Seleção de Microorganismos Probióticos em Tilápia

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AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS LÁCTICOS
PROBIOTICOS DE CULTIVOS DE TILAPIA ROJA (Oreochromis sp.) PARA
ELABORACIÓN DE INÓCULOS PROTECTORES DE PATÓGENOS EN
ACUICULTURA

ALINA VILLA MORENO

UNIVERSIDAD DEL VALLE
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGIA
SANTIAGO DE CALI
2009

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS LÁCTICOS
PROBIOTICOS DE CULTIVOS DE TILAPIA ROJA (Oreochromis sp.) PARA
ELABORACIÓN DE INÓCULOS PROTECTORES DE PATÓGENOS EN
ACUICULTURA
.

ALINA VILLA MORENO

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al titulo de Biólogo

Director
Germán Bolívar Escobar
Biólogo, Ph.D

UNIVERSIDAD DEL VALLE
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGIA
SANTIAGO DE CALI
2009

III

UNIVERSIDAD DEL VALLE
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA

ALINA VILLA MORENO, 1983

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS LÁCTICOS
PROBIOTICOS DE CULTIVOS DE TILAPIA ROJA (Oreochromis sp.) PARA
ELABORACIÓN DE INÓCULOS PROTECTORES DE PATÓGENOS EN
ACUICULTURA

TEMAS:, Oreochromis sp, probióticos, bactérias ácido lácticas, bactérias patógenas

Nota de Aprobación

El trabajo de grado titulado “Aislamiento y selección de microorganismos lácticos
probioticos de cultivos de tilapia roja (oreochromis sp.) para elaboración de inóculos
protectores de patógenos en acuicultura”, presentado por la estudiante ALINA VILLA
MORENO, para optar al titulo de Biólogo, fue revisado por el jurado y calificado como:

Aprobado

______________________
Germán Bolívar Escobar
Director

______________________
Codirector

______________________
Jurado

Contenido

RESUMEN ....................................................................................................................... 1
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 3
2. MARCO TEORICO ..................................................................................................... 7
2.1 Probióticos en acuicultura .......................................................................................... 7
2.2 Manejo de Probióticos ............................................................................................... 8
2.3 Estudios realizados con probióticos en Tilapia .......................................................... 8
2.3.1 Beneficios del uso de probióticos .................................................................... 9
2.3.2 Definición de Probióticos .............................................................................. 10
2.4 Uso de antibióticos en acuicultura ........................................................................... 11
2.5 Bacterias patógenas causantes de enfermedades en tilapia ...................................... 14
2.5.1 Enfermedades bacterianas ............................................................................. 15
2.5.2 Bacterias Gram positivas que ocasionan problemas crónicos y granulomatosis
................................................................................................................................ 16
3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 18
3.1 Objetivo general: ..................................................................................................... 18
3.2 Objetivos Específicos: .............................................................................................. 18
3.3 HIPOTESIS ............................................................................................................. 18
4. METODOS Y MATERIALES ................................................................................... 19
4.1. Aislamiento y selección de Bacterias lácticas ......................................................... 19
4.1.1. Formación de gas a partir de glucosa y actividad de catalasa ...................... 19
4.1.2. Estudio de tolerancia a Nacl. ........................................................................ 20
4.1.3. Resistencia a pH bajos. ................................................................................. 20
4.1.4 Análisis de perfil de producción de ácidos orgánicos por cromatografía
liquida de alta eficiencia (HPLC) ........................................................................... 20
4.1.5 Detección de los isómeros del ácido láctico. ............................................... 21
4.2 De acuerdo con las características obtenidas, serán seleccionadas las cepas a incluir
para efectuar pruebas bioquímicas. ................................................................................ 23
4.2.1. Pruebas bioquímicas. .................................................................................... 23
4.3. Aislamiento e identificación de microorganismo patógenos de tilapia. .................. 24
4.3.1. Detección de inhibición de BAL frente a patógenos .................................... 25
4.3.2 Ensayos de inhibición entre bacterias lácticas .............................................. 26
4.3.3. Pruebas de competencia de inhibición con antibióticos frente a patógenos y
bacterias lácticas aisladas. ...................................................................................... 26
4.4. Selección de las cepas más eficientes ...................................................................... 27
4.4.1. Conservación de cepas seleccionadas ........................................................... 27
4.5 Selección del medio de cultivo ................................................................................ 28
4.5.1. Diseño experimental ..................................................................................... 28
4.5.2. Elección del sustrato ..................................................................................... 29
4.5.3. Conteo de Microorganismos Viables en Placa (UFC/mL) ........................... 29
4.5.4. Determinación de azúcar total: ..................................................................... 30
4.5.5. Determinación de proteínas .......................................................................... 30
4.5.6. Evaluación de la producción de biomasa ..................................................... 31
5. RESULTADOS Y DISCUSION ................................................................................ 33
5.1 Aislamiento y selección de bacterias acido lácticas. ................................................ 33
5.1.1 Producción de gas y determinación de catalasa: ........................................... 35
5.1.2. Tolerancia de BAL a diferentes concentraciones de NaCl ........................... 38
5.1.3. Viabilidad de BAL en diferentes concentraciones de pH. ............................ 39
5.1.4.Produccion de acidos organicos .................................................................... 40

5.1.5. Detección de isómeros de ácido láctico. ....................................................... 43
5.2 Pruebas bioquimicas ................................................................................................. 44
5.3 Identificación de patógenos aislados. ....................................................................... 45
5.3.1 Acción inhibitoria de bacterias lacticas frente a patogenos. .......................... 46
5.3.2. Inhibición entre bacterias lácticas ................................................................. 49
5.3.3. Acción inhibitoria de antibióticosfrente a patógenos. ................................. 50
5.3.4. Acción inhibitoria de antibióticos frente a BAL .......................................... 51
5.4. Selección de BAL para preparacion del inoculo ..................................................... 53
5.4.1 Conservación de cepas. ................................................................................. 55
5.5 Formulación de los medios de crecimiento para las bacterias lácticas y estudio de
crecimiento. .................................................................................................................... 55
5.5.1 Diseño Experimental. .................................................................................... 55
5.5.2. Elección de sustrato ...................................................................................... 58
5.5.3. Producción de Biomasa ................................................................................ 61
7. LITERATURA CITADA ........................................................................................... 67

VII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Equipo de cromatografía liquida. .................................................................... 21
Figura 2. Pruebas bioquímicas galeria api a 50 chl. ....................................................... 24
Figura 3. Prueba de Inhibición de Bacterias Patógenas vs. Bacterias Lácticas. A.
Siembra del patógeno. B. Discos de Agar Impregnados de BAL. C. Ubicación de los
Discos de Agar Sobre la Bacteria Patógena. .................................................................. 26
Figura 4. Etapas del proceso de extracción de microorganismos lácticos: A. Espécimen
de Tilapia O. niloticus. B. Proceso de desmedulización. C. Extracción del intestino. D
Macerado de intestino. E. Siembra de intestino en Agar MRS azul de anilina. F
Colonias desarrolladas en el medio diferencial .............................................................. 34
Figura 5 A. Cultivo en caldo MRS con glucosa para verificación de producción de gas.
B. Prueba de catalasa. ..................................................................................................... 36
Figura 6. tolerancia a diferentes concentraciones de sal de las bactérias lácticas aisladas
........................................................................................................................................ 39
Figura 7. Cepas de bal aisladas frente a diferentes ph .................................................. 40
Figura 8 .prueba de isomeros .......................................................................................... 43
Figura 9. Galería API A 50 CHL. ................................................................................... 44
Figura 10. Observación morfologica microscopica de las bacterias patógenas, A.
Flavobacterium columnare, B.Flexibacter sp,C. Streptococo agactiae,D. Aeromona
hydrophila. ...................................................................................................................... 46
Figura 11. Antagonismo de BAL aisladas frente a patógenos. ...................................... 48
Figura 12. Halos de inhibición de bactérias lácticas frente a bactérias lácticas. ........... 49
Figura 13. Antagonismo de inhibicion de bal ................................................................ 50
Figura 14. Inhibicion de antibioticos frente a bal. .......................................................... 53
Figura 15. Viabilidad de bal en el tiempo ..................................................................... 54
Figura 16 crecimiento de bal en medio mrs ................................................................... 54
Figura 17 Distribución normal de los residuos obtenidos en el estudio de la
optimización de inóculos para las bal. ............................................................................ 56
Figura 18 Gráficos de contorno para la selección del medio de cultivo óptimo. A.
Interacción entre el contenido de suero de leche bovino y leche de soya. B Interacción
entre el contenido de leche de soya y sacarosa. C. Interacción entre el contenido de
suero de leche bovino y sacarosa. ................................................................................... 58
Figura 19. Curvas de crecimiento en ln, ph, azúcar, y proteína de la bal lactobacillus
plantarum1. .................................................................................................................... 60
Figura 20. Curvas de crecimiento en ln, ph, azúcar, y proteína de la bal weisella
confusa. ........................................................................................................................... 61
Figura 21 crecimiento microbiano de r2 lactobacillus plantarum en el medio optimo y
en mrs ............................................................................................................................. 62
Figura 22. Crecimiento microbiano de lab9 weisella confusa en el medio optimo y en
mrs. ................................................................................................................................. 63

