4 Cultivo y Fraccionamento teorico 4

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Organización intracelular, comportamientos, etc 
Veo lo que quiero estudiar, 
dónde y cómo 
 
 
 
Técnicas para el estudio celular 
 
 
SISTEMA BIOLÓGICO DE ESTUDIO 
 
Sistema donde quiero estudiar una característica específica de mi célula 
 
❖ IN VIVO: la muestra la obtengo de seres 
vivos (biopsia) o recientemente muertos 
(necropsia) 
Órgano o tejido aislado→ estructura 
aislada→ célula aislada→ célula en cultivo 
→= obtengo 
 
❖ IN VITRO: fuera del organismo (cultivo) 
Se usa para experimentar, 
por ej: el funcionamiento de algún 
fármaco/droga 
 
❖ LIBRE DE CÉLULAS: se aíslan los 
compartimentos (órgano o tejido aislado, 
biopsia, necropsia, estructura aislada, células 
aisladas, células en cultivo, etc) por 
fraccionamiento para estudiar particularidades de la estructura y función celular 
Ej: estudiar las drogas que inactivan las mitocondrias. Para eso bus aislar las mitocondrias puras 
en un tubo de ensayos 
AISLAMIENTO Y CULTIVO CELULAR 
 
Se usan técnicas para el cultivo de células que las mantienen con vida y en un ambiente 
adecuado para el crecimiento y proliferación 
 
CULTIVO: Técnicas que permiten el crecimiento y mantenimiento de células in vitro. 
Se obtienen de humanos, animales de experimentación o línea celular. 
Preserva las propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. 
 
AISLAMIENTO: depende del tejido es la técnica 
 
❖ LÍQUIDOS: 
➢ 1: Permite separar los glóbulos rojos, blancos y las plaquetas 
 
➢ 2: Separa células, moléculas o vesículas 
Se pone un imán marcado con un anticuerpo específico para el antígeno de superficie de la 
célula que me interesa 
El anticuerpo reconoce el antígeno y hace que la célula/ molécula/ vesícula se una al imán 
Con otro imán separo a las partículas de interés 
 
➢ 3: Separo células asistidas por fluorescencia 
Marco a la partícula de interés con un anticuerpo fluorescente y la paso por el citrómetro 
de flujo (envía láser que detectan la emisión fluorescente que permite la separación) 
 
❖ SÓLIDOS: 
En PBS se hace un picadito y se lo somete a enzimas para separar las células de la matriz 
extracelular (tripsina, colagenasa, hialuronidasa) y EDTA (forma complejos con el Ca2+) y luego 
se observa en el microscopio la separación celular 
 
 
Mucha división 
Velocidad rápida 
Velocidad 
constante 
Poca división 
Velocidad lenta 
El tipo celular aislado se recoge en un tubo eppendorf, se centrifuga y se separa el 
sedimento/pellet (células) del sobrenadante (líquido que no me interesa) 
 
CULTIVO PRIMARIO: Se coloca el pellet en un recipiente de cultivo con un medio 
(células obtenidas directamente del adecuado para que prolifere 
organismo vivo o recientemente fallecido). 
 
 
 
VELOCIDAD DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO 
(divisiones celulares/tiempo) 
 
La célula puede dividirse un número finito de veces antes de entrar en SENESCENCIA 
REPLICATIVA→ pérdida de la capacidad de división 
→Inicia cuando la célula alcanza el LÍMITE DE 
HAYFLICK (división n° 50 ) 
→Células in vivo e in vitro quedan detenidas en G0/G1 
→No responden a mitógenos 
→Asociado al acortamiento de telómeros 
 
 
 
 
 
 
TELÓMERO: Extremos del cromosoma que poseen ADN replicativo no 
codificante 
Cierra el cromosoma para estabilizarlo 
En cada división la ADN Polimerasa corta una parte del telómero (envejece al 
cromosoma) 
La TELOMERASA (enzima) evita el acortamiento de lo telómeros ya que repara 
los extremos cortos del cromosoma. Su actividad disminuye a medida que 
avanza la edad (muy activa en jóvenes). 
Para evitar que el cromosoma deje de existir por acortamiento, la célula entra 
en estado quiescente (no se divide, queda en fase G0 o G1) 
 
