1 Diagnostico bacteriologico

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TUBERCULOSIS 
Diagnóstico 
bacteriológico 
ISSN 2451-6406 ISSN 2469-2123
TIPOS DE DIAGNOSTICO 
BACTERIOLOGICO CLINICO 
HISTOPATOLOGICO 
 
EXPERIMENTAL 
 
INMUNOALERGICO 
TECNICAS 
INMUNOLOGICAS 
MOLECULAR 
DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO 
DIRECTO:TINCION 
ZIEHL NEELSEN 
INDIRECTO: 
CULTIVO 
TINCION ZIEHL NEELSEN 
 
OBJETIVO 
 
 Determinar la ácido alcohol resistencia de las 
Micobacterias en muestras clínicas 
 
FUNDAMENTO 
 Capacidad de resistir la decoloración gracias 
al alto contenido de lípidos complejos (ácidos 
micólicos) que poseen en su pared celular 
ESQUEMA DE LA PARED CELULAR 
+ GRAM 
- GRAM 
MICO 
BACTERIAS 
G+ 
Membrana citoplasmática. 
Capa gruesa de 
peptidoglicano 
G- 
Membrana citoplasmatica, 
 pared delgada de 
peptidoglicano, y una 
membrana externa . 
Entre la membrana 
citoplasmática interna y la 
membrana externa se 
localiza el espacio 
periplásmico el cual 
contiene enzimas para la 
nutrición .La membrana 
externa contiene diversas 
proteínas, x ej: las porinas 
También presenta 
lipopolisacaridos (LPS) 
MICO 
BACTERIAS 
Consta de un gruesa pared, 
separada de la membrana 
celular por el espacio 
periplásmico, con varias 
capas. La mas interna es el 
peptidoglicano . Esta capa 
es el esqueleto de la 
bacteria que le da forma y 
rigidez. Externamente, hay 
otras capas compuestas: 
una por polímeros de 
arabinosa y galactosa, Y 
otra capa formada por 
ácidos micolicos 
 
TINCION 
 
 
 
ELEMENTOS NECESARIOS 
ELEMENTOS NECESARIOS 
•Frotis 
 
 
• Carbolfucsina o Fucsina Fenicada 
• Decolorante (Alcohol ácido) 
• Azul de metileno 
 
 
•Fuente de calor 
PREPARACIÓN DEL FROTIS 
 
 
 
 
EXTENSIÓN 
DE LA MUESTRA 
SECADO 
FIJACION 
Tinción 
Favorece la 
observación 
Estructura 
celular 
Estudio 
Forma -
agrupación 
T.DIFERENCIAL 
T.ESPECIALES 
T.SIMPLES 
Materiales 
PROCEDIMIENTO 
1)Cubrir el frotis con Fucsina fenicada (previamente filtrada) . 
2)Calentar 2-3 veces sucesivas con llama de un hisopo de algodón 
embebido en alcohol , pasándolo por debajo del porta objetos 
hasta que se observe emisión de vapores. DURANTE 5 MINUTOS 
3) Lavar con agua corriente a baja presión. 
4)Cubrir la totalidad del porta objetos con alcohol clorhídrico al 1% 
hasta que no desprenda mas fucsina. Dejar Máximo 3 minutos 
5)Lavar con agua corriente a baja presión. 
6)Cubrir la totalidad del porta objetos con azul de metileno.Dejar 
 1 minuto 
7)Lavar con agua corriente a baja presión. 
8)Secar 
 
1)-Cubrir el frotis con Fucsina fenicada 
(previamente filtrada) 
 
 
 
 
 
2)-Calentar 2-3 veces sucesivas con llama 
de un hisopo de algodón embebido en 
alcohol , pasándolo por debajo del porta 
objetos hasta que se observe emisión de 
vapores. 
DURANTE 5 MINUTOS 
5 MINUTOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3) Lavar con agua corriente a baja presión. 
4)-Cubrir la totalidad del porta objetos con 
alcohol clorhídrico al 1% hasta que no 
desprenda mas fucsina. 
Dejar Máximo 3 minutos 
MAXIMO 3 MINUTOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5-Lavar con agua corriente a baja presión. 
6-Cubrir la totalidad del porta objetos con 
azul de metileno. 
Dejar 1 minuto 
1 MINUTO 
7-Lavar con agua corriente a baja presión. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8) Secar 
RESUMEN 
1- Colocar FUSCINA FENICADA 
2-CALOR en forma INDIRECTA hasta 
desprendimiento de vapores. 5MINUTOS 
3-Lavar con agua 
4- Decolorar con ALCOHOL ÁCIDO. 3 MINUTOS 
 5- Lavar con agua 
6- Colocar AZUL DE METILENO. 1 MINUTO 
7- Lavar con agua 
8-SECAR 
 
