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Microscopía de Campo Claro DEFINICIÓN: En campo claro toda la luz desde el espécimen y sus alrededores es colectada por el obje6vo para formar una imagen contra un fondo brillante. TECNOLOGÍA: El campo claro es la forma más simple de microscopía donde la luz pasa a través de o reflejada del espécimen. La iluminación no se altera por aditamentos que cambien las propiedades de la luz (como polarizadores o filtros). Microscopía de fluorescencia La fluorescencia es el resultado de un proceso de tres etapas: (1) el fluoróforo se excita con una long. de onda específica, pasa de S0 a S1’, (2) permanece excitado (1-‐10 nanosegundos) y decae (3) emi6endo fluorescencia volviendo al estado basal S0. Accesorio para fluorescencia Ej.: GFP absorbe luz a 395 nm (azul) y emite luz verde a 509 nm de longitud de onda. Cómo es el plásmido de transferencia? Izquierda Derecha Promotor Reportero Plásmido de transferencia Secuencias homólogas específicas (flanqueantes) y gen reportero Flanqueantes izquierdo y derecho, son secuencias homólogas al genoma viral, que son con6guas (izq. y der.) al gen (o región de genoma) que deseo reemplazar, al ocurrir la recombinación homóloga, estas secuencias quedan intactas en el genoma y sólo se modifica lo que está entre ellas (gen target). Gen reportero, es el gen que cuando se exprese en el virus recombinante, va a permi6r que sea iden6ficada la placa de lisis que genere. Puede codificar para: una proteína fluorescente observable por microscopía de fluorescencia (ej. GFP), o una enzima detectable por medio de 6nción específica (ej.: beta-‐galactosidasa) Cómo construyo un plásmido de transferencia? Una forma es hacerlo mediante diges6ón del genoma viral y recuperación de segmentos que flanquean al gen deseado, y luego se realiza el clonado molecular del reportero entre ésos fragmentos. Otra forma, técnicamente más sencilla, es mediante diseño de primers específicos para amplificar las regiones flanqueantes, que permitan la recombinación homóloga en el lugar adecuado del genoma viral, y posterior inserción del gen reportero entre ellas. Ambas estrategias se hacen por biología molecular en el laboratorio. No se precisa saber cómo hacer esto en detalle, sí se debe saber que función 6ene cada parte principal del plásmido, para la modificación del genoma viral. Generación de virus ADN recombinante: Plásmido de transferencia y obtención de clones recombinantes Primera etapa (PLACA DE CULTIVO 1): Transfecto el plásmido de transferencia e infecto con virus Tpo salvaje (wt) Placa de cul6vo + monocapa de cul6vo celular (células eucariotas) Plásmido de transferencia (tranfección) Virus 6po salvaje(infección) En ESTA placa, las células reciben ADN plasmídico (por transfección) y genoma viral (por infección). Después de cierto 6empo, espero que haya recombinación homóloga entre plásmido de transferencia y genoma viral. Va a haber expresión del reportero en células donde ingresó plásmido? La respuesta es “SI”, el gen reportero se va a expresar independientemente de si está ya inserto en el genoma viral, o si se encuentra en las moléculas plasmídicas, porque el reportero está bajo el control de un promotor eucariota. Si el reportero es GFP, y observo el cul6vo tratado (PLACA DE CULTIVO 1) por microscopía de fluorescencia, veré expresión de GFP, pero no puedo decir si está inserto en el genoma viral, o aún se encuentra en el plásmido. Supongamos que el efecto citopá6co del virus aparece a las 48 horas y lo observamos a las 24h post infección, SE OBSERVARÁ expresión de GFP (imagen 1), pero NO veré efecto citopá6co (imagen 2). Izq. Der. Promotor Reportero Microscopía de fluorescencia, veo expresión de GFP (reportero) Microscopía de campo claro, aún no hay efecto citopá6co PLACA DE CULTIVO 1 PLACA DE CULTIVO 1 Esta placa