VIII

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Bacterias patógenas probadas ........................................................................... 25
Tabla 2. Antibióticos probados ....................................................................................... 27
Tabla 3 matriz de tratamientos del diseño compuesto central rotable con superficie de
respuesta. ........................................................................................................................ 29
Tabla 4 Producción de gas y actividad de catalasa ......................................................... 35
Tabla 5. Descripción morfológica de las cepas estudiadas ............................................ 36
Tabla 6. Produccion de acidos organicos en g/L de las BAL aisladas de tilapia. .......... 42
Tabla 7 Producción de isómeros de acido láctico de las BAL. ...................................... 43
Tabla 8. Resultado pruebas bioquímicas ........................................................................ 45
Tabla 9. Descripción de las colonias y morfología de los microorganismos patógenos
aislados. .......................................................................................................................... 46
Tabla 10. Halos de inhibición de lácticas frente a patógenos, medidos en cm .............. 47
Tabla 11. Antibióticos comerciales frente a patógenos aislados, expresados en cm. ..... 50
Tabla 12. Prueba de susceptibilidad antimicrobiana de antibióticos contra patógenos de
referencia ........................................................................................................................ 51
Tabla 13. Inhibición de bacterias lácticas vs antibióticos, expresado en cm. ................. 53
Tabla 14. Matriz de tratamientos del diseño compuesto central rotable con superficie de
respuesta. ........................................................................................................................ 55
Tabla 15. Optimización del medio de cultivo para las cepas Lactobacillus plantarum 1 y
Weissella confusa ........................................................................................................... 57
Tabla 16 viabilidad de las cepas l. Plantarum 1, weisella confusa. ............................... 58
Tabla 17. Concentración de azúcar ................................................................................. 59
Tabla 18. Concentración de proteínas (g/L). .................................................................. 59
Tabla 19. Seguimiento del ph en 12 horas de fermentación .......................................... 59
Tabla 20. Comparación de las cineticas obtenidas para el crecimiento microbiano en el
medio óptimo ..................................................................................................................62

RESUMEN

Para lograr una cadena piscícola competitiva es necesario aplicar nuevas
tecnologías viables y sostenibles que contribuyan al aumento de la productividad
y al desarrollo de productos de excelente calidad, que tengan una alta aceptación
debido a su inocuidad, bajo costo de producción y alto valor agregado. Uno de los
grandes problemas que afecta la producción de tilapia roja (Oreochromis sp) es la
presencia de enfermedades de origen microbiano siendo un factor limitante en la
acuicultura, afectando el desarrollo del sector económico de la cadena piscícola.
Este proyecto plantea una alternativa al uso de antibióticos (Vancomicina,
Eritromicina, Aztreonam, Cloramfenicol, Ampicilina, Tetraciclina, Carbenicilina,
Penicilina, Oxitetraciclina, Amoxicilina, Florfenicol) mediante el uso de
microorganismos lácticos probióticos aislados de intestino de tilapia para
aplicación en la piscicultura, con el propósito de controlar las enfermedades
bacterianas más frecuentes. Para ello se aislaron y caracterizaron
microorganismos lácticos de intestino de tilapia, con propiedades probióticas,
capaces de ejercer una acción antagónica y de competencia frente a
microorganismos patógenos (Klebsiella, Salmonella, Proteus, Serratia, Shigella,
E. coli, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, A. hydrophila, Streptococcus, F.
columnaris) causantes de enfermedades esta especie. Las características evaluadas
en las bacterias lácticas (BAL) fueron actividad catalasa, producción de gas,
resistencia a pH bajos, detección de isómeros de acido láctico, inhibición frente a
patógenos, inhibición entre BAL aisladas, inhibición de antibióticos frente a
BAL aisladas, análisis de perfil de ácidos orgánicos por cromatografía liquida
(HPLC) y finalmente pruebas de identificación bioquímica. Se seleccionaron las 2

cepas con mejor desempeño frente a las pruebas antes mencionadas, siendo
identificadas como Weisella confusa y Lactobacillus plantarum, con un
porcentaje de 96 y 91,8 respectivamente. Los resultados mostraron que los
patógenos más resistentes a las BAL fueron Proteus sp, y E. coli, y los más
sensibles fueron K. pneumoniae y S. aureus. Las BAL fueron inhibidas por la
mayoría de los antibióticos mostrando una mayor sensibilidad frente a Florfenicol
y Cloramfenicol y no mostraron sensibilidad frente a Aztreonam y Vancomicina.
Algunos microorganismos de la flora intestinal de la tilapia tuvieron un alto
potencial de inhibición frente a patógenos y resistencia frente a antibióticos en
pruebas in vitro, mostrando la posibilidad de reemplazarlos parcial o totalmente y
ser utilizados como probióticos en alimentos para la piscicultura.

1. INTRODUCCIÓN

La notable disminución de la pesca de captura en el mundo ha conducido a que la
producción acuícola (acuicultura) se constituya en una fuente alternativa de proteína
para la seguridad alimentaría mundial (FAO, 2003) y a su vez como una actividad
generadora de empleo e ingresos.

Respecto al cultivo de peces en el mundo, los estudios señalan que el volumen de oferta
de pescado procedente de “piscifactorías”, que en 1980 apenas representaba el 9% del
total de la oferta de pescado, ahora representa en el 43%, con 45,5 millones de toneladas
y el total de capturas en mar y agua dulce, a nivel mundial, suman 95 millones de
toneladas, de las cuales 60 millones son para consumo humano. Esa tendencia se
acentuará en los años venideros, mientras se espera que para el 2030 la captura de
pescado crezca en 13,7 millones de toneladas, el incremento esperado en piscicultura es
de 54 millones de toneladas.

Dentro de este conjunto, la piscicultura, definida como aquella actividad dedicada al
cultivo de peces bajo manejo e implementación de buenas prácticas, ha crecido de
manera considerable durante las últimas décadas. De hecho, en los últimos 20 años la
producción mundial de especies como la tilapia, trucha y cachama han crecido a ritmos
de 12%, 6% y 29%, respectivamente.

Uno de los grandes problemas que afecta la producción es la presencia de las
enfermedades las cuales han sido sensiblemente incrementadas y actualmente

reconocidas como un factor limitante en la acuicultura, afectando el desarrollo del
sector económico de muchos países (Link, 1995; Subasinghe, 1997; Harper, 2002). Un
buen número de piscicultores considera que la producción de alevinos en Colombia es
deficiente, a causa de los altos niveles de mortalidad y morbilidad que evidencian en sus
explotaciones. (Min. Agricultura 2005).

El procedimiento normalmente utilizado para controlar sus efectos, es disminuyendo la
incidencia por medio del uso de antibióticos, los cuales en muchas ocasiones, son
empleados de modo y con dosis inadecuadas, generando así la aparición de cepas
resistentes y cada ves más patógenas (Valle et al, 2002). El uso de antibióticos en
alimentos animales causa preocupación, debido a la transferencia de la resistencia a
antibióticos de la bacteria asociada al animal para patógenos humanos. Nuevos
patógenos surgirán a lo largo del tiempo y en respuesta al uso de antibióticos, muchos
de estos patógenos se tornarán más virulentos lo que conllevara a un aumento de la
mortalidad en la industria acuícola (Aqualider, 2003). El uso masivo de antimicrobianos
para el control de enfermedades infecciosas y promotores de crecimiento en animales,
ejerce una presión selectiva en los microorganismos, favoreciendo la aparición de
microorganismos resistentes (Kümmerer, 2004).

Estudios efectuados por Sahul Hameed et al, (2003) evidenciaron la resistencia a
antibióticos como Oxitetraciclina, Furazolidona, Eritromicina y Cloramfenicol en 253
cepas aisladas en tanques de acuicultura. Debe considerarse otro aspecto relacionado
con la acuicultura y el uso de antibióticos, siendo este el residuo de antibióticos en el
medio ambiente; muchos de los compuestos usados en la acuicultura no son
metabolizados siendo descargados directamente en el agua sin tratamiento previo,

trayendo consecuencias directas en el medio ambiente (Al-Ahmad et al, 1999;
Kümmerer et al, 2000; Kümmerer, 2004). Una de las alternativas de control
antimicrobiano para estas enfermedades es el uso de bacterias consideradas probióticas
como agentes de control. Gómez-Gil, 2000 y García et al, 2003, Ramírez, 2006, señalan
como estrategia alternativa para el tratamiento de enfermedades el uso de
microorganismos probióticos en sistemas de acuicultura con efectos benéficos para el
hospedero tales como incremento en la taza de crecimiento, resistencia a las
enfermedades e inhibición de crecimiento de microorganismos patógenos. El control de
patógenos con probióticos en peces de cultivo, presenta actualmente un potencial
considerable.