 
LÍNEA CELULAR 
La célula pierde senectud y requieren la capacidad de dividirse 
Consecuencia de: 
Transformación espontánea por mutación del genoma: 
ooncogénica 
ono oncogénica 
Transformación no espontánea por 
manipulación del ADN: 
o expresión del gen de la telomerasa 
oMutación de genes que inhiben el ciclo celular (para que no se divida) 
 Transformación oncogénica 
 
REQUERIMIENTOS PARA EL CULTIVO 
El color rojo es in indicador de pH: vira a 
allo cuando las células son 
metabólicamente activas (liberan CO2) 
 
 
 
 
 
 
 
Para que pase de G0/G1 a fase S 
 
Para que la célula construya membranas 
 
 
Evita la contaminación por manipulación 
 
 
SUPERFICIE: 
Las células pueden crecer de 2 formas 
Adheridos a un soporte: células de tejido sólido que forman una monocapa 
En suspensión ej: células de la sangre 
 
 Crecimiento adherido a soporte: 
La célula para poder crecer necesita de un SOPORTE donde pueda generar la lámina 
basal y tenga mitógenos, espacio para crecer y se adhiera a la pared del soporte. 
superficie sólida (vidrio o plástico), 
ESTERILIZADA (para evitar contaminación), cubiertos con una sustancia inductora 
de cargas (tiene densidad + o -), colágeno y polilisina 
 
Pasos: 
1) Las células se adhieren al material de cultivo 
Baja densidad de células (10%)= recién cultivado o no proliferó 
2) Crecimiento y llegada a confluencia→cuánto ocupó del recipiente de cultivo 
Para células en suspensión 
 
CULTIVO CONFLUENTE: cultivo con el 80-100% de confluencia→ está listo para hacer un subcultivo 
Disminuye la velocidad de crecimiento por inhibición celular→ mucho contacto entre las células 
 
*Transwells: me permite cultivar en condiciones determinadas 
Tiene un filtro poroso donde se siembra la muestra 
Puedo generar condiciones similares a las del organismo para estudiar algo en particular, por 
ej: 
Migración: Separo la muestra, la coloco en el transwell (células en el medio, abajo está 
vacío) y veo la migración en la superficie basal 
 
Polarización: coloco células que tengan bien definidas la capa apical y basal en el transwell y 
agrego un medio para la superficie apical y otro para la superficie basal. 
 
CULTIVOS BIDIMENSIONALES: crecen y se dividen a lo largo y ancho de la superficie 
CULTIVOS TRIDIMENSIONALES: 
aspecto similar al que encontramos en el organismo 
Se las hace crecer en gotas o patrigel 
 
 
 
CRECIMIENTO EN GOTAS (cultivo esferoide): se siembran pequeñas cantidades 
del medio de cultivo con células separadas en la caja de Petri y se invierte 
Las células no se adhieren al medio de cultivo sino que se aglomeran mediante 
interacciones entre ellas 
 
 
CULTIVO DE ORGANOIDE: cultivo 3D con distintos tipos celulares. El resultado es similar a un órgano 
(DEFINICIÓN EN TALLER 2) 
 
 
Se usan cabinas de seguridad biológica o de flujo láminar 
Tienen filtros para evitar el ingreso de microorganismos a través del aire 
Antes de meter las cosas se desinfectan con EtOH al 70° 
Depende del material con el que se trabaja es el tipo de cabina que se usa y los 
cuidados a tener en cuenta: 
• Tipo I: el material es poco probable que cause una enfermedad en el humano 
Se usa para filtrar medios de cultivo, exrtacción de ARN, entre otros 
• Tipo II: El material puede enfermar o es peligroso para el humano 
Poco probable que se propague y en caso de hacerlo tiene una cura 
Ej: células tumorales humanas, transformación celular, etc 
• Tipo III: material que puede enfermar al humano y se puede propagar pero tiene 
tratamiento eficaz 
• Tipo IV: material que puede enfermar al humano, se puede propagar y no tiene tratamiento. 
 
