manipulacion guia - MARIO EDHER SANCHEZ DIAZ

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Cultivo de tejidos 
 
 Desde su introducción en 1949, los cultivos de tejidos (CT) imprimieron un avance sin 
precedentes en el conocimiento de la biología de los virus animales. Desde el punto de vista 
práctico, los CT solucionaron el problema de la propagación y cuantificación de virus, 
haciendolo independiente de la inoculación de animales. Actualmente, pueden ser cultivadas 
células de animales, plantas e insectos, a escalas domésticas o industriales, permitiendo el 
crecimiento de distintos tipos de virus, ya sea para investigación básica, diagnóstico o 
producción de vacunas. De hecho, las técnicas de CT se han erigido en un campo de 
especialidad de desarrollo independiente, con aplicaciones en diversas areas de la Biología. 
Muchos tipos celulares que no era posible cultivar en el pasado hoy son cultivados 
rutinariamente, permitiendo examinar nuevas relaciones virus-célula. Estos avances se 
debieron en gran parte al desarrollo paralelo de sofisticados medios de cultivo y al 
descubrimiento y purificación de factores de crecimiento específicos de tipo celular. Así 
mismo, se avanzó en la preservación por congelamiento de las células, abaratando el costo de 
su producción y manutención. 
 Se deduce de lo arriba expuesto que todo laboratorio de Virología debe contar con una 
sección de cultivo de tejidos. La coordinación entre esta sección y aquella donde se manipula 
virus debe ser celosamente controlada para evitar la infección accidental de los cultivos lo 
cual estropearía cualquier interpretación de los resultados. 
 Todo laboratorio de CT debe contar minimamente con: 1) fuente de agua de primera 
calidad para la preparación de medios de cultivo y el lavado del material de vidrio. 
Idealmente, se debe contar con un deionizador capaz de producir agua con una conductividad 
no menor a 18 Mcm. 2) fuente de frío para la preservación de stock de células (tanque de N 
líquido) y de suero (freezer de –80C y –20C), 3) estufa de CO2 para el crecimiento celular, 
independiente de aquellas empleadas para propagar virus 4) flujo laminar exclusivo para 
mantenimiento y pasaje de células, 5) autoclave para esterilizar el material de vidrio, 6) sala 
de lavado de material, 7) filtros para la esterilización de medios de cultivo, 8) dispositivos de 
seguridad para el descarte de medios, material descartable, células y tejidos. El buen 
funcionamiento de un laboratorio de Virología depende directamente del manejo de la sección 
dedicada a CT. 
 
Medios de cultivo 
 
 Desarrollados inicialmente de forma empírica, los medios de cultivo (MC) actuales 
tienen una composición definida que permite crecer las células con alta repetibilidad. Se 
dispone actualmente de catálogos comerciales con una vasta lista de medios que difieren en su 
composición de acuerdo al tipo celular empleado. Básicamente, los MC deben proveer de 
todos los nutrientes necesarios para el mantenimiento y crecimiento celular. Aunque la 
diversidad de medios es grande, todos deben incluir: 1) fuente de C para la síntesis 
macromolecular y metabolismo (aminoácidos esenciales, azúcares, etc), vitaminas y trazas 
minerales, 2) un buffer capaz de controlar el pH del medio, 3) un indicador de pH, 
generalmente una sustancia cuyo color cambia de acuerdo al pH, 4) una formulación tal que 
respete la osmolaridad fisiológica de las células, sobretodo a través de la composición iónica, 
5) una fuente de factores de crecimiento (generalmente suero sanguíneo). De todos los 
elementos mencionados, el suero es el menos predecible en cuanto a su composición, por lo 
que muchos laboratorios lo reemplazan por factores de crecimiento y/o diferenciación cuando 
el trabajo requiere la definición completa del medio. 
 
 
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 Los medios definidos generalmente vienen en polvo y se reconstituyen con agua de 
primera calidad. Como varios de sus componentes son inactivados por las altas temperaturas, 
los medios se esterilizan mediante filtración con membranas de 0.2 m de diámetro de poro. 
El suero se mantiene congelado, y se adiciona antes de agregar medio a los CT. Conviene 
asegurarse de la esterilidad del medio sembrando medios para bacterias con el medio filtrado. 
 Una vez que las células toman contacto con el medio de cultivo, lo comienzan a 
modificar. En muchos casos, dicha modificación es favorable para el metabolismo celular. 
Como los nutrientes invariablemente se agotan, el medio debe reemplazarse periodicamente 
con medio fresco. 
 