La Cadena Piscícola, consciente de la oportunidad que representan éstos retos
comerciales, ha venido preparándose de manera consecuente firmando un Acuerdo de
Competitividad, incursionando en los métodos de producción limpia y eficiente y
adoptando procedimientos como las Buenas Prácticas de Producción Acuícola, que
permiten la posterior certificación de los procesos de producción y postproducción para
el mercado internacional. Dentro de éstos está el desarrollo de nuevos métodos de
producción y postproducción que se enmarquen en ésta nueva realidad que incluye la
inocuidad en el producto utilizando lo mínimo de drogas autorizadas por la FDA, tanto
en su producción como en su conservación, o aún más, la utilización de métodos
naturales que garanticen el mismo grado de calidad en el producto primario y en el
producto procesado final. En este estudio se pretende aislar, caracterizar e identificar
microorganismos lácticos con características probióticas que compitan con los
antibióticos más comúnmente utilizados en acuicultura einhiban patógenos causantes
de enfermedades en las distintas fases de la acuicultura de tilapia, con el propósito de

obtener en un futuro el control de enfermedades en acuicultura mediante la sustitución
de antibióticos. Esta investigación hace parte de un proyecto aprobado por el Ministerio
de Agricultura “Mejoramiento en la producción, sanidad y comercialización de la tilapia
mediante el uso de probióticos”.

2.1 Probióticos en acuicultura
2. MARCO TEORICO
La acuicultura de peces es uno de los sectores de producción de alimentos que tiene un
crecimiento anual de casi el 10% desde 1984, en comparación con la producción
ganadera (3%) y la pesca extractiva (1,6%). Las enfermedades son un inconveniente
muy significativo en la producción acuícola, afectando al desarrollo económico del
sector en muchos países. Se han desarrollado estrategias para controlar las
enfermedades que afectan a las especies cultivadas, siendo los antibióticos los más
empleados para solventar las situaciones de emergencia. Sin embargo, no debe
constituirse un método rutinario de actuación en las piscifactorías por el riesgo derivado
de un incremento en las epizootias causadas por microorganismos resistentes a los
antimicrobianos. Además, en el futuro se impondrán mayores restricciones al empleo de
antimicrobianos en la medicina veterinaria. Por ello, es imprescindible desarrollar
estrategias alternativas para el control de las enfermedades, proponiéndose como una de
las principales áreas para este control el empleo de probióticos. Los animales acuáticos
son bastante distintos de los animales terrestres para los que se desarrolló el concepto de
probióticos, y una cuestión preliminar es la pertinencia de las aplicaciones de los
probióticos a la acuicultura. Varios autores confirman el uso benéfico de
microorganismo probióticos aplicados a la acuicultura, Rengpipat et al.,
(1999);Villamil et al., (2002), utilizando diferentes microorganismos adicionados por
varios métodos. Robertson et al, 2000, aislaron una cepa probiótica del intestino de
salmón, caracterizada como Carnobarterium sp.. Estudios in Vitro demostraron
antagonismo frente a 12 patógenos; Ramírez 2005 aisló y caracterizó microorganismos
probióticos aislados de intestinos de peces y camarón los cuales fueron suministrados en
la dieta durante dos semanas para luego ser desafiados con Vibrio alginolyticus, uno de

los patógenos causadores de muerte en larvicultura de camarón y peces dando como
resultado una diferencia significativa entre el grupo control y el grupo tratado con
probióticos de (p<0,05), coincidiendo con los resultados obtenidos por autores como
Carriques y Arévalo (1995), reportando una elevación en la sobrevivencia por exclusión
competitiva de los patógenos.
2.2 Manejo de Probióticos
Actualmente se conocen pocos alimentos que contengan microorganismos probióticos
para ser aplicados en todas las fases del cultivo de peces; dado a las dificultades que
representan un entrenamiento al personal de campo encargado de la alimentación para
dar el suministro y la mezcla adecuada de un probiótico por volumen de agua o para
efectuar la mezcla en el alimento. Para ello serán aislados y caracterizados
microorganismos lácticos que cumplan con los requisitos de probióticos aplicables en
un futuro a la piscicultura de la tilapia.
2.3 Estudios realizados con probióticos en Tilapia
Dentro de los estudios en la evaluación de probioticos para tilapia se encuentran
trabajos de Taoka et al., (2006), Evaluó el efecto probiotico de células vivas y muertas
sobre el sistema inmune de Oreocrhomis niloticus, como resultado el tratamiento realzó
parámetros inmunes no específicos como lo son, actividad lisositica, migración de
neutrofilos, y actividad bactericida plasmática. Resultando en el mejoramiento de
resistencia a infecciones por Edwardsiella tarda. Siendo el tratamiento mas efectivo el
suministro de células vivas vía oral; Bucio (2004), Evaluó la viabilidad de Lactobacillus
plantarum 44A, como suplemento alimentario luego de secado y almacenado y su paso
cinético a través del tracto intestinal. Evaluó parámetros de crecimiento como potencial
efecto de la salud, posterior a la ingestión de la cepa en diferentes dosis evaluó la

viabilidad de la cepa con determinación de Lactobacillus y flora anaeróbica total, a
pesar que el peso de la tilapia no vario con las diferentes dosis proporcionadas, sin
embargo demostró un gran potencial para el paso por el tracto intestinal y la presencia
en heces en altos números, con gran potencial como promotor del crecimiento en tilapia.
Haroun et al., (2006), Examino un tratamiento de probiotico comercial Biogen® en la
dieta de alevinos de tilapia Oreochromis niloticus, evaluó el desempeño en crecimiento
de los alevinos (ganancia en peso, tasa de eficiencia proteica, valor de productividad
proteica y retención de energía). El desempeño de la producción y subsecuentes análisis
de costo beneficio, indicaron que dietas conteniendo Biogen registraron la mayor tasa
de retorno y el mas bajo costo comparado con la dieta control.
Lara y Olvera (2003), evaluaron tres tipos de probiotico, dos bacterias, Streptococcus
faecium y Lactobacillus acidophilus y una levadura Saccharomyces cervisae sobre el
crecimiento de alevinos de tilapia nilotica, los resultaros indicaron que alevinos
alimentados con suplemento con probiotico presentaron mayor crecimiento que aquellos
alimentados con la dieta control. De los tratamientos con probiotico, el suplementado
con S. cervisae produce el mejor crecimiento y la mejor eficiencia alimenticia.
Otros reportes del uso de probiotico en tilapia, son Suyanandana (1998) En: Irianto y
Astin (2002), utilizo Lactobacillus sp., proveninte de intestino de tilapia utilizado en
premezcla en concentrado para la alimentación de Oreochromis niloticus.
2.3.1 Beneficios del uso de probióticos

La aplicación de esta tecnología en la dieta alimenticia de la tilapia estaría favoreciendo
la sobrevivencia de alevinos y por lo tanto el suministro de semilla sana para haciendas
de engorde considerando lo reportado en la literatura por varios autores. Finalmente se
estaría obteniendo un producto inocuo libre de compuestos químicos residuales, además
que la aplicación de probióticos en los sistemas de cultivo estaría favoreciendo al medio

ambiente de residuos químicos acumulados, factores estos indispensables en el
gerenciamiento de una producción limpia, a menores costos, con mayor productividad y
por lo tanto mayores demandas en los mercados nacionales e internacionales. La
productividad y la demanda generan por lo tanto mayor número de empleos y
beneficiarios. Atendiendo estas consideraciones, la implementación de la tecnología
propuesta, estaría generando como consecuencia empleos en las zonas rurales
relacionadas con la actividad.
2.3.2 Definición de Probióticos

El término probiótico fue usado por primera vez en el año 1965 por Lilly and Stillwell,
para describir a aquellas sustancias secretadas por un microorganismo que estimulan el
crecimiento de otras, en contraposición al término antibiótico. La palabra fue aplicada
posteriormente para referirse a extractos de tejidos que estimulaban el crecimiento
bacteriano (Sperti,1971) sin embargo, Parker fue el primero en usar el término
probiótico de acuerdo con el sentido que hoy conocemos, es decir organismos o
sustancias que contribuyen al balance microbiano intestinal.

En 1989 Fuller intenta mejorar la definición hecha por Parker, y define probiótico como
un suplemento de organismos vivos los cuales benefician al huésped animal mejorando
su balance microbiano intestinal. Esta definición enfatiza el requerimiento de viabilidad
para los probióticos e introduce el aspecto de beneficio para el huéspedanimal. En 1992
Havenaar y cols. aclaran el término probiótico respecto al huésped y al hábitat de la
microflora, mencionándolo como un cultivo mono o mixto viable de microorganismos
los cuales aplicados a un animal o al hombre afectan beneficiosamente al huésped por
mejoramiento de las propiedades de la microflora endógena.

Los autores Salminen y Schaasfma añaden que el efecto sobre la microflora corresponde
a los efectos saludables. De acuerdo con Salminen probiótico es un cultivo microbiano
o producto de cultivo lácteo que tiene efectos beneficiosos sobre la salud y nutrición del
huésped. Mientras que Shaasfma define a los probióticos orales como organismos vivos
los cuales ingeridos sobre cierto número ejercen un efecto saludable más allá de lo
inherente a la nutrición básica. Los autores cuestionan la definición de Salminen en lo
referente al apoyo en la nutrición del huésped, y en lo referido a cultivo lácteo.

