Cultivo celular resumen

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Cultivo celular 
Los sistemas biológicos de estudio pueden ser: 
• In vivo – Experimentos que se realizan dentro de un organismo vivo. 
• In vitro – Experimentos que se realizan fuera del organismo mediante una biopsia 
(muestra que se obtiene de un animal vivo), una necropsia (cuando se obtiene de un ser 
vivo sacrificado una muestra de órgano entero o tejido aislado a partir de lo que puedo 
obtener: estructuras aisladas, de las que obtengo células aisladas y de las que obtengo 
células en cultivo). 
• Libre de células: Compuesto por compartimientos aislados como mitocondrias, 
obtenidas por fraccionamiento celular. 
El aislamiento y cultivo de células se lleva a cabo “in vitro” en muestras obtenidas a partir de un 
animal de experimentación, humanos o una línea celular. 
Para aislar un tejido líquido (como sangre o medula ósea) puedo realizarlo a través de 
centrifugación en gradiente, Dynabeats (bolas magnéticas unidas a un anticuerpo contra el 
antígeno de la superficie que quiero separar) o citometría de flujo (FACS) (separación mediante 
un anticuerpo con fluorescencia y un citómetro de flujo) 
Para aislar un tejido solido debo realizar los siguientes pasos: 
1. Disgregación: de manera 
a) Mecánica 
b) Enzimática Digestión de la MEC con colagenasa, hialuronidasa, tripsina 
 Desestabilización de las uniones C-C y C-M con EDTA 
2. Separación: 
a) Centrifugación 
b) Afinidad e imanes/Afinidad y columna 
c) FACS 
Una vez que tengo el tipo celular aislado, se lo recoge generalmente en un tubo Eppendorf, el 
liquido sobrenadante es descartado y el pellet se re-suspende en un medio adecuado y se lo 
traslada a un recipiente para realizar el cultivo, que será un cultivo primario por haber sido 
obtenido directamente del ser vivo. 
En un cultivo primario, la velocidad 
de division de las primeras 
generaciones es muy elevada, luego, 
en la fase II la velocidad de mantiene 
por varias generaciones, y alrededor 
de la generación 50 (p50) las células 
alcanzan el límite de Hayflick y 
presentan senescencia replicativa: 
un proceso en el que la división 
celular queda suspendida en fase 
G0/G1 y no responden a mitógenos. 
 
En general se asocia el proceso de senescencia con el acortamiento de los telómeros (ultima 
secuencia del ADN, que es NO codificante y que en cada división acorta su longitud. A pesar de 
que la telomerasa repara el ADN manteniendo la longitud, mientras envejecemos esta pierde si 
actividad, y las células quedan en G0/G1). 
La senescencia replicativa puede evitarse 
mediante diferentes transformaciones, que dan 
lugar a una línea celular, un cultivo de celulas con 
un período de vida indefinido (considerado 
inmortal). 
Estas transformaciones pueden ser: 
• Transformacion espontanea no 
oncogenica: una transformacion en los 
genomas por ejemplo, celulas de roedores que con las condiciones dadas para cultivo, 
una celula transformada se divide y toma el control. 
• Transformacion no espontanea del genoma: se puede realizar mediante un gen de 
telomerasa, genes involucrados en el ciclo celular, etc. 
• Transformacion oncogenica: El ADN muta pero deriva de tumores. 
 Requerimientos para el cultivo celular: 
 
