3er teo MICROSCOPIA 2

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La marcación con fluorescencia puede ser con moléculas orgánicas, semiconductores y 
también existe la posibilidad de usar la microscopía de fluorescencia en células vivas. 
EJEMPLO DE USO DE MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA → se tienen células control y células a 
las cuales se les va a agregar el compuesto Tr1-34 → se observará que sucede en las 
células control y en las células tratadas. 
PRIMER RESULTADO → tanto la célula tratada como la célula control poseen el núcleo rojo. 
Con verde se observa la presencia de la proteína Tfx → en las células control, el Tfx se 
encuentra en el citoplasma; en la célula tratada → la proteína Tfx se encuentra en el 
núcleo. ESTA ES UNA MANERA DE OBSERVAR SI UNA PROTEÍNA SE ESTA MOVILIZANDO 
INTRACELULARMENTE ANTE EL TRATAMIENTO DE UN FÁRMACO EXPERIMENTAL (EN ESTE CASO EL TFX) → 
SE OBTIENEN LAS FOTOS DE LOS DIFERENTES FLUOROCROMOS Y DESPUÉS SE LOS SUPERPONE. 
CÉLULAS CONTROL → núcleo 
en rojo; proteína en verde en 
el citoplasma. 
CÉLULAS TRATADAS → tanto el 
fluorocromo verde como el 
fluorocromo rojo están en el 
mismo lugar espacial → esto 
confirmaría que la proteína 
se transloco al núcleo → 
cuando se superponen las 
imágenes → rojo con verde 
→ el resultante es amarillo. 
 
Tfx → no está distribuido homogéneamente en todo el citoplasma → está confinado en un 
dominio en particular. En este ejemplo no podría saberse → pero se podría marcar otras 
organelas con otro color y ver si el verde colocaliza con el azul y de esa manera saber, en 
condiciones controles, donde se encuentra el Tfx antes de translocarse al núcleo. SIEMPRE 
QUE QUIERO SABER EN QUE ORGANELA O ESTRUCTURA ESTÁ UNA DETERMINADA PROTEÍNA → SE 
DEBEN UTILIZAR DIFERENTES MARCADORES Y VER CON QUE MARCADOR CODISTRIBUYE. 
 
Microscopía 2 
3° T E O R I C O 
LA PRIMER FILA DE ARRIBA → CÉLULAS 
CONTROL; FILAS POSTERIORES → CÉLULAS 
TRATADAS. 
SE BUSCÓ VER A LA PROTEÍNA β-CATENINA → 
que está marcada en verde por 
inmunofluorescencia → se quería ver 
dónde estaba localizada en las células 
control y que le pasaba cuando se 
trataba con un determinado compuesto. 
IMAGEN DE ARRIBA A LA IZQUIERDA → se usó 
Hoeschst → los núcleos están azules y la 
β-catenina está en los bordes. 
IMAGEN DE ARRIBA AL CENTRO → se utiliza 
concanavalina A → la cual es una 
lectina que se une a glicoproteínas para 
evidenciar principalmente retículo 
endoplasmático → se observa en rojo el retículo endoplasmático; y nuevamente en los 
bordes la β-catenina en verde. 
IMAGEN ARRIBA A LA DERECHA → se utiliza Giantina → proteína específica de la red trans del 
Golgi → marca particularmente un grupo de cisternas del Golgi. 
LO QUE SE MUESTRA CON ESTE TRABAJO ES QUE → EL TRATAMIENTO HACIA QUE LA PROTEINA β-
CATENINA COLOCALICE CON GIANTINA → EL TRATAMIENTO HACE QUE LA β-CATENINA SE LOCALICE 
EN LA RED TRANS DEL GOLGI. 
Para poder hacerse una inmunofluorescencia de este estilo → primero se deben fijar las 
células → la célula al fijarse pierde la viabilidad → además se debe permeabilizar la 
membrana para que pueda ingresar el anticuerpo o el fluorocromo. LAS CÉLULAS, PARA 
PODER HACER LA INMUNOFLUORESCENCIA, EN ESTE CASO, DEBERÍA SER NO VIABLES. 
Hay casos en que interesa ver la movilización o translocación de la proteína in vivo → con 
inmunofluorescencia para este caso particular no sería posible → entonces, lo que se 
desarrolló → son las llamadas PROTEÍNAS FLUORESCENTES. 
 