Considerando las definiciones anteriormente descritas, proponen la definición hecha por
Havenaar y Huis In't Veld como la más acertada para el término probiótico que dice :
Que probiótico corresponde a una preparación de o un producto que contiene
microorganismos viables en suficiente número, los cuales alteran la microflora ( por
implantación o colonización ) en un compartimiento del huésped provocando efectos
beneficiosos sobre la salud del mismo. Esta definición hace hincapié en la presencia de
microorganismos viables, en número suficiente para provocar los efectos beneficiosos
sobre la salud, a través de una alteración positiva de la microflora por colonización del
intestino.
2.4 Uso de antibióticos en acuicultura

Debe ser considerado el uso de antibióticos en la acuicultura y sus residuos en los peces
y en el medio ambiente. La mayor preocupación con el uso de agentes antibacterianos
en la acuicultura y la posibilidad que los residuos puedan estimular la resistencia
bacteriana. Las primeras investigaciones de residualidad concluyen que la mayor parte
de estos medicamentos está ligada a diferentes partículas y al sedimento en tanques y

viveros (Montoya et al., 2003; Al-Ahmad et al.,1999; Kümmerer et al.,2000; Fortt et
al,2007)
Muchos de los compuestos utilizados en la acuicultura no son metabolizados y son
descargados directamente en el agua sin previo tratamiento, teniendo consecuencias
directas en el medio ambiente; existe un buen número de antibióticos indicados como
no biodegradables en el medio acuático (Kümmerer, 2004). El uso de probióticos como
substituto de antibióticos estaría evitando estas consecuencias.
Se pretende en este estudio elevar la sobrevivencia en el cultivo en las fases iníciales de
producción de alevinos y mejorar la fase de engorde consiguiendo animales sanos con
mejores tallas, mediante el uso de probióticos aplicados en la dieta o ración, como
inhibidores de enfermedades y como promotores de crecimiento.

El desarrollo de la acuicultura en Chile ha estado caracterizado por un importante
aplicación de antibióticos (Bravo et al., 2005). Un ejemplo de ello es el uso de
flumequina, una fluoroquinolona usada exclusivamente en la acuicultura, la que
aumentó de 30 a cerca de 100 toneladas entre los años 1998 y 2002 (Bravo et al., 2005 y
Cabello, 2003). Este aumento coincide con un crecimiento en la producción de salmón
que en el mismo período pasó de 258 mil a 494 mil toneladas (Bravo et al., 2005),
llegando a situar a Chile como el segundo productor mundial de salmón cultivado,
después de Noruega (Soto et al., 2004). Antonia Fortt et al., 2007, se refieren a los
problemas sanitarios del cultivo de salmón en Chile, principalmente con el uso intensivo
de un amplio espectro de antibióticos en la producción de peces. Esta práctica no sólo
impacta en los peces cultivados, sino que también afecta a especies silvestres que
habitan alrededor de las jaulas y a la población humana que, indirectamente a través de
los peces, consume estas sustancias. Los resultados sugieren que el uso de antibióticos

en la salmonicultura, como ha sido demostrado en otros países, tiene efectos
ambientales que se proyectan más allá de los recintos de acuicultura. Debido a los
riesgos que conlleva el uso intensivo de antibióticos es necesario que se determine,
mediante estudios más amplios y detallados, la relevancia de los hallazgos que
presentamos, tanto para la salud humana y la animal como para el medioambiente. En
este contexto, la existencia de enfermedades bacterianas con implicaciones económicas
para la industria acuícola ha demandado el uso de antibióticos en la prevención y
tratamiento de estas enfermedades (Bravo et al., 2005, Cabello et al., 2004 y Cabello,
2003). Como ha sido demostrado en otros países, este uso excesivo de antibióticos en
acuicultura tiene implicaciones negativas para la salud humana y animal (Cabello, 2004,
Bjorlundm 1990, Wolf, 2004 y Grave et al., 1999) y para el medio ambiente (Cabello,
2006, Buschmann et al., 2006, Hektoen et al.,1995 y Samuelsen et al., 1992). El uso
excesivo de antibióticos tiene también el potencial de dañar la salud económica de la
industria por el aumento de la resistencia en bacterias patógenas para peces, por la
aparición de nuevos patógenos para peces en cultivo y por la pérdida de prestigio
producida por la presencia de antibióticos residuales en la carne de exportación de peces
cultivados (Ecoceanos, 2006). Teniendo en cuenta estas consideraciones, se plantea la
sustitución de antibióticos por el uso de microorganismos lácticos probióticos aislados
de los propios peces, de modo que no se ocasionen alteraciones ambientales y se
consiga un beneficio en la productividad, generando por lo tanto fuentes de empleo. En
Colombia, la piscicultura se constituye en una fuente alternativa de empleo rural. Según
cifras del Ministerio de Agricultura, esta actividad pecuaria alcanzó, para el año 2003, la
cantidad de 1.820.342 jornales, equivalentes a 103.436 empleos.

2.5 Bacterias patógenas causantes de enfermedades en tilapia

El nivel de contaminación por bacterias en el pescado dependerá del medio ambiente y
de la calidad del agua en la cual los peces son cultivados. Entre los factores más
importantes que afectan el contenido de bacterias patógenas en los peces, están la
temperatura y salinidad del agua, la proximidad de la granja acuícola con áreas de
asentamientos humanos, la cantidad y calidad del alimento consumido por los peces y
los métodos de cosecha y procesamiento.

Los peligros asociados con bacterias patógenas en los peces producidos por acuacultura
se pueden dividir en dos grupos: las bacterias que se encuentran de forma natural en el
medio ambiente y las bacterias que se presentan como el resultado de la contaminación
derivada por heces humanas o animales o por introducción al medio acuático (Who,
1999). Ejemplos de bacterias que pueden representar un peligro a la salud humana y que
pueden presentarse en peces cultivados son Aeromonas hydrophila, Plesiomonas
shigelloides, Vibrio parahaemolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, Clostridium botulinium,
Listeria monocytogenes, Streptococcus initiae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira
interrogans, Yersinia enterocolitica, Pseudomonas ssp., Mycobacterium
ssp., las cuales son bacterias que se encuentran normalmente en el medio acuatico
(Who, 1999; Huss et al., 2004). Existen otras bacterias patógenas que pueden
introducirse a las instalaciones acuicolas por medio de agua contaminada por desechos
domesticos o de animales, estas son Salmonella spp., Shigella spp. y Escherichia coli.
Tomado de Garcia y Martinez 2008.

2.5.1 Enfermedades bacterianas

Las tilapias afectadas por este síndrome muestran signos de oscurecimiento, exoftalmia,
anorexia, y con áreas hemorrágicaso ulceradas en las bases de las aletas pectorales y
ventrales, y en la región ocular. A nivel interno, es frecuente observar palidez hepática y
la presencia de focos hemorrágicos. Se detecta necrosis del hígado, corazón, bazo y
musculatura esquelética, así como necrosis en el tejido hematopoyético renal. La SHB
puede manifestarse y producir pérdidas del 5 - 100% en tilapias cultivadas en aguas
dulces y salobres.

Se han aislado en varios de los países latinoamericanos en los cuales se cultivan tilapias
y sus híbridos Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas spp., Vibrio spp. y otras especies de aeromonádidos móviles. Es
importante hacer constar que aislados de Vibrio spp. han sido obtenidos a partir del
contenido intestinal de “tilapias aparentemente sanas” en ambientes dulceacuícolas, por
lo que esos peces podrían constituir portadores asintomáticos de la infección. Estas
bacterias son componentes normales de la flora bacteriana de tilapias, así como de su
ambiente acuático, motivo por el cual son considerados patógenos facultativos u
oportunistas, que producen la enfermedad cuando los peces son sometidos a
condiciones de estrés.(Conroy 2008)
2.5.1.1 Aeromona hydrophila

La A. hydrophila es un cocobacilo Gram-negativo, motil, anaerobio facultativo,
habitante normal del agua y del tracto gastrointestinal de animales acuáticos y terrestres.
Sin embargo, bajo condiciones ambientales no completamente conocidas, puede
Iniciar procesos patológicos en peces y mamíferos. Se aísla frecuentemente de peces
enfermos y causa mortalidad con grandes pérdidas económicas (CTSA, 1996; Lilley

et al., 1998). En el humano se reportan infecciones con A. hydrophila que inducen
gastroenteritis, meningitis, endocarditis, etc., principalmente en neonatos (Pazzaglia et
al.,1990; Thomas et al., 1990; Begue et al., 1994; García et al., 1999; Falcon et al.,
2001).
En peces se describen tres formas de la enfermedad: la septicémica; la cutánea, con
lesiones limitadas a piel y músculo; y una forma latente, que es una forma sistémica sin
presencia de signos clínicos (Grizzle y Kiryu, 1993). Tomado de (Conroy 2008)

2.5.2 Bacterias Gram positivas que ocasionan problemas crónicos y granulomatosis

2.5.2.1 Estreptococosis

En tilapias, la estreptococosis suele producir una enfermedad crónica caracterizada por
la presencia de granulomas interesando al bazo, cerebro, hígado y riñón, exudado
purulento en tejido muscular con encapsulamiento melanizado cerca de la línea lateral.
Las tilapias afectadas pueden mostrar movimientos natatorios desorientados y erráticos,
dado que se produce una meningoencefalitis, exoftalmia uni o bilateral con o sin
opacidad de la córnea, hemorragia periocular. Las tilapias enfermas muestran en general
signos clínicos semejantes a la SHB.
La estreptocococis ha sido confirmada en poblaciones de tilapias y sus híbridos en
países de América Central, América del Sur y el Caribe, con mortalidades de hasta un
50%, la misma que en ciertos casos acusa un curso crónico sin evidencia externa de
signos clínicos. Hasta los momentos en Latinoamérica solo se ha registrado en tilapias
cultivadas en agua dulce.