Es importante esterilizar el medio de cultivo, el ambiente, el operador, las soluciones y el 
material de trabajo 
 
✓ Medio de cultivo y las soluciones de trabajo→ FILTROS con poros de 0,22 
micrones (retienen los microorganismos que me molestan como las bacterias y 
hongos) 
 
 
✓ Material de laboratorio→ calor seco (estufa de esterilización), calor húmedo (autoclave) 
o radiación gamma 
 
 
 
 
 
✓ Operador→ debe usar elementos de protección personal 
✓ Ambiente→ se lava y desinfecta con 
 
Para realizar un cultivo se necesita:Por los pasajes 
 
 
 
No estoy del todo seguro 
del resultado que obtuve 
No están en las mismas 
condiciones que están en 
el organismo 
 
 
 
 
 
APLICACIONES 
 
 
 
1° se coloca en el Mr Frosty para bajarle la 
temperatura lentamente 
2°Mr Frosty se coloca en un freezer 
3° se pasa la muestra al tanque de nutrógeno 
Para que crezcan las células 
Tiene temperatura, humedad 
y atmosfera controladas 
 
 
 
Centrifugación: técnica de separación para aislar o concentrar partículas 
en suspensión usando las distintas formas o pesos de esas partículas 
 
 
 
 
Métodos de Homogeneización: 
 SHOSK O LISIS HIPOTÓNICA: cc sc<cc intracelular 
Hago que el líquido fluya hacia adentro de la célula hasta que explote 
Se usa en células aisladas y con soluciones de NaCl< 130nM (<280 mOsm) 
 
 SONICACIÓN: (células aisladas) se usa un sonicador→ emite sondas de ultrasonido que producen 
burbujas dentro y fuera de la célula 
 
 CONGELACIÓN/DESCONGELACIÓN: el H2O de la célula se congela y daña la membrana 
 
 HOMOGENEIZADOR MECÁNICO: Método por excelencia. Ruptura pro fricción 
 
 
 
 
Separación:por centrifugación: 
 SACAROSA ISOTÓNICA: 
 
Sc de la homogeneización: sacarosa 0,25M (isotonica) + buffer THS HCl 25nM pH 7,4 a 4°C + 
EDTA+ MgCl2 (estbiliza ácidos nucleéicos) + Hielo (para amntener la temperatura) 
El homogenado se centrigufa a distintas velocidades→ CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL: 
obtengo fracciones enriquecidad en algún compartimento (impuras) 
 
 
 
 
 
 
GRADIENTE: permite obtener FRACCIONES PURAS 
Puede ser por VELOCIDAD DE SEDIEMTNACIÓN (depende 
de la masa y forma) donde se centrifuga a una velocidad 
fija y se forman bandas según los pesos de las organelas (la 
mas pesada abajo y la mas liviana arriba) o por EQUILIBRIO 
DE SEDIMENTACIÓN , se centrifuga durante un período 
largo y se separan fracciones según su densidad (pueden 
ser proteinas del adn por ej) 
 
En ambos casos se observan bandas en el tubo que 
corresponden a las fracciones 
 
 
 
 
 
 DYNABEDS: Separar vesículas y compartimentos livianos 
 
 
CARACTERIZACIÓN DE LA FRACCIÓN 
 
Para saber que tengo en las fracciones y si son puras o no 
 Busco una molécula que está presente en la fracción de interés 
o Si está=> tengo lo que busco 
o Si no está => no tengo lo que quiero 
 
 Busco una enzima o lípido exclusiva y veo su está o no midiendo su actividad 
 
 Para saber si es pura o no uso un CRITERIO DE PUREZA→ busco la molécula y la enzima/ lípido y 
descarto todo el resto de los compartimentos→mido las moléculas/enzimas/proteínas/etc del resto y 
verifico que no tengan lo que quiero) 
 
 Una vez hecho esto miro al MET mi fracción para terminar de saber si está pura 
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