 Muchos tipos celulares requieren medios especiales. La variación es tal que un medio 
que promueve la división en un tipo celular, puede promover la diferenciación (e incluso la 
apoptosis) en otro. Por todo ello, es recomendable conocer las características de cada tipo 
celular. Cuando se adquieren líneas celulares comerciales (ver abajo) es imperioso seguir las 
instrucciones para su mantenimiento (tipo de medio, forma de pasaje, etc). Si no se respetan 
estas instrucciones, las células comienzan a ser seleccionadas por las condiciones impuestas 
por el operador. Los cambios acumulados luego de un número de pasajes pueden ser lo 
suficientemente significativos como para modificar la línea original, haciendo cierto tipo de 
experimentos irrepetibles. 
 
Suero 
 
Practicamente a todos los medios se les adiciona un porcentaje de suero (entre el 5 y 
10%). Generalmente se emplea suero fetal bovino o suero equino. La calidad del suero es uno 
de los factores más importantes en el éxito de los CT. Los proveedores de sueros deben 
certificar la ausencia de endotoxinas y la sanidad de los animales dadores (para garantizar la 
ausencia de virus). Los distintos lotes de suero pueden variar significativamente en su 
capacidad para sostener el crecimiento celular, por lo cual se aconseja probar distintos lotes 
hasta encontrar el más apto para el sistema celular empleado. 
Algunos laboratorios producen su propio suero cuando disponen de animales sanos. 
En estos casos suelen usarse novillos de un año de edad a los cuales se les extrae sangre 
mensualmente. La sangre se colecta en frascos Mariotte, se espera que coagule y se centrifuga 
a 4C para separar el suero. Este suero es luego tratado con polietilenglicol y filtrado para su 
esterilización. 
 
Recipientes para el crecimiento celular 
 
 La mayoría de las células utilizadas para CT son células adherentes: requieren una 
superficie tal que les permita adherirse con relativa firmeza. La adhesión para estas células es 
un requerimiento para subsistir, aquellas que fallan en adherirse, mueren. El vidrio o el 
plástico especialmente tratado son generalmente aptos para las células adherentes. Los de 
plástico son descartables, solo admiten un uso. Existe una gran variedad de formatos de 
recipientes para crecer células: botellas, rollers, “flasks”, cápsulas de Petri, placas de pocillos 
(o “wells”), portaobjetos con cámara, etc (fig. 1). La elección de cada tipo depende de la 
naturaleza del trabajo: rollers para la producción masiva, flasks para trabajo rutinario, placas 
para cuantificación de la infecciosidad, etc. 
 Algunos tipos celulares no se adhieren bien a las superficies convencionales y 
requieren superficies más elaboradas. Por ejemplo, las neuronas y otras células altamente 
diferenciadas requieren que el recipiente esté cubierto por algún sustrato que aumente la 
 
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adhesividad. El colágeno, la laminina, la polilisina, etc son algunos de los sustratos que 
aumentan la adhesividad. 
 Finalmente, existen células no adhesivas que crecen naturalmente en suspensión, 
como el caso de los linfocitos y ciertas líneas transformadas. 
 
 
 
 
Figura 1: Recipientes utilizados en CT. 
 
Mantenimiento de los CT 
 
 La gran mayoría de los CT se incuban en estufas gaseadas con CO2. El porcentaje de 
CO2 en la atmósfera de la estufa es usualmente del 5%. Con ese porcentaje el pH del medio se 
mantiene dentro de los rangos fisiológicos(~ 7.2). La temperatura se mantiene a 37 C, aunque 
CT derivados de especies cuya temperatura fisiológica es mayor (e.g. aves) requieren mayor 
temperatura. 
 
Tipos de cultivos celulares 
 
 Los cultivos más populares utilizados en Virología son: 1) cultivos primarios, 2) 
cultivos de línea. 
 
 Los cultivos primarios (CP) se obtienen de tejidos de animales sanos. Por ejemplo, el 
herpesvirus bovino 1 se propaga bien en cultivos de células provenientes de riñón fetal 
bovino. Las técnicas para la producción de CP depende del tejido u órgano a partir del cual se 
obtienen las células, pero en general se siguen los siguientes pasos (todo el material empleado 
debe ser estéril!): 1) obtención quirúrgica aséptica del órgano o tejido, 2) desmenuzado con 
tijera en pequeños trozos, 3) incubación de los trocitos con una enzima que digiera el cemento 
intercelular (tripsina, colagenasa, pronasa, etc), 4) inactivación de la enzima por lavado o por 
agregado de inhibidores, 5) disgregación mecánica de los fragmentos tisulares para la 
liberación de las células individuales. Las células son resuspendidas con medio de cultivo con 
suero y contadas en una cámara cuenta-glóbulos. Finalmente se siembra un volumen 
apropiado de la suspensión en el recipiente adecuado, se agrega un volumen de medio, y se 
coloca el recipiente en la estufa gaseada. 
Cuando se siembra un recipiente, las células se adhieren a la superficie del recipiente y 
comienzan a dividirse, con una periodicidad (tiempo generacional) que depende del tipo 
celular. A medida que las células se dividen, más y más superficie es ocupada por células, 
Flasks
medio de
cultivo
monocapa confluyente de células
sustrato plástico
cápsulas de petri
placa multiwell
porta-objeto con
 cámaras
roller
 