 
La primera proteína bio-luminicente que se utilizó para la microscopía de fluorescencia → 
es la PROTEÍNA GFP → la cual fue encontrada en organismos acuáticos. Esta proteína 
forma, con 11 láminas beta y con sus aminoácido → un CENTRO CRÓMOFORO → es una 
proteína, cuya configuración le permite ser fluorescente. Entonces → la GFP es una 
proteína fluorescente verde; pero por diferentes mutaciones y por el estudio de diferentes 
organismos → hay proteínas de distintos colores → las cuales permiten marcar diferentes 
organelas o diferentes proteínas. 
Lo que se debería hacer, si quisiese ver, por ejemplo, a la proteína Tfx verde → SE DEBE 
GENERAR UNA PROTEÍNA QUIMÉRICA O UNA PROTEÍNA DE FUSIÓN ENTRE LA PROTEÍNA DE INTERÉS Y LA 
PROTEÍNA FLUORESCENTE (GFP u otra). 
La proteína Tfx tendrá en su 
estructura primaria a la estructura 
GFP. 
Lo que uno recibe es un PLÁSMIDO → 
es un ADN CIRCULAR. Lo que se hace 
es GENERAR UN PLÁSMIDO CON EL GEN 
DE LA PROTEÍNA DE INTERÉS, y al lado 
tiene el gen de la GFP. CUANDO SE 
INCORPORA EL PLÁSMIDO A LA 
PROTEÍNA SE EMPIEZA A EXPRESAR LA 
PROTEÍNA TFX CON LA PROTEÍNA GFP EN 
SU ESTRUCTURA PRIMARIA. 
 
AL PLÁSMIDO SE LO METE DENTRO DE LAS CÉLULAS → se obtiene 
una célula conjugada con GFP → es una proteína quimérica 
→ es la proteína de interés + la proteína GFP → COMO 
RESULTADO SE VERÁ A LA PROTEÍNA DE INTERÉS EN COLOR VERDE. 
Algunas células tienen verde y otras que no, ya que → no 
todas fueron afectadas con el plásmido. Se podrá 
seleccionar solo aquellas células que hayan recibido el 
plásmido con la proteína GFP. 
ENTONCES → la GFP permite seguir la 
movilización de una proteína → se puede 
ver como la proteína se mueve gracias a 
que se le otorga fluorescencia mediante la 
GFP. La proteína GFP puede ser 
incorporada inclusive a un organismo. 
 
GFP 
El microscopio convencional 
de fluorescenia suele llamarse 
Widefield. 
PROTEÍNA TFX → fluorocromo verde → para excitar este 
fluorocromo, que se desexcitará en verde → se lo debe excitar 
con una luz de color azul → ya que la luz de color azul tiene una 
menor longitud de onda, tiene mayor energía → cuando se 
desexcita la molécula emite una longitud de onda mayor, es decir 
de menor energía. CUANTO MENOR ES LA LONGITUD DE ONDA → 
MAYOR ENERGÍA TIENE ESA ONDA ELECTROMAGNÉTICA. 
La luz de excitación es muchísimo más intensa que la de emisión 
→ la luz para excitar a una molécula fluorescente se genera con 
una lámpara de mercurio y no se pueden mirar directamente al 
ojo. 
 
