 
ecuación mencionada anteriormente. En la tabla No. 10 se muestra la cuantificación de 
β-galactosidasa para la cepa C92∆lac06pthts con las respectivas transformaciones 
realizadas y en los tiempos en los que se monitoreo la cinética. 
 
 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 
pEK-AAG 2,32 3,55 5,54 6,45 8,22 9,57 11,57 
pEK-ACC 1,37 1,66 1,97 2,96 3,39 4,40 5,94 
pEK-GGC 0,13 0,36 0,58 0,86 1,48 1,67 2,33 
 
Se necesitó tener un mayor intervalo de datos para poder establecer una 
cuantificación del corrimiento en el marco de lectura entre las cepas transformadas 
C92∆lac06pthts, por lo tanto se realizó una cinética de crecimiento con una duración de 
cinco horas (esta cinética se hizo por duplicado). 
 
En la Tabla No. 11 se muestran los datos de absorbancia para el crecimiento de 
la cepa C92∆lac06pthts pEK-AAG, C92∆lac06pthts pEK-ACC y C92∆lac06pthts pEK-
GGC, leídos en un espectrofotómetro con una longitud de onda de 600nm y con las 
condiciones anteriormente mencionadas. 
 
Tabla No. 9: Determinación de ββββ-galactosidasa en la cepa 
C92∆∆∆∆lac06pth ts transformada con los plásmidos pEK- AAG, 
pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 3h. 
Tabla No. 10: Miliunidades de ββββ-galactosidasa en la cepa 
C92∆∆∆∆lac06pth ts transformada con los plásmidos pEK- AAG, 
pEK-ACC y pEK-GGC para una cinética de 3h. 
33 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 3.5h 4h 4.5h 5h 
pEK-AAG 0,166 0,200 0,280 0,359 0,407 0,470 0,538 0,609 0,689 0,786 0,872 
pEK-ACC 0,157 0,200 0,251 0,322 0,419 0,514 0,555 0,637 0,799 0,895 0,995 
pEK-GGC 0,139 0,186 0,254 0,330 0,407 0,494 0,580 0,694 0,795 0,866 0,971 
pEK-AAG 0,171 0,227 0,293 0,340 0,439 0,479 0,541 0,695 0,765 0,852 0,965 
pEK-ACC 0,138 0,180 0,250 0,307 0,399 0,450 0,561 0,610 0,746 0,832 0,946 
pEK-GGC 0,173 0,230 0,309 0,369 0,455 0,530 0,617 0,739 0,802 0,940 1,069 
 
 
Ver curva de crecimiento en la Gráfica No. 3 
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
t (h)
A
s 
60
0n
m
 
 
 
 
 
 Una vez tomadas las alícuotas se procede a determinar la presencia de β-
galactosidasa, por la técnica de ONPG (para procedimiento ver materiales y métodos) 
las muestras se leyeron en un espectrofotómetro con una longitud de onda de 420nm, y 
los datos obtenidos se muestran en la Tabla No. 12. 
 
Tabla No. 11: Crecimiento de la cepa C92 ∆∆∆∆lac06pth ts transformada con los plásmidos pEK-
AAG, pEK -ACC y pEK -GGC para una cinética de 5h. 
Gráfica No. 3: Curva de crecimiento para el fondo cromosomal C92 ∆∆∆∆lac06pth ts. Se muestra la 
cepa C92∆lac06pthts transformada con los plásmidos: pEK-AAG, pEK-ACC y pEK-GGC. 
Se realizó por duplicado 
34 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNAde una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 3.5h 4h 4.5h 5h 
pEK-AAG 0,005 0,011 0,026 0,039 0,060 0,089 0,120 0,174 0,280 0,374 0,552 
pEK-ACC 0,000 0,000 0,009 0,019 0,032 0,051 0,071 0,104 0,180 0,248 0,388 
pEK-GGC 0,000 0,000 0,000 0,002 0,009 0,014 0,022 0,038 0,054 0,088 0,139 
pEK-AAG 0,002 0,014 0,030 0,041 0,065 0,093 0,129 0,196 0,304 0,419 0,639 
pEK-ACC 0,000 0,000 0,009 0,021 0,035 0,044 0,080 0,114 0,176 0,259 0,394 
pEK-GGC 0,000 0,000 0,000 0,001 0,006 0,010 0,020 0,030 0,050 0,080 0,130 
 
 
 Para obtener las unidades de β-galactosidasa por ml de medio se utilizó la 
ecuación mostrada anteriormente. 
 