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hasta que eventualmente toda la superficie del sustrato está cubierta. En este momento, 
decimos que las células alcanzaron confluencia (fig. 2). Las células confluyentes contactan 
unas con otras. El contacto intercelular funciona como un inhibidor del ciclo celular 
(inhibición por contacto) y, por lo tanto, las células dejan de dividirse. En estas condiciones 
las células pueden mantenerse por días o meses si se reemplaza el medio por uno fresco 
periodicamente. Lo usual es que cuando las células confluyen, el operario realiza un pasaje. 
El pasaje consiste en despegar las células (generalmente con una solución de tripsina), 
resuspenderlas en medio de cultivo y sembrarlas en nuevos recipientes. Dependiendo del tipo 
de células, el contenido celular de un recipiente se pasa a 3 o 4 recipientes donde se volverán 
a repetir los eventos descriptos anteriormente (adhesión, división y confluencia). Cuando se 
trata de CP, el número de pasajes es limitado ya que la frecuencia de división es cada vez 
menor. Eventualmente, todas las células dejan de dividirse y entran en un estado quiescente 
seguido de muerte celular (crisis). El número de pasajes admitidos antes de entrar en crisis 
depende de la especie animal, del periodo de desarrollo del tejido primario (fetal o adulto), y 
del tipo de tejido, pero como referencia digamos que oscila entre 5 a 20. La entrada en 
quiescencia es inevitable en CP ya que está genéticamente determinada, y ninguna 
manipulación del medio podrá evitarla. Por lo tanto, la utilidad de los CP viene limitada por 
este fenómeno. 
A pesar de este inconveniente práctico, los CP tienen sus ventajas para trabajar con 
virus. Las células primarias derivan directamente de los tejidos del animal y por lo tanto no 
han acumulado lesiones genéticas. Para cierto tipo de trabajos (genética de virus), esta 
diferencia es fundamental. Por otro lado, muchos virus (como el herpes mencionado en 
cultivos de riñón) crecen a títulos más altos en CP que en líneas celulares. 
Algunos trabajos en Virología requieren poblaciones homogéneas de células, en lo 
posible con un solo tipo celular. Los CP raramente ofrecen esta característica ya que por 
definición son poblaciones heterogéneas de células. 
 
 Los cultivos de línea derivan de CP. Con una baja frecuencia, unas pocas células del 
CP sufren lesiones genéticas que les otorgan una ventaja de crecimiento sobre el resto de la 
población. Estas células comienzan entonces a predominar en el cultivo. Cuando estas 
lesiones bloquean o eluden los mecanismos naturales que llevan a las células a volverse 
quiescentes, decimos que la célula se ha inmortalizado. La inmortalización es una 
característica de las células de línea que les permite tolerar innumerables pasajes antes de 
sucumbir. Las células inmortales se diferencian de las células transformadas en que las 
primeras aun son sensibles a la inhibición por contacto (fig 2B) mientras que las segundas, 
indiferentes a este control, siguen dividiéndose y creciendo en forma estratificada (fig. 2C). 
Se piensa que la inmortalización es un prerrequisito para la transformación. Las células 
transformadas además guardan otras características: no requieren suero en el medio, dependen 
menos de la adhesión al sustrato y originan tumores cuando se inoculan en animales. 
 Como en el caso de los CP, las líneas celulares tienen ventajas y desventajas. Por un 
lado, al ser células inmortales, permiten pasajes innumerables, sin la necesidad de tener que 
realizar cultivos primarios a partir del animal. Por el otro, la inmortalización implica cambios 
genómicos que afectan el crecimiento celular. Dado que los virus mantienen una relación 
estrecha con las funciones celulares, aquellas modificaciones pueden también repercutir en la 
replicación viral. Mientras que las células primarias mantienen características propias del 
tejido del cual provienen, las células de línea tienden a perderlas. Para muchos virus, las 
características de diferenciación de sus células target son imprescindibles para cumplir su 
ciclo replicativo. 
 