TODA LA LUZ AZUL EXCITATORIA LLEGA JUNTO CON LA FLUORESCENCIA VERDE → sin embargo, el 
fondo azul es tan intenso que básicamente la fluorescencia verde de la Tfx no se estaría 
viendo (imagen derecha). 
Lo que se desea observar es al color verde fluorescente sobre un fondo negro → ya que la 
microscopia de fluorescencia genera un gran contraste donde se observa la fluorescencia 
de la molécula en un fondo negro → la iluminación de un microscopio de luz transmitida 
no podría ser utilizada para hacer microscopia de fluorescencia → se usa algo llamado 
EPIILUMINACIÓN. 
 
 
SI SE HICIERA LA MARCHA DE RAYOS EN UNA EPIILUMINACIÓN → 
hay una lámpara de mercurio que cuando se calienta 
genera mercurio gaseoso → éste mercurio gaseoso se le 
aplica una diferencia de voltaje y se genera un arco 
voltaico → éste arco voltaico hace que el mercurio emita 
con mucha intensidad en todo el espectro visible → lo que 
generaría una LUZ CON TODO EL ESPECTRO VISIBLE PRESENTE → 
esto pasa por una lente, por un filtro, rebota en una especie 
de espejo, va a la muestra → la muestra se excita, se 
desexcita, emite, pasa por el objetivo, pasa de nuevo por el 
pseudoespejo y llega a la detección. 
EPIILUMINACIÓN → EL CAMINO DE LA LUZ DE EXCITACIÓN ES EL MISMO QUE EL CAMINO DE 
LA LUZ EMITIDA (hasta un determinado punto); mientras que, en la iluminación 
clásica → la luz viene de abajo, pasa la muestra y después llega al ojo. 
Epiiluminación 
Camino de luz de 
iluminación clásica. 
EN LA EPIILUMINACIÓN → la luz ya no llega por un condensador, sino por el mismo objetivo 
del microscopio; la luz de excitación va por el objetivo; y la luz emitida va por el mismo 
objetivo. 
Microscopio de epifluorescencia 
FILAMENTO DE MERCURIO SE EXCITA → se le 
genera un arco voltaico; y de la 
desexcitación del mercurio gaseoso se emite 
un haz de LUZ BLANCA → o sea que tiene 
todas las longitudes de onda. 
El haz de luz se encuentra primero con un filtro 
de excitación → de estaluz blanca que 
posee todas las longitudes de onda, se filtra 
exclusivamente la longitud de onda que 
interesa para excitar al fluorocromo en 
cuestión (en este caso el verde) → se filtra 
una longitud de onda azul, la cual servirá 
para excitar al fluorocromo verde → esta luz 
pasa por el filtro, sigue → y se encuentra en el camino, con el espejo dicroico → para la 
longitud de onda azul, el espejo dicroico se comporta como un espejo → como está a 
45°, la luz azul rebotará y saldrá por el objetivo, llegando a la muestra → en este momento, 
la luz azul excita al fluorocromo → y este se desexcita emitiendo una longitud de onda 
correspondiente al verde → la emisión fluorescente saldrá hacia todos lados → el objetivo 
capta el cono de luz emitido por la muestra → la luz verde, que tiene otra longitud de 
onda, se encuentra con el espejo dicroico → y para esta longitud de onda, el espejo 
dicroico NO ACTÚA COMO ESPEJO → sino que funciona como un vidrio fácilmente 
atravesable para la longitud de onda verde → la luz de onda pasa el espejo dicroico y se 
encuentra con un FILTRO DE EMISIÓN → ÉSTE FILTRA EXCLUSIVAMENTE LA LONGITUD DE ONDA QUE 
SE DESEA OBSERVAR → esto atraviesa nuevamente el ocular, llegando al DETECTOR. 
ESTA CONFIGURACIÓN → donde la luz de excitación no puede llegar al 
ocular ni al detector → genera imágenes donde se ve exclusivamente 
la emisión del fluorocromo de interés. 
ENTONCES → UN MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA TIENE UNA LÁMPARA DE MERCURIO, UN SISTEMA 
DE EPIILUMINACIÓN, Y EN EL CUBO SE ENCUENTRAN → EL FILTRO DE EXCITACIÓN, EL ESPEJO 
DICROICO Y EL FILTRO DE EMISIÓN. 
 