En la tabla No. 13 se muestra la actividad de β-galactosidasa para la cepa 
C92∆lac06pthts con las respectivas transformaciones realizadas durante las 5h en las 
que se monitoreo la cinética. 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 3.5h 4h 4.5h 5h 
pEK-AAG 1,8 2,9 4,9 5,7 7,8 10,0 11,7 15,0 21,4 25,0 33,3 
pEK-ACC 0,0 0,0 1,9 3,1 4,0 5,2 6,7 8,6 11,9 14,6 20,5 
pEK-GGC 0,0 0,0 0,0 0,3 1,2 1,5 2,0 2,9 3,6 5,3 7,5 
pEK-AAG 0,7 3,2 5,4 6,3 7,8 10,2 12,5 14,8 20,9 25,9 34,9 
pEK-ACC 0,0 0,0 1,9 3,6 4,6 5,1 7,5 9,8 12,4 16,4 21,9 
pEK-GGC 0,0 0,0 0,0 0,1 0,7 1,0 1,7 2,1 3,3 4,5 6,4 
 
 
 En la Gráfica No. 4 se muestra la actividad de la enzima β-galactosidasa para el 
fondo cromosomal C92∆lac06pthts para las cinéticas de 3h y 5h (esta última realizada 
por duplicado). Con un rombo se representa a la cepa C92∆lac06pthts pEK-AAG la cuál 
tiene la actividad más alta de β-galactosidasa, poniendo de manifiesto que tiene mayor 
frecuencia en el corrimiento del marco de lectura. En el caso de la cepa C92∆lac06pthts 
pEK-ACC representada con un cuadrado, tiene menor actividad de β-galactosidasa que 
la anterior, pero mayor que la cepa C92∆lac06pthts pEK-GGC representada con un 
triángulo, ésta última tiene el menor grado de corrimiento en el marco de lectura que las 
dos anteriores. 
Tabla No. 12: Determinación de ββββ-galactosidasa en la cepa C92 ∆∆∆∆lac06pth ts transformada con 
los plásmidos pEK -AAG, pEK -ACC y pEK -GGC para una cinética de 5h. 
Tabla No. 13: Miliunidades de ββββ-galactosidasa en la cepa C92 ∆∆∆∆lac06pthts con los plásmidos 
pEK-AAG, pEK -ACC y pEK -GGC para una cinética de 5h. 
35 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
t (h)
m
U
E
/m
L
 
 
 
 
6.7.3 Comparación del grado de corrimiento en el ma rco de lectura 
para los fondos cromosomales C92 ∆∆∆∆lac06pthts vs C92∆∆∆∆lac06. 
 
 Se realizó un promedio de las miliunidades de β-galactosidasa para cada una de 
las construcciones de las cinéticas realizadas para la cepa C92∆lac06 (ver Tabla No. 
14). 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 3.5h 4h 4.5h 5h 
pEK-AAG 0,491 1,685 2,288 2,943 3,865 7,356 10,16 11,22 13,63 18,22 22,25 
pEK-ACC 0,127 0,279 1,517 1,858 2,282 3,4 5,121 6,446 8,138 11,25 15,72 
pEK-GGC 0 0 0,193 0,432 0,775 0,979 1,379 2,049 2,748 4,412 5,417 
 
Tabla No. 14: Promedio de las tablas No. 4 y No. 7 en miliunidad es de ββββ-galactosidasa para 
las cinéticas realizadas en la cepa C92 ∆∆∆∆lac06 con los plásmidos pEK-AAG, pEK- ACC y 
pEK-GGC. 
Gráfica No. 4: Cuantificación de ββββ-galactosidasa para el fondo cromosomal C92 ∆∆∆∆lac06pthts. Se 
muestra la cepa C92∆lac06pthts transformada con los plásmidos: . pEK-AAG, pEK-ACC y 
. pEK-GGC. Se realizó por triplicado (uno a 3h y dos a 5h para cada construcción). 
36 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 Para las cinéticas realizadas de la cepa C92∆lac06pthts se realizó de igual forma 
un promedio de las miliunidades de β-galactosidasa para cada una de las 
construcciones realizadas (ver tabla No. 15) 
 
Plásmido 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 3.5h 4h 4.5h 5h 
pEK-AAG 1,592 3,229 5,272 6,171 7,925 9,92 11,95 14,94 21,15 25,46 34,08 
pEK-ACC 0,458 0,552 1,917 3,22 4,008 4,922 6,725 9,214 12,14 15,48 21,22 
pEK-GGC 0,043 0,121 0,195 0,441 1,112 1,385 2,01 2,509 3,428 4,914 6,967 
 
