Guia Enzimas 2022-2

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LABORATORIO FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR 
ENZIMAS 
1. FACTORES QUE REGULAN LA ACTIVIDAD Y VELOCIDAD ENZIMÁTICA 
Temperatura 
La temperatura óptima (más eficiente) de una enzima normalmente está cerca de la 
temperatura normal del organismo del cual proviene. El incremento de actividad que se 
observa cuando la temperatura está por encima de la temperatura óptima, es de corta 
duración pues la enzima se desnaturaliza, lo que termina su actividad. (Purves et al., 2010). 
pH 
El valor de pH al que la actividad de una enzima es máxima se denomina pH óptimo y varía 
considerablemente según la enzima. Los cambios de pH ejercen sobre las enzimas un doble 
efecto: 1) producen una alteración de carácter iónico en los grupos amino (-NH2) y carboxilo 
(-COOH) de los aminoácidos del centro activo, importantes en la catálisis y en la unión del 
sustrato; 2) modifican la estabilidad y estructura terciaria (plegamiento) de las enzimas, lo 
cual afecta su unión al sustrato, y si se alcanzan valores extremos de pH por fuera del rango 
óptimo, la enzima se desnaturaliza (Stryer et al. 2009). 
Concentración de sustrato 
Inicialmente, un incremento en la concentración de sustrato produce un aumento rápido de 
la velocidad de reacción. Sin embargo, altas concentraciones de sustrato no modifican la 
velocidad de reacción, pues en ese punto los centros activos de la enzima se encuentran 
saturados (Stryer et al. 2009). 
Concentración de la enzima 
Una reacción enzimática depende, entre otras cosas, de la concentración de la enzima 
presente. La cantidad de una enzima en una célula puede incrementar debido a un aumento 
en su velocidad de síntesis, una disminución en su velocidad de degradación o por ambas 
cosas. Esto quiere decir que existe una relación lineal entre la velocidad de la reacción y la 
concentración de la enzima (Muller-Sterl, 2009). 
Productos finales 
Los productos finales de la reacción tienen una influencia decisiva sobre la actividad 
enzimática. Si se permite que aumente su concentración sin eliminarlos del medio de 
reacción, producen un decaimiento en la actividad enzimática. Algunos productos finales, 
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cuando son de naturaleza ácida o alcalina, pueden afectar el pH del medio, y por lo tanto, la 
velocidad de la reacción (Routh et al., 1990). 
2. ACTIVIDAD OXIDATIVA DE LA ENZIMA POLIFENOL OXIDASA 
La enzima polifenol oxidasa (PFO) se encuentra ampliamente distribuida en plantas y hongos. 
La PFO contiene dos átomos de cobre en su centro activo, que catalizan dos tipos de 
reacciones usando O2 como agente oxidante: 1) la o-hidroxilación de mono fenoles para 
producir o-difenoles (actividad monofenol monoxigenasa); y 2) la posterior oxidación de o-
difenoles a o-quinonas (Figura 1). En la reacción general, la enzima cataliza la formación de 
quinonas altamente reactivas que reaccionan con grupos amino o sulfhidrilo de proteínas. 
Estas reacciones generan cambios en las características físicas, químicas y nutricionales en 
frutos y vegetales (tubérculos). Las quinonas se oxidan a hidroxiquinonas, estas pueden dar 
lugar a polímeros y/o reaccionar con otras moléculas como proteínas generando pigmentos 
de color rojizo, proceso conocido como “pardeamiento enzimático” (Muñoz et al., 2007). 
 
Figura 1. Oxidación de o-difenoles (Catecol) a o-quinonas (1,2 Benzoquinona) mediada por 
la enzima PFO (Garcia-Vallvé, 2010). 
Observaciones: 
Tenga en cuenta que la solución de papa no puede considerarse como una muestra pura 
de la enzima a estudiar. Es decir, la solución de papa contiene la enzima PFO y muchas 
otras enzimas y sustancias. 
 
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PROCEDIMIENTOS 
¡PRECAUCIONES! 
En este laboratorio se usarán algunos compuestos considerados tóxicos. Es importante 
conocer los riesgos que implica el manejo de estos compuestos, para lo cual se recomienda 
leer cuidadosamente la siguiente información: 
COMPUESTO RIESGOS/PELIGROS PRECAUCIONES 
DESECHO DEL 
COMPUESTO 
 
Catecol 
 
-Provoca quemaduras 
graves. 
-Altamente irritante. 
-Muy peligroso si se 
ingiera o se inhala. 
 
Guantes y gafas de 
seguridad. 
 
 
 
 
 
 
 
Todos los residuos que 
contengan Catecol, 
Fenol o Hidroquinona 
SOLO deben ser 
descartados en el 
contenedor plástico 
que indique el 
profesor. 
Fenol Altamente inflamable e 
irritante. 
 
Muy buena ventilación, 
Guantes y Gafas de 
Seguridad. 
 
Hidroquinona 
Fácilmente inflamable, 
provoca quemaduras 
graves, altamente 
irritante, muy peligroso 
si se ingiere o se inhala. 
 
Guantes y muy buena 
ventilación 
 
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1. PREPARACIÓN DE LAS ENZIMAS 
 
1.1. Preparación enzima PFO (Lo realiza el profesor y monitor antes de la 
clase) 
 
 
1.2. Preparación de controles 
 
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1.3. Efecto de la concentración de sustrato en la enzima PFO 
 
 
 
 
 
 
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1.5. Evaluación de la especificidad de la enzima PFO 
 
 
1.6. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática 
 
 
 
 
 
1. Aliste 3 tubos para el grupo control 
negativo [-] y 3 tubos para el grupo 
experimental. Agregue 3 mL de agua 
más 1 mL de PFO a cada uno de los 6 
tubos de ensayo, no sin antes 
marcarlos. 
 
2. Por parejas, ubique los tubos 
en cada uno de los 
tratamientos de temperatura 
(Hielo, temperatura ambiente, 
a 37°C) por 10 minutos. 
 
 
 
 
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1.7. Efecto del pH sobre la actividad de la enzima 
 
 
 
3. Agregue 1 muestra de papa a los 
grupos experimentales. Agite 
vigorosamente y permita la reacción 
por 5-10 minutos. 
 
1. Prepare 3 tubos de ensayo con 2ml de 
buffer pH4,7 y 10 y agregue a cada una 
muestra de PFO. 
2. Agregue 2ml de 
enzima PFO a cada tubo. 
3. Ubique los tubos en una rejilla 
dentro de la incubadora a 37°C 
durante 5-10 minutos y observe los 
resultados.