Que pasaría si quiero observar el 
FLUOROCROMO ROJO → se debe cambiar o 
rotar el cubo de manera tal que cambie el 
filtro de excitación, el espejo dicroico y el filtro 
de emisión → ahora ya no filtrará la luz azul, 
sino luz amarilla → esta luz amarilla rebota en 
el espejo dicroico saliendo por el objetivo 
llegando a la muestra → la muestra se 
desexcita y la emisión de fluorescencia roja 
atraviesa ese espejo dicroico en particular → 
pasa por él y por el filtro de emisión → y 
finalmente llega al detector. SE PUEDE IR 
OBSERVANDO POR SEPARADO CADA UNO DE LOS 
FLUOROCROMOS. 
 
TAMBIÉN EXISTEN CUBOS QUE VEN EN SIMULTÁNEO VARIOS FLUOROCROMOS. 
LÁMPARA DE MERCURIO GENERANDO LUZ 
BLANCA → luz blanca se encuentra con el 
cubo (los cubos son intercambiables, se 
rotan) → allí se encontrará con el FILTRO DE 
EXCITACIÓN, con el ESPEJO DICROICO → la luz 
rebotará y saldrá por el objetivo → la 
muestra se desexcitará, la luz será tomada 
por el objetivo y llegará al espejo dicroico 
atravesándolo → finalmente la luz puede ir 
a los oculares y verlos con los ojos; o puede 
observarse con una cámara de captura en 
la cual se toma la foto de la imagen. 
 
SITUACIÓN IDEAL → irradiar con una luz 
determinada, excitar una molécula en punto 
determinado → molécula emite y se capta por el 
objetivo. 
SIN EMBARGO → para que la luz llegue al núcleo de 
una célula (por ejemplo) → atravesó toda la 
célula → mientras el haz de luz fue atravesando 
toda la célula → no excitó solo al fluorocromo de 
interés, sino que excitó a todo lo que estaba en el 
camino → SUELE GENERAR IMÁGENES CON 
FLUORESCENCIA FUERA DE FOCO → fluorescencia que se excitó, que se metió en el objetivo, 
pero que no es de la parte de la célula que se quiere observar → ES UTILIZABLE, SIN 
EMBARGO HAY 2 MÉTODOS PARA MEJORAR A LA FLUORESCENCIA QUE QUEDA FUERA DE FOCO: 
 MÉTODO ANALÓGICO → con lo que se llama microscopio confocal. 
 MÉTODO DIGITAL → procesos de convolución y deconvolución. 
 
 
ES EL MÉTODO ANALÓGICO PARA MEJORAR A LA FLUORESCENCIA FUERA DE FOCO. En el 
microscopio confocal no se usa lámpara de mercurio, sino que SE EXCITA CON LÁSER → láser 
emite una determinada longitud de onda → llega al espejo dicroico → pasa por el 
objetivo y excita a la muestra. 
EL MICROSCOPIO CONFOCAL RECOGE EXCLUSIVAMENTE LA EMISIÓN QUE PROVIENE DEL PUNTO DE 
FOCO DESEADO → solamente pasará la fluorescencia proveniente de ese punto particular 
→ ELIMINANDO LA FLUORESCENCIA FUERA DE FOCO. 
Además, este microscopio 
permite sacar fotos a diferentes 
alturas de una célula → se 
puede ir sacando fotos de 
diferentes planos. 
 
Se obtienen fotos de la célula a diferentes alturas → se puede hacer un análisis de las 
diferentes partes → PERMITE RECONSTRUIR A LA CÉLULA EN 3 DIMENSIONES. 
Microscopio multifotónico → es una variación 
del confocal. 
 
Microscopio confocal 
CONFOCAL → se excita con un láser a una 
determinada longitud de onda (488nm). 
Solamente se va a recolectar el punto focal 
de interés, sin embargo, se excita a toda la 
muestra, ya que el haz del láser pasa por toda 
la muestra. Si bien uno elige el plano focal, la 
fluorescencia restante de las otras moléculas 
que no son de interés → puede llegar a 
meterse dentro del detector. 
 