Al parecer Oreochromis niloticus es más resistente a la esptreptococosis que
Oreochromis aureus, así como la manifestación de los signos clínicos son algo
diferentes.
2.5.2.2 Columnaris

Es causada por una mixobacteria, Flexibacter columnaris (sinónimos : Chondrococcus
columnaris, Cytophaga columnaris, Flavobacterium columnare) en aguas dulces, o
Flexibacter maritimus en aguas saladas ( a partir de 28 %o), las cuales tienen una
amplia distribución mundial en aguas continentales tropicales, sub-tropicales y
templadas con un rango de temperatura que va desde 12.6ºC hasta 30ºC. F. columnaris
es uno de los patógenos más comunes en operaciones de tilapiacultura. Epizootias de la
columnaris en esas especies ícticas generalmente aparecen como una de las secuelas del
estrés en los peces inducido por fluctuaciones en la temperaturas acuáticas y elevadas
concentraciones de amoniaco.
La enfermedad se caracteriza clínicamente por la presencia de áreas de erosión o
lesiones necróticas poco profundas, de color blanquecino-grisáceo a blanquecino-
amarillento, localizadas a nivel de las aletas cabeza y/o cuerpo. Las branquias también
son afectadas y muestran signos de palidez y necrosis Epizootias de la columnaris son
especialmente importantes cuando la temperatura del agua es de 21ºC o más, dando
lugar a elevadas pérdidas en los peces afectados.
Los alevines en proceso de reversión sexual son los más afectados por esta enfermedad.
Las medidas de prevención y control de la columnaris incluyen mantenimiento de la
calidad del agua, densidad poblacional indicada para la especie bajo cultivo y la correcta
alimentación de los peces. Citado por Conroy 2008.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general:

Aislar organismos lácticos probióticos a partir del intestino de tilapia para el control e
inhibición de microorganismos patógenos y su aplicación en el cultivo.(producción
limpia).

3.2 Objetivos Específicos:

1. Obtener microorganismos lácticos con características probióticas presentes en
el intestino de tilapia.
2. Aislar e identificar los microorganismos patógenos frecuentes en el cultivo de
tilapia.
3. Comparar la inhibición de bacterias lácticas y antibióticos frente a
microorganismos patógenos presentes en la tilapia.
4. Seleccionar el medio más apropiado para el crecimiento de los microorganismos
lácticos.
5. Determinar la viabilidad mediante cinética de los microorganismos con la
formulación del inóculo o medio seleccionado.

3.3 HIPOTESIS

Se espera que las bacterias lácticas presentan características probióticas y poder de
inhibición frente a microorganismos patógenos.

4. METODOS Y MATERIALES

4.1. Aislamiento y selección de Bacterias lácticas

Se recolectaron al azar 100 tilapias adultas (>200 g) provenientes de fincas ubicadas en
el municipio de Castilla, Restrepo, Acacías y Guamal a las cuales se les realizó un
proceso de desmedulizacion para posteriormente retirar el intestino, estos fueron
macerados con agua peptonada, efectuando diluciones para siembra en medio agar MRS
(De Man & Rogosa, 1960) con azul de anilina para facilitar la diferenciación de cepas
no lácticas; posteriormente se procedió a incubar a 30 ºC en condiciones aeróbicas
durante 48 horas y pasado este tiempo se sembró nuevamente por el método de estrías
para facilitar su purificación.
Una vez verificadas las características de crecimiento y morfología, las cepas aisladas
serán sometidas a las siguientes pruebas con el fin de determinar si poseen o no las
características probióticas buscadas mediante las siguientes determinaciones:
4.1.1. Formación de gas a partir de glucosa y actividad de catalasa

Se sembraron las bacterias lácticas en caldo MRS con de 5% de glucosa y se
adicionaron tubos Durham para verificar la presencia de gas, siguiendo lo indicado por
(Carr et al, 2002). Serán escogidas las BAL que no produzcan gas.
La actividad de catalasa se determinó mediante la verificación de acumulación de
peróxido de hidrógeno, indicando actividad negativa frente a la presencia de oxígeno
(Requena, 1995; Daeschel, 1989; Brink, 1991).Esto se evidencia con ausencia de
espuma en el caso de ser catalasa negativa y con presencia de esta cuando son catalasa
positiva, debido a la liberación de oxigeno mediante la reacción:

2H₂O₂ 2H₂O + O₂.
4.1.2. Estudio de tolerancia a Nacl.

Las cepas de bacterias lácticas se sembraron en caldo MRS con concentraciones de sal
de 2, 5, 10% de sal, se incubaron durante 24 horas a 35ºC; la tolerancia se verificó
mediante el estudio de viabilidaddespués de 24 y 48 horas. Yimin et al (1999).
4.1.3. Resistencia a pH bajos.

Las BAL se sembraron en caldo MRS con diferentes niveles de pH (2.5, 3.5, 4.0 y 6.0)
durante 24 horas a 35 ºC , la resistencia se verificó mediante el estudio de viabilidad
medido en UFC/mL después de 24 y 48 horas. Se seleccionaron las cepas que
alcanzaron mayor viabilidad en pH más bajo. Siguiendo lo recomendado por Yimin et
al (1999).
4.1.4 Análisis de perfil de producción de ácidos orgánicos por cromatografía
liquida de alta eficiencia (HPLC)

Perfil de características de la producción de ácidos orgánicos. Cada una de las cepas
será sembrada en caldo MRS por 24 horas a 30ºC, luego será centrifugado y filtrado el
sobrenadante en filtro de 0.45µ para inyección en el cromatógrafo. El perfil de
características de producción de ácidos orgánicos se determinará por cromatografía
liquida HPLC, utilizando la columna de separación para ácidos orgánicos y azúcares
BIORAD aminex HPX 87H . Las condiciones serán: Solvente o fase móvil: ácido
sulfúrico a pH 1.5 :presión 800-900 PSI; volumen inyectado: 20µl; temperatura del
horno 65ºC. De este modo se efectuara una primera selección permitiendo comparar los
Catalasa

perfiles idénticos teniendo en cuenta que los picos varían de un perfil para otro,
caracterizando las cepas como hetero u homofermentativas.

Figura 1. Equipo de cromatografía liquida.
Fuente: Autora
4.1.5 Detección de los isómeros del ácido láctico.

Para las cepas seleccionadas, serán determinados los isómeros del ácido láctico
siguiendo la metodología recomendada por Jehanno et al., (1992). El método consiste
en una reacción de oxido-reducción enzimática catalizada por la enzima lactato-
deshidrogenasa, que oxida el lactato en piruvato reduciendo simultáneamente el isómero
L(+) a D(-) a una forma NAD (NADH) produciendo una reacción de acople reduciendo
la sal de tetrazolium en presencia de diaforasa. La sal de tetrazolium se reduce
formando un compuesto insoluble rojizo.
Con éste método utilizando el D(-), es posible diferenciar las cepas productoras de ácido
láctico D(-) de las que producen los dos tipos de ácido láctico (DL), por la aparición de
un halo rojizo más intenso. Las cepas productora exclusivamente del isómero L(+) se
distinguen por la ausencia de color.

Las bacterias lácticas son caracterizadas por la producción de diferentes isómeros del
ácido láctico mediante la fermentación de la glucosa. Durante la fermentación pueden
producir ácido láctico L(+) dextrorrotatorio o L(-) levorrotatório o la mezcla de ambos
DL (Carr et al., 2001). Considerando la evaluación de la FAO (1966) sobre los isómeros
del ácido láctico para uso o consumo humano o animal, rechazando el uso del ácido
láctico D(-) por sus efectos secundarios, se seleccionarán las cepas productoras de ácido
láctico con isómero L (+) o DL.

En la primera etapa, sobre cajas petri se adicionan 5 mL de agar MRS adicionado con
100 g/L de celulosa en polvo. En este medio se inoculan las bacterias ácido lácticas y se
incuban durante 48 horas a 35ºC. Posteriormente, a cada placa se adicionan 20 mL de
las soluciones R1 y R2, preparadas en solución tampón fosfato 0.1 M a pH 7.5, los
cuales corresponden a 17 mL de solución R1 y 3 mL de solución R2.

La composición de las soluciones R1 y R2 es la siguiente:
Solución R1:
Agar: 12 g/L
Tween 20: 1 g/L
Solución R2:
NAD: 2.87 mg/mL
INT: 2 mg/mL
Diaforasa: 0.72 U/mL
Lactato-deshidrogenasa D(-): 28.53 U/mL
Después de 20 minutos de incubación, aparece un halo rojo intenso alrededor de las
colonias productoras de ácido láctico D(-) y menos intenso alrededor de las colonias

productoras de ácido láctico DL. Las cepas productoras de ácido láctico L(+) no
muestran coloración.
4.2 De acuerdo con las características obtenidas, serán seleccionadas las cepas
a incluir para efectuar pruebas bioquímicas.
4.2.1. Pruebas bioquímicas.