 
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 No todos los virus crecen en CT. Para estos casos, la inoculación de animales de 
laboratorio o del huésped natural es el único recurso para su propagación. 
 
 
 
 
 
 
 
Fig 2. Tipos de cultivo. A: cultivo primario de células fibroblasticas de escroto. B: línea estable ( inmortalizada 
diploide) de fibroblastos de ratón (3T3). C: línea continua (transformada) de celulas epiteliales humanas 
(HELA). 
 
 
 
 
 
 
Aislamiento Primario Viral 
 
Ante una enfermedad de la cual se sospecha una etiología viral, existen varios caminos 
posibles para llegar a un diagnóstico, de los cuales el procedimiento más confiable es el 
aislamiento viral. El mismo se lleva a cabo a partir de muestras obtenidas del individuo o 
animal enfermo. Si son varios los animales infectados, conviene muestrear 
representativamente. Es ideal que la toma de muestras tenga lugar dentro de los dos días de la 
aparición de los síntomas porque la mayoría de los virus son diseminados sólo en los estadíos 
iniciales de la enfermedad. 
¿Qué muestra tomar y cómo? Depende de numerosos factores, pero no deben 
exceptuarse los órganos que presentan lesiones, los humores (sangre, suero, LCR), ni los 
órganos filtro (riñón, pulmón, bazo, linfonódulos). En enfermedades respiratorias se toman 
hisopados nasales o faríngeos; en enfermedades de la piel se obtienen raspajes o líquidos de 
punción, etc. Si se trata de un examen postmortem, se realiza la necropsia y se procede de 
igual manera. Deben observarse todas las normas tendientes a evitar tanto la contaminación 
de la muestra, en la medida que las condiciones lo permitan, así como la infección del 
operador ante eventuales agentes zoonóticos. Los distintos especímenes (tejido, sangre, suero, 
líquidos de punción, hisopados, etc) presentan técnicas de recolección y formas de 
acondicionamiento propias, pero siempre es conveniente remitir las muestras refrigeradas e 
inmersas en medio de transporte. Se recomienda el uso de hielo común, o hielo seco en caso 
de que la muestra demore más de 5 días en arribaral laboratorio. 
 Como los distintos virus varían mucho en su composición, estructura y estabilidad, es 
importante seleccionar el medio de transporte adecuado que garantice la supervivencia tanto 
de las células como de las partículas virales que ellas portan. Afortunadamente el mercado 
ofrece una gran variedad de medios, pero no hay uno universal, por lo cual la elección del 
mismo debe ser cuidadosa. 
El procesamiento estándar para el aislamiento viral, implica que las muestras sean 
 
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tratadas con antibióticos, homogeneizadas vigorosamente, clarificadas (para remover restos 
celulares y bacterias) y luego inoculadas en cultivos celulares o animales apropiados. 
Usualmente se incuba 0.5 ml de suspensión por tubo o flask durante una hora a temperatura 
ambiente, luego se adiciona medio de mantenimiento celular y se incuba durante tiempo 
variable bajo condiciones apropiadas de temperatura, humedad y CO2, realizando subpasajes 
si fuera necesario. El crecimiento viral se observa como efecto citopático (CPE, del inglés 
“cytopathic effect”) en la monocapa (ver más adelante) o bajo otros indicadores (en caso de 
virus que no producen CPE). 
 
Aislamiento de virus en cultivos celulares 
 
Un buen laboratorio de diagnóstico viral debe contar con un amplio stock de distintas 
líneas celulares, ya que las mismas juegan a veces un papel fundamental en la etapa de 
aislamiento. 
 Se mencionan a continuación algunos ejemplos de tipos celulares utilizados en el 
aislamiento de virus pertenecientes a distintas familias: 
Herpesviridae: BHV-1 y PRV crecen fácilmente en células MDBK. 
Adenoviridae: la mayoría de sus serotipos crecen bien en HEK y Hep2. 
Papovaviridae: de esta familia sólo los pertenecientes al género Polyoma pueden ser aislados 
en cultivos celulares, usándose HEK, NCI-H292, o células gliales fetales humanas. 
Poxviridae: vaccinia y otros poxvirus pueden ser aislados en Vero, MK, fibroblastos diploides 
y NCI-H292. 
Reoviridae: Los reovirus 1, 2, y 3 son frecuentemente aislados a partir de muestras de 
garganta y recto, tras 15 días de incubación en MK, HeLa, y NCI-H292. 
Paramyxoviridae: Algunos virus de esta familia pueden desarrollar CPE entre los 4 y 7 días 
de incubación, pero en general los cultivos deben ser pasados a ciegas por una semana más 
para asegurar el crecimiento viral. 
Orthomyxoviridae: Influenza A, B, y C se recuperan fácilmente a partir de cultivos de MK y 
MDCK. 
Picornaviridae: Esta familia incluye los géneros Enterovirus y Rhinovirus, los cuales 
producen CPE en NCI-H292, y otros tipos celulares, pero algunos virus Cocksackie A sólo 
crecen en cerebro de ratón lactante. 
Togaviridae, Flaviviridae, Rhabdoviridae, Bunyaviridae, Filoviridae y Arenaviridae son 
familias difíciles de aislar, por lo cual requieren medios y sistemas especiales. 
 