Segunda imagen → para lograr la excitación del fluorocromo verde, en este caso, se 
necesita entregar una longitud de onda específica. MICROSCOPIO MULTIFOTÓNICO → en vez 
de mandar un único haz de luz con la energía exacta → MANDA DOS HACES DE LUZ CON LA 
MITAD DE ENERGÍA → los dos haces de luz se encuentran en un único punto → ÚNICAMENTE 
PUEDEN EXCITAR CUANDO SE ENCUENTRAN EN UN ÚNICO PUNTO DETERMINADO DE LA CÉLULA. No 
solo recoge la emisión de un punto específico, sino que EXCITA UN PUNTO PARTICULAR DE LA 
CÉLULA. AL ENVÍAR DOS HACES DE LUZ CON LA MITAD DE ENERGÍA SE ENCUENTRAN EN UN PUNTO 
DETERMINADO EL CUAL SERÁ EXCITADO → EN CAMBIO, EN EL CONFOCAL SE EXCITA TODA LA 
MUESTRA. 
Entonces → el multifotónico 
produce una mejor resolución de 
imágenes, se observan con más 
detalles. 
Cuanta más energía tiene una 
onda electromagnética → menos 
penetrancia tiene. Es decir → 
CUANTO MÁS ALTA ES LA ENERGÍA, 
MENOS PROFUNDIDAD VA A LOGRAR. 
Por ejemplo → en el microscopio confocal utilizo una onda de 480 nm → este haz de luz 
puede ingresar hasta una determinada profundidad. En cambio → en el multifotónico, al 
tener la mitad de energía cada uno → van a poder penetrar más en la muestra → esto 
permite, con el multifotónico, realizar un tipo de microscopia llamada MICROSCOPIA INTRA 
VITAL. 
Microscopia intra vital 
Puedo poner un ratón vivo y 
observar por microscopia de 
fluorescencia, por ejemplo, el 
cerebro del ratón. 
SI EL MICROSCOPIO TIENE 
MUCHISIMA APERTRA NUMERICA → 
LA DISTANCIA DE TRABAJO ES MUY 
CORTA → CON LO CUAL NO SE 
LOGRARÍA LA PENETRANCIA A PESAR DE ESTAR UTILIZANDO UN MULTIFOTÓNICO. Entonces → para 
este tipo de microscopía no solo se utiliza el microscopio multifotónico sino que además se 
necesitan ciertos objetivos muy específicos que tienen una buena apertura numérica y 
una distancia de trabajo muy larga (milímetros → desde el punto de vista de la 
microscopía esto es mucho). 
 
 
Proceso de convolución → el simple hecho de observar algo → le va a incorporar algo a 
esa observación que generará una imagen que tendrá → EL COMPONENTE DEL OBJETO 
ORIGINAL + LA CONVOLUCIÓN (o sea, todo lo que aporta la misma observación). 
ENTONCES → LA IMAGEN OBTENIDA ES UN PROCESO DE CONVOLUCIÓN DE LA IMAGEN ORIGINAL. 
Paisaje → lo que se observa en la 
cámara es la imagen de la derecha 
→ sufrió un proceso de CONVOLUCIÓN. 
Se busca como era originalmente lo 
observado → se aplica la 
DECONVOLUCIÓN a la imagen 
obtenida → para ello se necesita 
conocer que convolución provocó el 
sistema de observación en primer 
lugar. 
Se utiliza lo que se llama → FUNCIÓN DE DISPERSIÓN DE UN PUNTO. 
 