L a identificación inicial de selección de cepas se efectuó mediante la fermentación de
carbohidratos con el uso de galerías API 50 CHL para identificación bioquímica de
bacterias ácido lácticas (BioMérieux), (De Roissart e Luquet, 1994).
La galería API 50 CHL permite el estudio de fermentación de 49 azucares. Los
microorganismos a ser estudiados se siembran en caldo MRS y se incuban durante 24 h
a 35 °C, pasado este tiempo se siembra en agar MRS sin azul de anilina, y se incuba
durante 24 h a 35 °C, después se inocula la bacteria en agua destilada estéril, y se mide
su nivel de absorbancia comparado con el tubo de Mc Farland 2 que se encuentra en un
rango de 450 a 500 nm. Luego se agregan 200 µl, en el tubo de azul de bromotimol y
se inocula cada tubo de la galería con 100 µl. Durante la incubación el catabolismo de
glúcidos conduce la formación de ácidos orgánicos que permiten el viraje del indicador
de pH. Los resultados obtenidos constituyen el perfil bioquímico de la cepa, facilitando
su identificación. Las lecturas son realizadas a las 24 y 48 h después de inocular la
galería API A 50 CHL.

Figura 2. Pruebas bioquímicas galeria api a 50 chl.
Fuente: autora

4.3. Aislamiento e identificación de microorganismo patógenos de tilapia.
Se muestrearon 5 fincas productoras y recolectaron animales con algún signo clínico de
enfermedad como: septicemia, exoftalmia, erosiones o lesiones necróticas poco
profundas de color blanquecino, localizadas a nivel de las aletas, cabeza y/o cuerpo y
algunas con branquias afectadas, con signos de palidez y necrosis entre otros. Fueron
recolectados un número de 10 animales por finca. Los peces se transportaron vivos a las
instalaciones del laboratorio en bolsas de polietileno con atmósfera saturada de oxígeno
y allí se tomaron muestras para aislamiento e identificación de los microorganismos,
tomando muestras de las zonas afectadas y sembrando en los medios selectivos
diferenciales para patógenos (cetrimide, EMB, Salmonella, Shiguella, XLD, agar
sangre, medio citophaga, Agar Triptona soya TSA y caldo triptona soya TSB etc)

Teniendo en cuenta el mapa epidemiologico de las lesiones y enfermedades de los peces
en Colombia (Iregui, 1994) se realizaron aislamientos selectivos para infecciones
bacterianas de Streptococcus agalactiae, Aeromonas hydrophila, Flavobacterium
columnaris, Flexibacter sp.

La identificación final de las cepas seleccionadas se efectuará mediante el estudio de
fermentación de carbohidratos con la utilización de las galerías la realización de pruebas

bioquímicas utilizando el Kit comercial BBL CRYSTAL E/NF Y GP de Becton
Dickinson para microorganismos entéricos y gram-positivos y comparados con cepas de
referencia para confirmación.

Las cepas aisladas serán preservadas en tubos de criopreservación con Caldo triptona
soya (TSI) y 25% de glicerol a -20ºC para su uso posterior.
4.3.1. Detección de inhibición de BAL frente a patógenos

Las cepas aisladas fueron enfrentadas a trece patógenos (Tabla 1), seleccionados con el
objeto de comparar el poder de inhibición de las bacterias lácticas frente a los patógenos
y de estudiar el uso potencial de las bacterias lácticas.
Tabla 1. Bacterias patógenas probadas
Bacterias Patógenas Referencia Aisladas
Salmonella tiphymurium
Pseudomona aeruginosa
Staphylococcus aureus
Serratia mersecens
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Proteus vulgaricus
Shigella sp.
Aeromona hidrophila
Streptococcus agalactiaea
Flavobacterium columnaris
Flexibacter sp.ATTCC 14028
ATCC 29336
ATCC 29737
ATCC 13280
ATCC 11229

X
X
X
X

Las bacterias lácticas se sembraron en caldo MRS durante 24 horas a 35° C pasado este
tiempo fueron sembradas en agar MRS con azul de anilina y se incubaron bajo las
mismas condiciones. Los patógenos seleccionados se sembraron en caldo triptona soya
y se incubaron durante 24 horas a 35 ° C. Posteriormente se realizaron antibiogramas
según el procedimiento sugerido por Ramírez et al 2006 que consiste en enfrentar las
bacterias lácticas a los patógenos. Se realiza la siembra de los patógenos por medio de
hisopo en agar Mueller- Hilton, y luego se colocan los discos de agar impregnados de

BAL aisladas. El efecto de inhibición se determinó por el halo producido alrededor del
disco de agar impregnado de BAL después de 24 horas de crecimiento en el medio
donde se desarrolla la bacteria patógena. Ramírez (2005) y Estrada et al, (2005)
reportan que un halo mayor a 2 mm es aceptable para que un producto sea considerado
inhibidor de microorganismos patógenos. Se seleccionaron las bacterias lácticas que
presentaron inhibición del mayor número de microorganismos patógenos. La figura 3
Describe el procedimiento seguido para realizar esta prueba.

Figura 3. Prueba de Inhibición de Bacterias Patógenas vs. Bacterias Lácticas. A. Siembra del patógeno. B. Discos de Agar
Impregnados de BAL. C. Ubicación de los Discos de Agar Sobre la Bacteria Patógena.
Fuente: La autora

4.3.2 Ensayos de inhibición entre bacterias lácticas

Con el fin de evaluar la posibilidad de usar combinaciones de BAL para conseguir una
mejor cobertura de inhibición frente a microorganismos patógenos, se realizaron
ensayos de inhibición entre las cepas seleccionadas, siguiendo la misma metodología
empleada para inhibición de patógenos en el numeral anterior.
4.3.3. Pruebas de competencia de inhibición con antibióticos frente a patógenos y
bacterias lácticas aisladas.

Igualmente, con las bacterias lácticas y el patógeno sembrados en caldo MRS y caldo
triptona soya respectivamente, con 24 horas de crecimiento, se procedió a realizar
antibiogramas con sensidiscos de los antibióticos escogidos (Tabla 2) frente a las

patógenas y frente a las bacterias lácticas seleccionadas (Ramírez, 2006) . El poder
inhibitorio se determinó midiendo el radio de los halos producidos.

Tabla 2. Antibióticos probados
Antibióticos probados
Vancomicina (VAM 30 μg)
Eritromicina (E 15 μg)
Aztreonam (ATM 30 μg)
Cloramfenicol (C 30 μg)
Ampicilina (AMP 10 μg)
Tetraciclina (TE 30 μg)
Carbenicilina (100 μg)
Penicilina G (10 unidades)
Oxitetraciclina (OT 30 μg)
Amoxicilina (AML 10 μg)
Florfenicol

4.4. Selección de las cepas más eficientes

Con la caracterización realizada hasta el momento se seleccionaron dos cepas para
continuar con la investigación. Se seleccionaron las cepas que en conjunto presentaron
la mejor eficiencia frente a inhibición de patógenos, las cepas que presentaron baja
sensibilidad frente a antibióticos, mayor resistencia a pH bajo, salinidad y que a su vez
fueron catalasa negativa y no produjeron gas. A estas cepas se les realizó prueba de
crecimiento en el tiempo en agar MRS para conocer su viabilidad en UFC/mL y las
fases de crecimiento de estas.
4.4.1. Conservación de cepas seleccionadas

Las cepas aisladas serán preservadas en tubos de criópreservación con caldo MRS con
30% de glicerol a -20ºC para uso posterior. Esta última prueba será efectuada a las
cepas seleccionadas que presenten los mejores desempeños durante los ensayos.
Estos criterios son indispensables para determinar un microorganismo como probiótico
de acuerdo a lo referenciado por varios autores: Yimin et al,(1998 y 1999), (Carr et al,

2002), (Requena, 1995; Daeschel, 1989; Brink, 1991), Jehanno et al (1992), Ramírez,
2006 y Dopazo, el pool de cepas con que se trabajará será seleccionado a partir de los
resultados obtenidos con las bacterias que presenten las mejores características
referidas.
4.5 Selección del medio de cultivo

4.5.1. Diseño experimental

El diseño del medio de cultivo se realizó a partir de un ajuste de los resultados
obtenidos por Ramírez (2005) en un medio hecho a partir de leche de soya, como fuente
de proteína; suero de leche y sacarosa, como fuentes de carbohidratos y salvado de trigo
como fibra prebiótica, Para determinar la concentración óptima de cada componente se
aplicó un diseño experimental ajustado a un Modelo Compuesto Central Rotable con
Superficie de Respuesta. Los datos se procesaron en el programa estadístico Minitab 15,
al cual se introdujeron los valores máximos y mínimos posibles de cada componente, a
partir de los cuales el programa generó una matriz de 20 tratamientos, cada uno con una
proporción diferente de los tres componentes. Cada cepa se sometió a fermentación en
cada uno de los 20 tratamientos por duplicado. Para un total de 40 unidades
experimentales para cada cepa. Las muestras fueron tomadas a las 12 y a las 24 horas.

Tabla 3 Matriz de tratamientos del diseño compuesto central rotable con superficie de respuesta.