Muchos virus producen CPE en los cultivos infectados. El CPE puede examinarse 
utilizando un microscopio invertido el cual permite ubicar una placa o botella de cultivo entre 
la platina y el objetivo. El CPE es el resultado de complejas interacciones entre el virus y la 
célula susceptible que resulta en alteraciones de la morfología celular (fig. 3). Los 
citomegalovirus (Flia. Herpesviridae) inducen aumento del volumen celular, mientras que 
otros miembros de la misma familia (HSV-1, BHV-1, PRV) inducen redondeamiento de las 
células. Por lo tanto, virus cercanos entre si pueden producir CPEs diferentes. Un caso 
diferente es el de los reovirus, que promueven una degeneración celular con acumulación de 
granulaciones intracitoplasmáticas, o por citar otro ejemplo, el virus respiratorio sincitial 
bovino que induce fusión entre las células. 
 
 
 
 
 
 
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Figura 3. CPE producido por infección de una monocapa con poliovirus tipo 1. A) antes de la infección, B) las 
células comienzan a redondearse a las 5 hs post infección (pi), C) la mayoría de las células se han redondeado (8 
hs pi), D) a las 24 hs pi las células se han despegado del sustrato y forman acúmulos. 
 
 
 Algunos virus producen CPE en algunas células y no en otras. El tiempo que tarda en 
manifestarse el CPE depende del tipo de virus, la dosis infecciosa y la línea celular empleada 
pero, en general, oscila entre horas y días. Otros virus presentan variantes citopáticas y no 
citopáticas, siendo un ejemplo el virus de la diarrea viral bovina. 
 
Aislamiento de virus en huevos embrionados 
 
En algunos virus (influenza, o aquellos cuyo huésped susceptible son las aves) se 
 
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recurre al huevo embrionado para su aislamiento. Este sistema es un receptáculo ideal para 
crecer virus, por ser estéril y poseer un rango variado de tejidos y cavidades que toleran tanto 
la replicación como la concentración viral. 
Se utilizan huevos fecundados de gallina, que se incuban a 37 C, en una atmósfera de 
62 % de humedad, con ventilación forzada. Algunos sistemas poseen un mecanisno para rotar 
los huevos a intervalos regulares. El huevo embrionado puede ser inoculado en lugares 
específicos y a distintos momentos de desarrollo. Por ejemplo, el virus de Newcastle se 
inocula en el saco alantoideo a los 9-11 días de desarrollo (Fig. 4), mientras que el virus de la 
Bronquitis infecciosa debe inocularse en saco vitelino de huevos de 5-6 días de edad. 
Así como en las monocapas celulares se observa generalmente CPE, en huevos 
embrionados inoculados suele visualizarse la presencia de pústulas (pocks) que se presentan 
como áreas de respuesta inflamatoria. Si se realizan diluciones de una suspensión viral, 
pueden inocularse varios huevos con cada dilución, contar el número de pústulas y luego 
calcular el título viral de la misma manera que en el caso de cultivos celulares. 
 
 
 
 
Figura 4. Crecimiento de virus en huevos embrionados ( de Principles of Virology, Flint, S.J. et al, 2000) 
 
 
 
 
Detección de Virus en cultivos celulares en ausencia de CPE 
 
Una vez infectada la monocapa celular, la presencia de CPE tras un determinado 
período de incubación es indicativo de la presencia de partículas virales infecciosas; pero la 
ausencia de CPE no supone en absoluto lo contrario, ya que muchos virus no producen CPE. 
En estos casos se utilizan otros tests que se enumerarán a continuación. Vale aclarar que estas 
pruebas también se usan para caracterizar virus que producen CPE, ya que la aparición de éste 
no es patognomónica de ningún virus y conviene confirmar mediante otras técnicas. 
Las pruebas de hemoadsorción constituyen un método rápido para la detección de 
orthomyxovrus y algunos paramyxovirus, en casos donde el CPE es mínimo, o en aquellos 
donde es evidente pero se busca discriminar rápidamente de otros virus que producen el 
mismo efecto. 
Las pruebas de interferencia viral son de suma utilidad cuando se intenta caracterizar 
el virus de la rubeola (RNA, Togaviridae), ya que el mismo impide que otros virus infecten 
 