Se tiene una imagen de lo que se observa con el microscopio → se la quiere 
DOCONVOLUCIONAR → se busca observar en el mismo microscopio, en las mismas 
condiciones, algo que yo sepa como es originalmente → en general, se miran esferas en 
el microscopio. ENTONCES, SI SE SABE CÓMO ES EL OBJETO Y COMO ES LA RESULTANTE → SE PUEDE 
CALCULAR LA FUNCIÓN DE DISPERSIÓN → es decir,QUE LE PASO A ESE PUNTO PARA 
TRANSFORMARSE EN LA IMAGEN QUE TENÍAMOS ORIGINALMENTE. Se toma la imagen que se 
tenía del microscopio y se le aplica la función inversa → O SEA, A PARTIR DE SABER CÓMO SE 
OBSERVÓ LA ESFERA CON EL MICROSCOPIO, SE ASUME QUE LOS MISMOS CAMBIOS QUE SUFRIÓ ESTA, 
SON LOS QUE SUFRIÓ NUESTRA IMAGEN ORIGINAL → se aplica el PROCESO DE DECONVOLUCIÓN. 
imagen donde la mitad está convolucionada y la otra mitad 
está deconvolucionada (imagen exagerada). 
 
 
 
 
 
 
Convolución 
CASOS DE EPIILUMINACIÓN → en el 
microscopio convencional se 
tenía el cubo; en el microscopio 
confocal se excita por láser; y en 
el microscopio multifotónico los 
dos fotones se encuentran en un 
mismo lugar para generar la 
excitación. 
Hay dos técnicas que se utilizan con microscopia confocal principalmente, aunque se 
puede usar también con el multifotónico o con el convencional → técnicas de FRET y de 
FRAP → ambas técnicas permiten observar algo en particular más allá de la imagen que se 
obtiene con la microscopia. AMBAS TÉCNICAS SIRVEN PARA OBSERVACIÓN EN CÉLULAS VIVAS. 
 
 
LA TÉCNICA DE FRET → EXISTE UNA TRANSFERENCIA DE ENERGÍA A PARTIR DE LA FLUORESCENCIA 
ENTRE DOS FLUOROCROMOS. 
Se tiene dos fluorocromos o dos proteínas fluorescentes → donde se tendrá un donador y 
un aceptor. El donador se excita a una longitud de onda determinada; la particularidad 
que debe existir para que se pueda realizar esta técnica → es que LA EMISIÓN DE UNO DE 
LOS FLUOROCROMOS O PROTEÍNAS FLUORESCENTES TIENE QUE SER LA ENERGÍA DE EXCITACIÓN DEL 
SEGUNDO FLUOROCROMO O PROTEÍNA. 
Dos proteínas → PROTEÍNA X; PROTEÍNA Y. 
Si las dos proteínas están alejadas, cuando se 
excita a la proteína x con 433nm → emitirá la 
fluorescencia 475nm. Si la proteína x e y 
interactúan → tanto la proteína x como la y 
estarán a una distancia menor a 5nm → entonces 
CUANDO SE EXCITE A LA PROTEÍNA CIAN con 433nm 
→ SE VERÁ LA EMISIÓN DE LA PROTEÍNA AMARILLA. 
A partir del microscopio de fluorescencia → evidencio que dos proteínas se encuentran 
muy íntimamente relacionadas de tal manera que las dos proteínas fluorescentes se 
encuentran a una distancia menor a 5nm. CON LA TÉCNICA DEL FRET PUEDO SABER SI DOS 
MOLÉCULAS ESTÁN A UNA DISTANCIA MENOR A 5NM → CON LA MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA. 
No necesariamente deben ser dos proteínas 
distintas → cuando no hace FRET, la proteína va 
a tener una conformación; pero cuando ocurre 
un cambio conformacional que aproxime las 
dos porciones de proteínas fluorescentes → 
ocurrirá FRET y lo que se verá es la emisión de la 
proteína amarilla cuando se excita a la 
proteína celeste. 
LA TÉCNICA DE FRET SIRVE PARA EVALUAR POR MICROSCOPIA LA INTERACCIÓN ENTRE MOLÉCULAS O 
PROTEÍNAS → Y TAMBIÉN SIRVE PARA VER CAMBIOS DE CONFORMACIÓN DENTRO DE UNA MISMA 
PROTEÍNA. 
 