 
Observación en el microscopio óptico 
• El examen microscópico del extendido se 
realiza con el objetivo de inmersión (100X) . 
• Se coloca una gota de aceite entre el porta y 
el objetivo 
 
 
 
 
 
 
Observación al microscopio 
 Cuidadosa 2-5 ´ 
 
Al enfocar un preparado + se observan formas 
alargadas o redondeadas en acúmulos teñidas con la 
fucsina de un color rosado a fucsia sobre un fondo 
azulado 
 
 
COLORANTE 
PRINCIPAL Y 
CALOR 
Fuscina fenicada 
DECOLORACION 
Alcohol acido 
COLORANTE DE 
CONTRASTE 
Azul de metileno 
INTERPRETACION 
Bacterias AAR + vs Bacterias AAR - 
Manejo de colorantes 
Conclusiones 
 
Fácil 
Rápido 
Económico 
Diagnóstico presuntivo 
precoz 
Falsos negativos y Falsos 
positivos 
No diferencia Micobacterias 
No es diagóstico de certeza 
CULTIVO 
 
 Un cultivo es un método para la multiplicación 
de microorganismos 
 
¿ Por que cultivar? 
Para estudiar un microorganismo en el laboratorio se requiere tener un cultivo puro . 
Es decir, una población de microorganismos iguales 
 
Prueba de Oro 
 
• El aislamiento(obtener un cultivo puro de un microorganismo a partir de un 
“cultivo mixto”) de micobacterias a partir del cultivo de muestras clínicas continúa 
siendo fundamental para el diagnóstico específico de las infecciones por estos 
microorganismos. 
 
 
• El aislamiento del agente causal permite la identificación de la especie 
 
 
http://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismo
Particularidades 
• Las micobacterias, se cultivan con relativa lentitud. 
• Son muy exigentes desde el punto de vista nutritivo 
 MEDIOS SÓLIDOS A BASE DE HUEVO 
 
Löwenstein-Jensen 
Stonebrink 
Preparación del medio de cultivo 
CULTIVO 
MATERIALES NECESARIOS 
• Para liberar los bacilos del material celular o tejido donde se encuentre incluido 
HOMOGENIZACION/ACONDICIONAMIENTO DE LA MUESTRA 
• Para eliminar la flora acompañante 
DECONTAMINACION 
SIEMBRA 
BIOSEGURIDAD 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MATERIALES 
NECESARIOS 
HOMOGENIZACION / 
ACONDICIONAMIENTO DE LA MUESTRA 
 
 
Decontaminación 
• La mayoría de las muestras clínicas remitidas, 
proceden de zonas no estériles donde existe 
una matriz contaminada con una gran 
variedad de microorganismos. Esto puede 
dificultar o impedir el normal desarrollo de las 
micobacterias 
• Requieren una concentración que mejore la 
detección 
DECONTAMINACION 
Método de Petroff 
 
 
 
Agregar a cada 
TUBO 4ml de 
NaOH 
 
Llevar a estufa 
de 37OC 
durante 
15´mezclar los 
tubos cada 5´ 
 
Centrifugar 20’ 
(NO PASARSE!) 
2.000 – 3.000 
revoluciones 
por minuto 
(rpm) 
Tirar el 
sobrenadante 
 
 
 
Agregar al 
sedimento 
unas gotas de 
de rojo fenol 
(indicador de 
pH ) cs de 
ácido sulfúrico 
al 10% para 
neutralizar 
(viraje de rojo 
amarillo 
DECONTAMINACION 
Método de Petroff 
 
Agregar H2O 
destilada 3ml, 
para eliminar los 
restos de acido 
 
 
Centrifugar 10´ 
 
 
 
Resultados 
 
 
Tirar el 
sobrenadante y 
Agregar 1ml de 
H20 destilada 
estéril 
SIEMBRA 
 Es la incorporación de una muestra 
(inóculo), 
a un medio de cultivo con propósitos 
cuantitativos o cualitativos 
SIEMBRA 
INCUBACION 37C -60 días 
INTERPRETACION DE RESULTADOS 
CONCLUSIONES 
Conclusiones 
El cultivo es el método bacteriológico más sensible y 
específico de los que se conocen en la actualidad para 
detectar la presencia de Micobacterias en una muestra 
determinada. 
Permite a partir de la cepa aislada identificar a las 
Micobacterias 
Conclusiones 
La TBC, una enfermedad antigua, ha resurgido en éstos últimos 
años, al punto tal que la OMS la ha declarado una enfermedad 
re-emergente a nivel mundial, constituyéndose en una gran 
amenaza para la salud pública. 
 
De allí que se hace necesario acortar los tiempos de 
diagnóstico 
 
Los métodos moleculares aparecen como un campo con gran 
futuro en lo que puede ser el diagnóstico rápido, sensible y 
especifico de la TBC.