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las células en donde se encuentra. Una vez infectada la monocapa con dicho virus, se adiciona 
una cantidad conocida de algún enterovirus (por ej: virus cocksackie), se reincuba por tres 
días y se observa en los mismos la ausencia de CPE, mientras que en los controles infectados 
solo con enterovirus se observa CPE. 
Los coronavirus productores de enfermedad respiratoria humana no desarrollan CPE 
en sus fases replicativas en fibroblastos diploides. Una vez que completó su fase replicativa y 
alcanzó su pico de crecimiento comienzan a aparecer los cambios en la monocapa, que 
consisten en una degeneración pareja de la monocapa en los días subsiguientes. El efecto 
citopático es concomitante con la autólisis de los viriones recién formados. Al tiempo que el 
CPE es completo, hay muy poco virus infeccioso en el cultivo. 
Hay pruebas standard como la hemaglutinación (HA) y la inhibición de la 
hemaglutinación (HI), la Fijación del Complemento, etc, para ciertosgrupos de virus. Por 
ejemplo, los orthomyxovirus y paramyxovirus (entre otros) contienen glicoproteinas en sus 
membranas capaces de aglutinar los glóbulos rojos. Dicha aglutinación es proporcional a la 
cantidad de virus (fig 5). 
A pesar de que el tipo de CPE puede ser indicativo de un virus particular, siempre es 
conveniente la confirmación por otra técnica más específica. Por ejemplo, los herpesvirus 
bovino 1, 5 (BHV-1, BHV-5) y PRV (virus de la seudorabia) pueden infectar al ganado. Los 
tres virus producen el mismo CPE. En estos casos conviene discriminar por medio de 
inmunofluorescencia (IF) con anticuerpos específicos de virus. En el caso de BHV-1 y BHV-
5, ambos virus son lo suficientemente parecidos como para no ser diferenciados por sueros 
policlonales y se requiere de anticuerpos monoclonales, específicos de epitopes. Para la IF se 
inoculan células crecidas sobre portaobjetos y luego se incuban con anticuerpos anti virus 
marcados con fluoresceína. Luego de un extensivo lavado, las células se observan en el 
microscopio de fluorescencia (técnica directa) (fig 6). Para mayor sensibilidad puede 
emplearse la técnica indirecta en la cual los células inoculadas son incubadas sucesivamente 
con el anticuerpo anti virus (anticuerpo primario) y un anticuerpo secundario dirigido al 
anticuerpo primario, marcado con fluoresceína. La técnica es rápida y sensible pero requiere 
experiencia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Fig 5. Muestras diluidas de diferentes cepas del virus de la influenza se mezclaron con 
glóbulos rojos de pollo y se incubaron 30 minutos a 4C 
 
 
Fig 6. Bases de la deteccion de antigenos virales con anticuerpos marcados. 
B: Celulas infectadas con herpesvirus humano 1 teñidas con un anticuerpo contra una de sus 
proteina estructurales. 
 
 
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Cuantificación de virus 
 
Cualquiera que quiera llevar a cabo un trabajo en Virolgía debe conocer la 
concentración de partículas virales infecciosas de las suspensiones virales que utilizará en sus 
experimentos. Si por ejemplo el experimento al llevar a cabo requiere que una monocapa de 
células sea infectada con una multiplicidad de infección de 10 (esto es, 10 partículas 
infecciosas por célula presente en el cultivo), es menester saber por un lado el número de 
células a infectar, y por otro la concentración o título de la suspensión viral a utilizar. Esta no 
es la única situación donde se requiere titular una suspensión viral. Puede que en una etapa 
posterior del trabajo que iniciamos infectando células pasemos a la inoculación de animales, y 
que distintas dosis de nuestro virus produzcan diferentes efectos, por lo cual estaremos 
obligados a conocer el título del inóculo para producir entonces el efecto deseado. 
Actualmente, los virus animales son cuantificados tanto por medio de ensayos de 
infectividad (TCID50; EID50; LD50), como por otros ensayos químicos/biológicos 
(hemoadsorción, hemoaglutinación, proteína total) o por conteo total de partículas virales 
utilizando el microscopio electrónico. 
La mayor parte de los virólogos consideran al ensayo de infectividad en placa como el 
método de titulación más sencillo, apropiado, y sensitivo a la hora de cuantificar infectividad. 
Sin embargo algunos virus como Influenza presentan poca eficiencia de plaqueo, por lo cual 
son necesarios otros métodos, como la hemoaglutinación. 
En esta sección se delinearán las técnicas básicas de titulación de virus, atendiendo 
con especial detalles aquella/s que se llevarán a cabo en los trabajos prácticos. Para detalles 
específicos sobre virus individuales, el lector deberá dirigirse a la literatura publicada. 
 