FRET 
 
LA TÉCNICA DE FRAP → DEMUESTRA CÓMO SE RECUPERA LA FLUORESCENCIA EN UNA DETERMINADA 
PORCIÓN O ZONA DE LA CÉLULA EN FUNCIÓN DEL TIEMPO. 
Ejemplo → hay una proteína que está en una organela determinada, ésta proteína está 
conjugada con otra proteína fluorescente. Se quiere observar que le sucede a la proteína 
in vivo. 
SE HACE EL FOTOBLANQUEO → cuando se 
irradian fluorocromos o proteínas 
fluorescentes con mucha intensidad → se 
destruye el centro cromogénico del 
fluorocromo, con lo cual deja de emitir 
fluorescencia. Entonces → SE VA 
OBSERVANDO EN ESA ZONA QUE ES LO QUE 
PASA EN EL TIEMPO → SE BLANQUEA UNA ZONA, 
QUEDARÁ OSCURA YA QUE NO HAY 
FLUORESCENCIA Y SE OBSERVA CUANTO TIEMPO TARDA EN RECUPERARSE LA FLUORESCENCIA → ésta 
florescencia que se está recuperando no es de las proteínas fotoblanqueadas sino de la 
misma proteína fluorescente que viene de otros lados y volviéndose a incorporar en la 
zona. 
De esta manera se pude medir → la velocidad de difusión de una molécula, la velocidad 
de transporte y la compartamentalización. 
ENTONCES → TÉCNICA DEL FRAP → HAY UNA PROTEÍNA FLUORESCENTE, FOTOBLANQUEO A LA MISMA 
→ Y OBSERVO CUANTO TIEMPO TARDA O DE DONDE VIENE LA FLUORESCENCIA QUE ESTÁ LLEGADO A 
LA ZONA FOTOBLANQUEADA → LO CUAL QUIERE DECIR QUE LA PROTEÍNA ESTÁ EN MOVIMIENTO. 
 
 
 
Se pone una molécula, se expresa en la célula → emite fluorescencia 
o se vuelve fluorescente cuando, por ejemplo, interacciona con 
calcio → se observa cómo se produce una corriente de calcio en un 
tiempo cuando se produce, por ejemplo, la fecundación. 
Primero es un punto → que es donde se produce la interacción, allí 
hay calcio o lo que sea que esté midiendo el indicador. Con el 
tiempo esto se va expandiendo en la membrana. ESTO ES UNA TÉCNICA 
IN VIVO. 
 
FRAP 
Indicadores 
 
En este tipo de microscopía no hay óptica → no hay una lente 
de cristal. 
El microscopio electrónico TIENE UN LÍMITE DE RESOLUCIÓN MENOR 
QUE EL MICROSCOPIO ÓPTICO → con lo cual, EL PODER RESOLUTIVO 
ES MAYOR. 
Mientras que el microscopio óptico podía llegar a los 200nm → 
el electrónico puede llegar a resoluciones que están por 
debajo del nivel del átomo (desde un punto de vista teórico). 
Límite de resolución = 0.61. λ/AN 
λ = longitud de onda de la luz transmitida o de la fluorescencia 
emitida por el fluorocromo. 
Hay varías estrategias para lograr el aumento del poder 
resolutivo (o sea, de disminuir el límite de resolución): 
 AUMENTAR LA APERTURA NUMÉRICA. 
 DISMINUIR LA LONGITUD DE ONDA DE LA ONDA 
ELECTROMAGNÉTICA. 
En la microscopia óptica, la longitud de onda esta entre 380-
750nm (espectro visible) → esto permite, teóricamente, llegar a 
200nm de límite de resolución. 
Microscopio electrónico → utiliza ondas electromagnéticas de menor longitud de onda, o 
sea, de mayor energía. EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO UTILIZA UN HAZ DE ELECTRONES QUE TIENE 
UNA LONGITUD DE ONDA DE 0,004nm (4 órdenes de magnitud menor que la longitud de onda 
utilizada en el MO) → desde el punto de vista teórico, se logra una resolución de 0,002nm 
→ cien mil veces menor el límite de resolución comparado con el MO. 
SIN EMBARGO → desde el punto de vista práctico, dada la AN que se logra con los 
elementos que conforman al ME, y la imposibilidad de corregir muchas aberraciones → en 
realidad, lo que se podría lograr con el ME es una resolución de 0,1nm → mil veces menor 
respecto del MO. 
 