 Hay dos tipos de cultivo 
• Adheridos a un soporte: MONOCAPA. Usualmente son tejidos 
solidos, que necesitan mitógenos, una densidad adecuada (para 
generar contacto entre ellas) y generar una lámina basal (para esto 
se introduce esa sintesis con superficies sólidas como cápsula de 
petri, multicajas de petri, transwells, multipocillos o botellas, con 
densidad de cargas negativas, positivas o cubiertas de colágeno o 
polisina). 
• En suspensión: Generalmente para cultivos líquidos. Se utilizan 
superficies como las de la monocapa pero no deben haber sido 
tratadas para desarrollar lamina basal. Tambien se utilizan tubos 
Falcon. 
Inhibidores de proteasas (α1 tripsina) 
(se utiliza en el protocolo de 
subcultivo para inactivar la 
tripsina) 
Penicilina. Debido a la manipulación (que puede contaminar) 
Debe ser fetal por la 
alta composición de 
estas sustancias que 
son necesarias 
Confluencia 
La confluencia mide la densidad que ha alcanzado el cultivo celular en monocapa luego de un 
tiempo determinado. Un cultivo confluente o de confluencia total tiene un grado de confluencia 
de 80% a 100%, y es en este caso que debo realizar un subcultivo, ya que al llegar al 100% las 
células disminuyen su crecimiento por inhibición por contacto. 
Los cultivos que proliferan hasta ocupar toda la superficie son los bidimensionales. 
También existen cultivos tridimensionales que tienen volumen y aspecto parecido al del 
organismo. Para ello se cultivan las células en gotas en la caja de Petri que se apoyan de manera 
invertida para no contactar con la superficie. Se puede observar por ejemplo un cultivo en forma 
de esferoide. 
Además, existen los organoides; cultivos con diversos tipos celulares en 3D parecidos a un 
órgano. 
La asepsia 
Se debe trabajar en cabinas de seguridad biológica con filtros de aire. También se rocía con 
alcohol 70° todo lo que ingrese a la cabina. 
Hay tres tipos de cabinas de acuerdo con el riesgo biológico que se manipule en cada caso. 
Para esterilizar el medio de cultivo y soluciones de trabajo se utilizan filtros con poro de 0,22 μm 
ya que retiene microorganismos. Para esterilizar el material de laboratorio y de cirugía se utiliza 
calor seco en una estufa de esterilización a 180°C o calor húmedo en un autoclave (una olla a 
presión sofisticada). También se hace a través de la radiación gamma. 
Para esterilizar al operador y el ambiente, se utilizan guardapolvo, cofia, barbijo, lavandina 1% y 
alcohol 70%. 
Protocolo de subcultivo 
Esta basado en células MDCK que crecen en el medio DMEM suplementado con: Suero fetal 
bovino, 10% v/v y antibióticos 1% v/v (penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml). 
Pasos a seguir: 
a) Cosecha de las células: 
1) Se observa la confluencia en el microscopio (MOCC) y la forma de las células. Se 
descarta el medio de cultivo en el cual crecieron. Se lava la monocapa con PBS 
(Buffer Fosfato Salino) 1000 μL, para eliminar residuos del medio. 
2) Se descarta el PBS. Se aplican a la monocapa 1000 μL se sc que contiene tripsina 
(degrada las proteínas 
(estructura primaria) de las 
uniones C-C y C-MEC) 0,25% 
p/v y EDTA (quelante de 
calcio, degrada las uniones 
intercelulares) 0,004% p/v. 
Incubar a 37°C por 5 
minutos. Observar al MOCC 
los cambios y continuar la 
incubación hasta que se 
observe desprendimiento de la monocapa (si el tiempo de incubación se excede 
de 20 min, la viabilidad se reduce). 
3) Inactivar la tripsina con 100 μL de SFB, que inactiva la tripsina por su α-1 tripsina. 
Homogeneizar resuspendiendo suavemente con pipeta para disgregar 
conglomerados celulares. 
4) Transferir a un tubo falcon y centrifugar (recordar balancear la balanza) a 1500 
rpm por 10 minutos. 
5) Descartar el sobrenadante y re-suspender el Pellet en 1000 μL de medio de 
cultivo. 
6) Tomar 50 μL de la resuspensión de células para el recuento celular. 
b) Recuento de células y cálculo de viabilidad 
Para que el cultivo parta de la densidad adecuada y favorezca su proliferación. 
Test de exclusión de colorante: utiliza generalmente azul de tripán. Las células vivas no 
se tiñen, ya que sus membranas se mantienen intactas, las células no viables se tiñen 
puesto que sus membranas dejan pasar el colorante. 
El recuento se debe realizar dentro de los 5 minutos de preparada la muestra con 
colorante porque luego las células comienzan a morir. 
1) Se toman los 50 μL de la resuspensión y se le agregan 50 μL de azul de tripán, 
resuspender. (Se forma una solución 1:2). 
2) Colocar una alícuota de esta mezcla en la cámara hemocitométrica de 
Neubauer. Se observa la muestra con un objetivo 10X para ver densidadcelular 
y con uno 40X para ver las características celulares y realizar el recuento. 
3) Contar las células viables (no coloreadas NC) y no viables (coloreadas C) de los 
cuadrantes 1, 2, 3 y 4. Calcular el promedio de las células por cuadrante (X). 
 
 
De las células que toquen los bordes, solo contar de dos bordes (arriba e izquierda) y no las 
que toquen sólo la línea exterior y no la media. 
4) Con la siguiente fórmula, calcular el número de células por ml de suspensión: 
𝑛° 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑣𝑎𝑠
𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑝𝑒𝑛𝑠𝑖ó𝑛
= 𝑋 . 2∗. 1000 
Para la viabilidad: 
5) Contar un mínimo de 100 células entre viables y no viables de los cuadrados 1, 
2, 3 y 4 y calcular el porcentaje que representan las viables con respecto al total. 
% 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠 = 
𝑁𝐶 . 100
𝑁𝐶 + 𝐶
 
 
c) Siembra: Ajuste de la concentración celular 
Para un subcultivo, se debe sembrar una alícuota de suspensión celular conteniendo 200000 
células vivas/ml y completar el volumen del recipiente con medio de cultivo completo. 
d) Congelamiento celular 
Centrifugar a 200 G por 5 minutos y descartar el sobrenadante. Preparar el criomedio (10% 
DMSO y 90% medio de cultivo) y colocar una alícuota de 1 mL en un criovial. Colocarlo en 
Mr Frosty y llevarlo a -80°C en freezer toda la noche. Para almacenar por mucho tiempo, 
colocarlo en un tambor de nitrógeno. 
Un criopreservante es utilizado en criopreservación para lograr un descenso de la 
temperatura eficiente evitando la muerte celular a causa del desbalance de electrolitos o la 
formación de grandes cristales. Ej: DMSO o glicerol.