Tratamientos Concentración [g/L]
Orden Estadístico Orden
Corrida
SACAROS
A
LS SLB
18 1 15,000 65,000 115,000
17 2 15,000 65,000 115,000
14 3 15,000 65,000 140,227
10 4 23,409 65,000 115,000
8 5 20,000 100,000 130,000
13 6 15,000 65,000 89,773
2 7 20,000 30,000 100,000
19 8 15,000 65,000 115,000
9 9 6,591 65,000 115,000
1 10 10,000 30,000 100,000
6 11 20,000 30,000 130,000
11 12 15,000 6,137 115,000
12 13 15,000 123,863 115,000
5 14 10,000 30,000 130,000
16 15 15,000 65,000 115,000
4 16 20,000 100,000 100,000
3 17 10,000 100,000 100,000
15 18 15,000 65,000 115,000
7 19 10,000 100,000 130,000
20 20 15,000 65,000 115,000

4.5.2. Elección del sustrato

Después de realizar las fermentaciones, los datos se ingresaron al programa Minitab 15
para generar un porcentaje óptimo de los cada uno de los componentes, y el tiempo de
crecimiento de estas cepas; y de esta manera obtener el medio al cual se le realizarán
cinéticas de fermentación a escala para la producción del inoculo. Los rendimientos de
este medio deben ser iguales o mayores a los que se observen en el medio patrón, y se
tuvieron en cuenta azucares totales, concentración de proteínas, evolución de pH y
conteo de microorganismos viables. Para el seguimiento se tomaron muestras cada 3
horas durante 12 horas.
4.5.3. Conteo de Microorganismos Viables en Placa (UFC/mL)

La técnica de conteo en placa favorece la información del número de células viables
durante el proceso en términos de UFC/mL (Unidades Formadoras de Colonia por
mililitro), permitiendo determinar la producción de biomasa en el tiempo. Para realizar

los conteos se diluyó 1 mL de muestra en 9 mL de agua peptonada al 0.1% seguido de
diluciones decimales hasta 10-10
4.5.4. Determinación de azúcar total:
, de cada dilución se transfirieron a cajas de Petri con
medio MRS (De Man & Rogosa, 1960) con azul de anilina, 0.1 mL para la siembra en
superficie. Las cajas se incubaron a 30° C durante 48 horas, se consideraron las cajas de
Petri con conteos de UFC/mL entre 30 y 300 colonias. El número de colonias se
multiplicó por el inverso de la dilución y por 10 para obtener las UFC/mL formadas
(Lanara, 1981). Los conteos fueron comparados contra los conteos de las BAL
sembradas en medio MRS a las mismas condiciones de tiempo y temperatura.

Los azúcares totales fueron determinados por el método de Dubois, (1956), conocido
como el método de antrona. Previamente fue preparada una curva patrón con diferentes
concentraciones de la solución patrón de glucosa; los valores obtenidos de la lectura de
densidad óptica (D.O) a 625 nm. Fueron plotados versus concentración en mg/Ly
obtenida la ecuación de la recta. El dosage de los azúcares de las muestras se efectuó
sobre 2,5 mL de muestra previamente diluída. Los valores obtenidos en las lecturas de
las muestras fueron calculados por la ecuación de la recta, obtenidos en la curva patrón
y multiplicados por el factor de dilución.
4.5.5. Determinación de proteínas

Las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu para dar un complejo color
azul, debido a la reacción del cobre alcalino con la proteína. La intensidad del color
depende del numero de aminoácidos presentes y enlaces peptidicos y cambiara según la
clase de proteínas. La solución azul muestra una absorbancia máxima a 750 nm.

Reactivos:
Solución A: diluir 0,5 gr de tartrato de sodio y potasio, 25 gr de carbonato de sodio,
125mL de hidróxido de sodio 1Nen 125 mL de agua destilada.
Solución B: diluir 2 gr de tartrato de sodio y potasio, 1 gr de sulfato de cobre, 10 mL de
Hidroxido de sodio 1N, 90 mL de agua destilada.
Solucion C: preparar una solución de reactivos de Folin Ciocalteau en agua destilada en
una proporción de 14:1 (se prepara al momento de usar) se adicionan 3 mL de esta
solución a la muestra problema.
Curva estándar: se establece una curva de concentración de 0 a 300 mg/L dentro de una
serie de tubos de ensayo de 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mL de la solución de
seroalbumina y se completa a 1mL con agua destilada.
La dosificación de proteínas es efectuada sobre 1mL de muestra convenientemente
diluida. La curva estándar y las muestras sufren el siguiente tratamiento:
Se ajusta 1mL de patrones de la curva estándar, se adicionan 0.9 mL de solución A, se
coloca a baño maría a 50°C durante 10 min, después se deja reposar en baño de hielo,
adiciona 0.1mL de solución B, se coloca a oscuridad por 10 min, se adiciona 3 mL de
solución C, se coloca en baño maría a 50°C durante 10 min, se deja reposar en baño de
hielo y por ultimo se lee la absorbancia 750 nm.
4.5.6. Evaluación de la producción de biomasa

Los resultados obtenidos permitirán determinar las cepas que resulten ser más
adecuadas en términos tiempo – tasa de crecimiento durante el proceso de fermentación
para establecer el tiempo de duración en la producción de biomasa.

Los cálculos considerados para las cinéticas en los diferentes medios seleccionados en
los diferentes escalamientos, serán los definidos por Crueger (1993) y Rodríguez et al.,

(2003).

La velocidad específica de crecimiento definida por la ecuación:

Y el tiempo de duplicación celular esta definida por la ecuación:

La velocidad específica de crecimiento está definida por la ecuación:
T
Pqp ∆
∆
=
La velocidad específica de formación de productos esta basada en la producción de
manitol en la fase exponencial de crecimiento dado que este es un producto asociado de
la fermentación estará definido como:
Los resultados obtenidos permitirán determinar las condiciones o tratamientos más
adecuados en términos de tiempo - taza de crecimiento, rendimiento durante el proceso
de fermentación.

5. RESULTADOS Y DISCUSION

5.1 Aislamiento y selección de bacterias acido lácticas.

Siguiendo la metodología propuesta en el ítem 4.1, para aislamiento de bacterias lácticas
de intestino de tilapia, fueron recolectadas al azar tilapias adultas con más de 200
gramos de peso, provenientes de fincas ubicadas en los municipios de Castilla, Acacías
y Guamal ubicadas en el Departamento del Meta. De cada una de estas haciendas se
tomaron 20 especímenes de tilapia niloticus y tilapia roja (Oreochromis sp) las cuales
fueron procesadas.

Con este procedimiento fueron aisladas 100 colonias de microorganismos donde 20
resultaron tener características de bacterias ácido lácticas en una primera selección,
debido a la presencia de coloración azul en las colonias, lo cual es una característica
inicial de las bacterias lácticas. Este trabajo se ejecutó en el laboratorio de
Microbiología y Biotecnología Marina en la Universidad del Valle. Las muestras fueron
resembradas en Agar MRS y caldo. La figura 4 muestra el proceso de aislamiento de
las BAL.

Figura 4. Etapas del proceso de extracción de microorganismos lácticos: A. Espécimen de Tilapia O.
niloticus. B. Proceso de desmedulización. C. Extracción del intestino. D Macerado de intestino. E. Siembra
de intestino en Agar MRS azul de anilina. F Colonias desarrolladas en el medio diferencial
A B
C D

5.1.1 Producción de gas y determinación de catalasa:

Para todas las cepas consideradas Gram positivas fue efectuado el test de producción de
gas a partir de caldo MRS con 5% de glucosa y tubo Durham, siguiendo los métodos
recomendados por (Roissart & Luquet,1994 y Yimin et al.,1999). Fueron seleccionadas
las cepas que no presentaron producción de gas. En cuanto a la prueba de catalasa, todas
las colonias que presentaron coloración azul, les fue efectuada esta prueba y
seleccionadas las que presentaron reacción negativa. Como se muestra en la tabla 4.
En la tabla 4 se observan los resultados de las cepas Int 14, 15, 16, C2, C5, C12, P 4,3,
M5 frente a la producción de gas y a la actividad de catalasa. Por esta razón fueron
descartadas debido a que no presentan las características que se necesitan para el estudio
como se menciona en el ítem 4.1.1. Las cepas que presentaron las características que se
buscaban se les realizó caracterización morfológica como se muestra en la tabla 5.En la
figura 5 se observa la prueba de producción de gas y la prueba de catalasa.
Tabla 4 Producción de gas y actividad de catalasa
Cepas Producción de Gas Actividad de Catalasa

R2 - -
R6 - -
R7 - -
P4,0 - -
P4,1 - -
P4,2 - -
M2 - -
M3 - -
Lab 9 - -
Lab1 - -
Bcl - -
A - -
Int 14 + -
Int 15 + +
Int 16 + -
C2 + +
C5 - +
C12 + -
P4,3 - +
M5 + +

Figura 5 A. Cultivo en caldo MRS con glucosa para verificación de producción de gas. B. Prueba de
catalasa.
Fuente: la autora

Tabla 5. Descripción morfológica de las cepas estudiadas
BAL Descripción Microfotografía
R2 Colonias azul medio, tamaño medio, coco-bacilos en pares Gram +, colonias cremosas.

R6 Colonia azul medio, Bacilos pequeños agrupados en parejas, Gram +.Bacilococos en cadenas

R7 Colonia azul medio, Bacilococos pequeños agrupados en parejas, Gram +.

P4.0 Colonias azul oscuro, bacilococos en parejas pequeños formando grupos, Gram+.

P4,1 Gram + bacilos finos, colonias pequeñas, azul medio

A B

P4,2 Colonia azul medio, pequeñas, gram +, formando pares de bacilicocos.