Microscopia electrónica 
La construcción es completamente 
diferente → EN EL MO HAY UNA FUENTE DE LUZ 
MIENTRAS QUE EL ME TIENE UN CAÑÓN DE 
ELECTRONES. 
AMBOS TIENEN UNA LENTE CONDENSADORA → 
sin embargo, la del ME → es un 
electroimán que condensa el haz de 
electrones en una muestra (que está sobre 
una rejilla) → luego los haces pasan por 
una LENTE ELECTRÓNICA (que haría de 
objetivo) y por una LENTE PROYECTORA (que 
haría de ocular). 
Dado que la longitud de onda del haz de 
electrones está lejos del espectro visible → 
NO ES OBSERVABLE A LA VISTA → con lo cual, 
se debe utilizar algo que capture el haz de 
electrones y lo transforme en una imagen observable. 
Dado que el haz de electrones tiene una altísima energía → si hubiese aire en el camino → 
el haz de electrones se vería dispersado por los propios átomos que conforman el aire → 
con lo cual, todo está en el vacío → Y COMO LA MUESTRA ESTÁ METIDA DENTRO DE UN VACÍO → 
ES IMPOSIBLE HACER MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE CÉLULAS VIABLES → EL ME NO PERMITE LA 
OBSERVACIÓN DE CÉLULAS O TEJIDOS VIVOS → DEBEN ESTAR FIJADAS. 
La muestra debe pasar varios pasos de preparación: 
 FIJACIÓN (GA y TO4Os). 
 DESHIDRATACIÓN. 
 Cuanto menor es la longitud de onda → mayor es la energía de la onda 
electromagnética → y cuanto mayor energía tiene, menor penetrancia tiene en la 
muestra → con lo cual se debe trabajar con SECCIONES de entre 50-100nm → 
secciones de tejido muy finas. 
 Debido a que en muchos casos, los componentes de los tejidos no son 
electrodensos → hay que CONTRASTAR las muestras utilizando metales pesados → al 
usar componentes electrodensos → los haces de electronesrebotan y se termina 
viendo en negativo a las zonas que no fueron atravesadas por haces de electrones. 
Otra forma de preparación de las muestras, para darle 
electrodensidad a las mismas → es lo que se llama un 
SOMBREADO O REPLICA → lo que se hace es evaporar un metal, 
después se le pone una capa de carbón y se elimina la muestra 
→ se obtiene una réplica en relieve de la muestra. 
 
HAY OTRA TÉCNICA QUE ES EL MICROSCOPIO CRIOELECTRÓNICO → la muestra no se fija sino que 
directamente se congela a muy bajas temperaturas y se observa directamente 
congelado; se puede hacer criofractura del tejido para ver moléculas o la configuración 
de algunas moléculas. 
Tipos de microscopia electrónica 
 
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO → este microscopio 
toma los electrones que rebotan y que son dispersados por la 
muestra. En este microscopio se presenta un DEFLECTOR → 
mueve el haz de electrones para que haga un barrido sobre 
la muestra. Y el DETECTOR se encarga de recolectar aquellos 
electrones que se dispersan. Se genera una imagen 
tridimensional del espécimen. 
Imagen de una arteriola. 
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRASMISIÓN → el espécimen es 
atravesado por el haz de electrones. Imagen de una 
mitocondria → CON MICROSCOPIA ELECTRÓNICA OBSERVO LA 
ULTRAESTRUCTURA. 
 
 
A modo de resumen