de cul6vo es la que transfectamos e infectamos (diaposi6va anterior), esperamos 48h y recuperamos parfculas virales liberadas al medio, para infectar la PLACA DE CULTIVO 2. Segunda etapa (PLACA DE CULTIVO 2) Con las par[culas virales recuperadas a parTr de la PLACA DE CULTIVO 1, se infecta una NUEVA placa de culTvo, para realizar la selección de virus recombinantes (que incorporaron por recombinación homóloga GFP), también hay presencia de virus Tpo salvaje (que no incorporaron GFP). UTlizando la progenie viral de las placas de lisis fluorescentes (en la PLACA DE CULTIVO 2) puedo aislar el virus recombinante que lleva el reportero GFP en el genoma, en la posición en la que ocurrió la RECOMBINACION HOMOLOGA específica. PLACA DE CULTIVO 2 Luego de un determinado 6empo de infección (con las parfculas obtenidas de la PLACA DE CULTIVO 1), se formarán placas de lisis, las cuales las observaré al microscopio para determinar si ocurrieron eventos de RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA UTlizo las par[culas virales generadas en PLACA DE CULTIVO 1 para INFECTAR PLACA DE CULTIVO 2 (a parTr de este momento sólo trabajo con virus) En microscopía de campo claro, observo TODAS las placas de lisis sin dis6nguir las que 6enen reportero, por lo tanto no puedo diferenciar las placas de lisis ocasionada por virus de 6po salvaje, de las originadas por virus recombinante (GFP+) En microscopíade fluorescencia, observo SÓLO las placas de lisis fluorescentes y puedo determinar fácilmente cuáles son generadas por virus recombinante (GFP+) de las generadas por virus de 6po salvaje (no 6enen GFP). PLACA DE CULTIVO 2 Luego de un determinado 6empo de infección (con las parfculas obtenidas de la PLACA DE CULTIVO 1), se formarán placas de lisis, las cuales las observaré al microscopio para determinar si ocurrieron eventos de RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA Observación (en la PLACA DE CULTIVO 2) de placas de lisis ocasionadas en cul6vo celular, por parfculas virales de 6po salvaje (GFP-‐) y por parfculas virales recombinantes (GFP+). Las figuras de la derecha corresponden la mismo campo de un culTvo infectado con par[culas virales obtenidas de la placa de culTvo 1. Observe las placas que dejan de verse en fluorescencia (virus sin GFP) y las placas que se ven en ambas fotos, clones de virus recombinante (GFP+). Placas de lisis generadas por virus recombinante (GFP+), sólo se señalan 3 a modo ilustraTvo. Placas de lisis generadas por virus Tpo salvaje (GFP-‐), no las veo en fluorescencia. Sólo se s e ñ a l a n 3 a m o d o ilustraTvo. PLACA DE CULTIVO 2 Luego de un determinado 6empo de infección (con las parfculas obtenidas de la PLACA DE CULTIVO 1), se formarán placas de lisis, las cuales las observaré al microscopio para determinar si ocurrieron eventos de RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA Tercera etapa (PLACA DE CULTIVO 3) Aislamiento de virus recombinante (GFP+). Se mulTplican en PLACAS DE CULTIVO diferentes par[culas virales que pertenecen a una única placa de lisis, de esta manera se puede tener una población homogénea de virus recombinante. La determinación de la iden6dad de los virus recombinantes que se ob6enen se determina por diferentes técnicas de biología molecular, ver diaposi6vas de clase de biología molecular y de vectores virales. PLACA DE CULTIVO 3 U6lizando virus obtenido de una placa de lisis posi6va para el reportero (en el ejemplo, las que son GFP+), se infecta de una nueva PLACA DE CULTIVO 3, y se amplifica sólo ese virus recombinante (proveniente de una ÚNICA PLACA DE LISIS). Esta 3era etapa se repite hasta estar seguro de que se está amplificando un único clon de virus recombinante. Tomo una única placa de lisis e infecto una nueva monocapa de células eucariotas
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