Lab 1 Colonia azul oscuro, formando parejas de bacilos medios, gram +.

Bcl Colonia azul medio, formando parejas de bacilococos, Gram +.

Lab 9 Colonias azul oscuro pequeñas, bacilos medianos en parejas, Gram +.

A Colonia azul medio, formado parejas de bacilo cocos, Gram +.

M3 Colonias azul medio, gram +, forma parejas de bacilococos.

Colonias azul medio, formando grupos de bacilos
medianos, Gram +.

5.1.2. Tolerancia de BAL a diferentes concentraciones de NaCl

Debido a que las BAL aisladas en el presente estudio serán utilizadas como
bioconservantes en un proyecto que se encuentra en desarrollo que tiene como objetivo
bioconservar filetes de tilapia con BAL, se realizó la prueba de tolerancia a diferentes
concentraciones de NaCl, debido a que la mayoría de microorganismos se ven inhibidos
en su crecimiento por la sal , por esta razón se quiere garantizar que las BAL aisladas
sobrevivan en un producto al que se le ha adicionado sal, y que no pierdan su acciónbioconservante.

La mayoría de las cepas aisladas presentaron resistencia a las diferentes concentraciones
de salinidad (2, 5 y 10 %) con viabilidades óptimas (109 -1010), siendo este uno de los
criterios de selección para la elaboración de los inóculos. Lo cual coincide con los
resultados de los estudios realizados por Ramírez (2005) y Roissart et al., (1994)
quienes reportan cepas de BAL resistentes a niveles de hasta 18% de sal con
viabilidades del orden de 106
La figura 6 muestra los resultados obtenidos, para la tolerancia a las diferentes
concentraciones de sal que presentan las bacterias lácticas aisladas, observándose así
que 8 de las 12 cepas evaluadas mostraron un buen crecimiento a altas concentraciones
de sal (10%), siendo este un criterio de selección.
UFC/mL.

Figura 6. Tolerancia a diferentes concentraciones de sal de las bactérias lácticas aisladas

5.1.3. Viabilidad de BAL en diferentes concentraciones de pH.

A las BAL aisladas se les realizó prueba de resistencia a diferentes pH como se nombra
en el ítem4.1.3para observar si logran sobrevivir en concentraciones bajas, debido a que
este es un proceso de selección para la elaboración del inoculo ya que no se requeriría
tener un control de pH en la producción del mismo, resultando económicamente
favorable a nivel industrial y resistiendo el ambiente digestivo de los peces. La figura 7
muestra los resultados de la prueba de resistencia a diferentes valores de pH. Los cuales
indican que la mayoría de los microorganismos estudiados son capaces de sobrevivir en
medios de cultivo ácido, manteniendo su viabilidad entre 106 y 109 UFC/mL hasta pH
3.5. Sin embargo, siete cepas fueron capaces de resistir en pH 2,5 siendo R6, R2, Lab 9
y M3 las que presentaron una mejor viabilidad en este pH. Siendo lo anterior
consecuente con Ramírez (2005) donde indica que algunas BAL son capaces de
sobrevivir hasta pH 2,0.

Figura 7. Cepas de bal aisladas frente a diferentes ph
5.1.4.Produccion de acidos organicos

El perfil de características de los ácidos orgánicos producido por las diferentes cepas
seleccionadas fue determinado según la metodología descrita en el ítem 4.1.4.De esta
manera se observa las diferencias entre las BAL, debido a las comparaciones en los
perfiles de producción de ácidos para identificar las cepas como homofermentativas u
heterofermentativas.

Una de las principales causas por la que las bacterias ácido lácticas son utilizadas como
probióticos en la acuicultura, es porque presentan la capacidad de matar o inhibir el
crecimiento de las bacterias estrechamente relacionadas con ellas, lo que se conoce
como antagonismo láctico. Entre las causas de este antagonismo están la producción de
compuestos inhibitorios como ácido láctico y otros ácidos de cadena corta, así como
metabolitos como el peróxido de hidrogeno (H2O2) y bacteriocinas, con los que inhiben

el crecimiento de otros microorganismos (Fredrickson y Stephanopoulos, 1981;
Vandreberg, 1993; Ring y Gatesoupe,1998). Citado por Escobar et al 2006

Las cepas aisladas produjeron acido láctico en promedio de 29 g/L teniendo un mínimo
de 7,9 y un máximo de 52 g/L, siendo este el principal producto del metabolismo, estas
cepas también produjeron acido cítrico, acido succínico, acido acético y propionico en
menor cantidad, Annuk et al., (2003) correlaciona la producción de ácidos orgánicos en
las cepas consideradas probioticas, encontrando que las cepas productoras de acido
láctico y acido acético ejercerán actividad inhibitoria frente a algunos patógenos. Otros
autores como Mishra y Lambert (1996), asociaron una elevada actividad antagónica con
la producción de ácidos orgánicos de las bacterias lácticas, ocasionando una
disminución de pH y de este modo inhibiendo el crecimiento de microorganismos
patógenos. Owerhand (1998), se refiere a la actividad antimicrobiana como un efecto de
interacción de los diferentes ácidos orgánicos de las BAL. Es posible considerar que
todas las afirmaciones tengan una relación significativa en la inhibición de actividad
antibacteriana. En este estudio se escogieron las cepas que tuvieran mayor producción
de acido láctico y homofermentativas en cantidades minimas de cualquier otro acido
orgánico. Concentraciones elevadas de acido láctico pueden ocasionar una baja de pH
en el medio, inhibiendo otros microorganismos, mas no necesariamente indicando que
sea este la principal causa de inhibición bacteriana, ya que puede ser debida a otros
metabolitos secundarios.

Debido a las características benéficas que presentan las bacterias acido lacticas, ha
aumentado el interés entre los investigadores para utilizarlas como probiotico.
Inicialmente se utilizaron en humanos, pollos y lechones, y solo recientemente se han

usado en acuicultura. Entre los estudios realizados con tilapia utilizando BAL como
probióticos se encuentra que el de Poot(2001), quien aisló e identifico BAL del tracto
intestinal de la Tilapia nilotica bajo condiciones de cultivo. El género dominante
encontrado en la microflora de la tilapia fue Enterococcus. De las BAL aisladas que
obtuvo, Enterococcus durans presentó acción inhibitoria in vitro contra de bacterias
patógenas Aeromona hydrophila y Spingomonas paucimobilis.
Igualmente, Lara-Flores (2003) realizó un estudio con el objetivo de aislar e identificar
BAL como posibles probióticos de la flora nativa de la tilapia nilotica. De las bacterias
aisladas, Streptococcus sp.se presentó como el microorganismo nativo mas viable a
utilizarse como probióticos en dietas para tilapia debido a los resultados positivos que
obtuvo en bioensayos de crecimiento. Así mismo, observó una disminución en el estrés
y un efecto benéfico sobre el medio ambiente de cultivo a disminuir los
microorganismos patógenos circundantes. De este modo debe ser considerada la
importancia de presencia de metabolitos antimicrobianos en la selección de cepas
consideradas como probióticas. La tabla 6 muestra la producción de ácidos orgánicos de
las BAL estudiadas.
Tabla 6. Produccion de acidos organicos en g/L de las BAL aisladas de tilapia.
nombre cepa acido cítrico glucosa succínico láctico acético propionico
P4,0 1,442 1,382 0,488 17,598 4,5 0,804
Bcl 2,027 0,304 0,187 28,484 4,488 1,055
R6 1,053 3,853 0,568 42,222 4,438 0,85
P4,1 1,074 4,712 0,256 18,859 2,475 0,456
M2 0,987 2,825 0,367 21,214 2,787 0,851
Lab 9 1,704 0,276 0,178 48,296 0,885
Lab 1 1,098 2,744 0,146 13,018 0,534
R7 1,188 29,479 0,506
A 1,21 7,954 0,557
R2 1,412 52,733 0,56
P4,2 1,088 39,692 0,803
M3 0,246 0,445 0,045 28,810

0,128

5.1.5. Detección de isómeros de ácido láctico.

Según el método de Jehanno, (1992) fue encontrado que en la mayoría de cepas
estudiadas presentan isómeros del tipo D- y DL; siendo pocas las cepas detectadas como
productoras de L+, confirmado lo anterior por Fuller, (2002) y Roissart et al. (1994).
En esta prueba las BAL aisladas presentaron isómeros DL en su totalidad como se
observa en la tabla 7, lo que indica que son cepas indicadas para la elaboración de
inóculos ya que estos isómeros son aptos para el consumo animal, según la evaluación
de la FAO (1996) y lo confirmado por Jehanno (op. cit.).
Tabla 7 Producción de isómeros de acido láctico de las BAL.
CEPAS Isómeros de
acido láctico
R2 DL
R6 DL
R7 DL
Lab1 DL
Lab9 DL
Bcl DL
P 4,1
P4,2
M2
M3
A
P4,0
DL
DL
DL
DL
DL
DL

Figura 8 .prueba de isomeros
FUENTE: Autora

5.2 Pruebas bioquimicas

De acuerdo con los resultados obtenidos de las pruebas de caracterización y morfología
ya efectuadas, se realizó un análisis de identificación bioquímica para 10 cepas de
microorganismos lácticos.

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