Ensayos de Infectividad 
 
Los ensayos de infectividad están diseñados para calcular el título viral, es decir el 
número de unidades infecciosas por volumen, (ej: unidades formadoras de placa por mililitro). 
Hablamos de unidades infecciosas para resaltar el hecho de que cualquier suspensión viral 
consiste en una mezcla de viriones, algunos de los cuales son capaces de infectar mientras que 
otros (por ejemplo, partículas defectuosas o DI) no lo son. A nosotros nos interesan las 
primeras. 
Las unidades infecciosas son consideradas como la menor cantidad de virus que 
produce un efecto biológico detectable en el ensayo. Tal efecto es consecuencia del ciclo 
replicativo que cumple un virus en la célula que infecta, y está dado por cambios bioquímicos 
y morfológicos dentro del huésped que en general culminan con la muerte celular. Como 
mencionaramos anteriormente, estos cambios morfológicos son denominados Efecto 
Citopático (CPE), y, al microscopio óptico pueden adoptar distintas formas: redondeamiento 
celular, fusión (formación de sincicios), o lisis total. Algunos virus no producen CPE ni matan 
a sus células huésped, sino que las transforman en focos de crecimiento tumoral, y de esta 
forma pueden visualizarse en una monocapa infectada. 
Los ensayos de infectividad pueden ser cuantales o focales. Los ensayos cuantales 
detectan la presencia de virus infeccioso desde un enfoque de “todo o nada” planteando las 
siguientes preguntas: ¿presenta CPE la monocapa celular? ¿está infectado el huevo?, ¿ha 
muerto un animal?. En cambio, los ensayos focales se basan en el conteo de focos 
inflamatorios (pock) , o de focos con CPE, lo cual permite una determinación cuantitativa a 
diferencia de los primeros que aportan datos cualitativos. En la práctica, se considera que un 
foco pock o de CPE es originado por una o unas pocas partículas infecciosas, aunque puede 
que ello no sea así en todos los casos. Este grado de incertidumbre se refleja en el uso del 
término “unidad infecciosa” en vez del de “partícula infecciosa”. 
 
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Dilución de virus 
 
La forma de determinar título viral es realizando diluciones seriadas de las 
suspensiones virales, utilizando como diluyente medio de mantenimiento celular. Las mismas 
se hacen 1:10 o 1:2.5 (a menor factor, título más preciso). En general, el factor utilizado es 1 
en 10. 
 
TCID50 
 
Estas siglas provienen del inglés “Tissue Culture Infective Dose 50” (Dosis infectiva 
de cultivos celulares 50), y se define como la dilución viral necesaria para infectar el 50 % de 
una serie determinada de cultivos celulares inoculados. Este test se basa en la presencia y 
detección de partículas virales capaces de producir CPE. Las células huésped son cultivadas 
hasta formar monocapas cuasi-confluentes en placas de cultivo de 96 pocillos, a las que se les 
agrega una dosis de las diluciones virales. Se realizan 10 repeticiones de cada dilución como 
rutina. Una vez inoculadas las células, se incuban en estufa para permitir que el virus replique 
y el CPE tenga lugar. Luego se observan las placas con el microscopio invertido y se cuentan 
el número de pocillos con CPE y el número de pocillos sin CPE. Por lo tanto es un ensayo 
cualitativo ya que sólo nos dice si hay o no CPE. 
Los datos obtenidos se usan para calcular la TCID50 , lo cual puede hacerse tanto por 
el método de Reed y Muench como por el de Spearman y Kärber. El resultado de este cálculo 
no nos dice cuántas unidades infecciosas hay sino qué dilución de nuestra suspensión viral 
original producirá CPE en el 50 % de las células inoculadas. 
 