 
 En la gráfica No. 5 se muestra la actividad de β-galactosidasa expresada en 
miliunidades de enzima para cada una de las construcciones realizadas en los dos 
fondos cromosomales. 
0
5
10
15
20
25
30
35
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
t (h)
m
uE
/m
L
 
 
 
Gráfica No. 5: Cuantificación de ββββ-galactosidasa para los fondos cromosomales C92 ∆∆∆∆lac06 vs 
C92∆∆∆∆lac06pthts. Se muestra la cepa C92∆lac06pthts transformada con los plásmidos:.. pEK-AAG, 
. pEK-ACC, y pEK-GGC, y la cepa C92∆lac06 transformada con los plásmidos:. pEK-
AAG, pEK-ACC, y pEK-GGC 
Tabla No. 15: Promedio de las tablas No. 10 y No. 13 en miliunid ades de ββββ-galactosidasa 
para las cinéticas realizadas en la cepa C92 ∆∆∆∆lac06pth ts con los plásmidos pEK-AAG, 
pEK-ACC y pEK-GGC. 
37 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 
 La cepa C92∆lac06pthts pEK-AAG tiene una alta expresión de β-galactosidasa 
en el curso de la cinética, lo que sugiere una mayor frecuencia de cambio en el marco 
de lectura ribosomal, sin embargo al comparar la misma construcción en el fondo 
silvestre se observa una menor expresión de β-galactosidasa evidenciando una menor 
frecuencia de cambio en el marco de lectura ribosomal. 
 
 En la cepa C92∆lac06pthts pEK-ACC se presenta una moderada expresión de β-
galactosidasa lo que propone una frecuencia moderada en el cambio del marco de 
lectura ribosomal, sin embargo al comparar la misma construcción en el fondo silvestre 
se observa una menor expresión de β-galactosidasa evidenciando una menor 
frecuencia de cambio en el marco de lectura ribosomal. 
 
 La cepa C92∆lac06pthts pEK-GGC presenta una baja expresión de β-
galactosidasa lo que sugiere una mínima frecuencia del cambio en el marco de lectura 
ribosomal. Al comparar la misma construcción en el fondo silvestre se observa todavía 
una menor expresión de β-galactosidasa aunque esta diferencia es sumamente discreta 
se evidencía una menor frecuencia de cambio en el marco de lectura ribosomal. 
 
 Para determinar un porcentaje de actividad de la cepa C92∆lac06pthts con 
respecto a la cepa C92∆lac06 primero se obtiene la resta de las mUE para la cepa 
C92∆lac06pthts (Tabla No. 15) con respecto a la C92∆lac06 (Tabla No. 14), para 
determinar cuántas mUE hay más en la cepa C92∆lac06pthts lo cuál nos dará un valor 
estadístico del corrimiento en el marco de lectura. (ver Tabla No. 16). 
 
Codón 
hambriento 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 3.5h 4h 4.5h 5h 
AAG 1,1 1,5 3,0 3,2 4,1 2,6 1,8 3,7 7,5 7,2 11,8 
ACC 0,3 0,3 0,4 1,4 1,7 1,5 1,6 2,8 4,0 4,2 5,5 
GGC 0,0 0,1 0,0 0,0 0,3 0,4 0,6 0,5 0,7 0,5 1,6 
 
 
Tabla No. 16: Resta de las mUE para la cepa C92 ∆∆∆∆lac06pthts con respecto a la cepa C92 ∆∆∆∆lac06 
dependiendo el codón hambriento. 
38 
 
Grado de corrimiento en el marco de lectura en función al codón hambriento en la traducción del mRNA de una cepa deficiente de Peptifil-tRNA hidrolasa 
 
CINVESTAV-UPIBI 
 
 En la Tabla No. 17 se muestran los porcentajes de corrimiento en el marco de 
lectura de la cepa C92∆lac06pthts tomando como referencia la cepa C92∆lac06. Se 
evaluó el porcentaje de corrimiento en el marco de lectura con los distintos codones 
hambrientos utilizados, esto a los diferentes tiempos en que se monitorearon las 
cinéticas. 
 
Codón 
hambriento 0h 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 3.5h 4h 4.5h 5h 
AAG 224,2 91,6 130,4 109,7 105,0 34,9 17,6 33,2 55,2 39,7