Ensayo de Placa 
 
El ensayo de placa es un ensayo de infectividad que cuantifica el número de unidades 
infecciosas en una suspensión viral dada. Se denominan placas a focos de infección discretos 
localizados, los cuales se presentan como zonas de lisis celular o efecto citopático dentro de 
una monocapa celular. Cada placa se origina de una única partícula infecciosa, lo cual permite 
un cálculo muy preciso del título viral. 
Existen dos tipos de ensayos de placa: en suspensión y en monocapa, y en esta guía 
sólo se presentará el último. A una monocapa confluente de células se le agrega una pequeño 
volumen de virus diluido, y luego de un breve tiempo de incubación(para que la adsorción 
tenga lugar) se agrega una sobrecapa de medio semisólido. Dicha sobrecapa está compuesta 
por una solución de agar/agarosa o metilcelulosa, que por su solidez relativa evita la 
formación de placas secundarias a distancia y obliga a las partículas virales a invadir sólo 
células vecinas a las primoinfectadas. 
Una vez inoculados los pocillos y adicionada la sobrecapa, se deja incubar hasta que 
las placas o focos con CPE sean discernibles, momento en el cual las células se fijan con una 
solución salina con formol y luego se tiñen con cristal violeta. Las placas se observan a ojo 
desnudo o, mejor, con ayuda de una lupa (fig. 7). 
El título obtenido se expresa como Número de unidades formadoras de placa por ml 
(PFU ml
-1
, PFU= Plaque Forming Units) . 
 
Vale la pena remarcar que antes de realizar un ensayo de placa hay que determinar el 
sistema virus/célula más sensible y apropiado para llevarlo a cabo, y para ello hay que tener 
en cuenta algunos factores como la sensibilidad del tipo celular utilizado a la infección; 
tiempo requerido para la adsorción; tipo de agar utilizado (puede inhibir la replicación viral); 
 
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tiempo de incubación; capacidad del virus de producir CPE en cultivos celulares; etc. 
 
 
 
 
 
Figura 7 
 
A. Figura aumentada de un foco de lisis. A la derecha se observa el mismo foco, expuesto a un substrato 
que modificado se torna azul . El virus lleva un gen que expresa una enzima que actua sobre el 
substrato. 
B.C. .Focos de lisis en un ensayo de titulación. Las pequeñas áreas blancas representan focos de lisis 
mientras que el fondo oscuro corresponde a la monocapa intacta. 
 
Ensayos en huevos embrionados 
 
Se ha desarrollado un método cuantitativo de titulación de virus en embrión de pollo 
(pock assay1), el cual ha caído en desuso debido a las reformas legales que restringen el uso 
del huevo embrionado en los ensayos de laboratorio. Básicamente consiste en la creación de 
un falso saco de aire en el huevo, dentro del cual se inocula el virus diluido. Luego de incubar 
por un lapso de tiempo, se cuentan las áreas de inflamación (“pocks”) resultantes de la 
replicación del virus en las células epiteliales de la membrana corioalantoidea. Cada área o 
pock es producida por una partícula infecciosa, lo cual hace que este método sea cuantitativo. 
 
Hemoaglutinación 
 
La capacidad de algunos virus de producir agregados de eritrocitos de distintas 
especies se conoce como hemoaglutinación, la cual se produce por la interacción entre 
glicoproteínas virales y receptores de membrana de las células sanguíneas. No todos los virus 
hemoaglutinan, y algunos lo hacen sólo frente a eritrocitos de especies determinadas y bajo 
estrictas condiciones de pH y fuerza iónica. 
Para que la reacción ocurra, debe haber una concentración de virus capaz de establecer 
puentes cruzados entre eritrocitos, causando así su aglutinación. Si se colocan los mismos en 
un pocillo de fondo cóncavo, al no haber aglutinación formarán un pellet en el fondo. Al 
producirse la hemoaglutinación se forma una estructura que tapiza las paredes del pocillo, lo 
cual es bien diferente al pellet, de forma tal que ambas reacciones se distinguen a ojo 
desnudo. 
 
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La hemoaglutinación no mide infectividad, ya que no hay replicación viral en este tipo 
de ensayo, sólo indica el número de partículas virales capaces de producir hemoaglutinación, 
por lo que no es un método muy sensible, ya que se necesita una gran cantidad de partículas 
para que se produzca el efecto. 
 
Conteo de partículas 
 
Existe un método de titulación en exceso dificultoso, que se vale del microscopio 
electrónico para contar partículas virales. Muy sucintamente, el método se basa en el uso de 
partículas de referencia de una concentración conocida, las cuales se mezclan con virus, y por 
visualización en el microscopio electrónico se determina la relación virus/partículas, y con 
este número se calcula la cantidad de virus total.