Degradación de Etilentiourea por Microhongos

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Universidad
del Valle
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DEGRADACIÓN DE 
ETILENTIOUREA (ETU) POR PARTE DE MICROHONGOS AISLADOS DE 
SUELOS EXPUESTOS AL FUNGICIDA CURZATE 
 
 
 
 
 
 
 
 
CLAUDIA PATRICIA PALACIOS AVELLA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGIA 
SANTIAGO DE CALI 
2012 
 
 EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DEGRADACIÓN DE 
ETILENTIOUREA (ETU) POR PARTE DE MICROHONGOS AISLADOS DE 
SUELOS EXPUESTOS AL FUNGICIDA CURZATE 
 
 
 
CLAUDIA PATRICIA PALACIOS AVELLA 
 
 
 
 
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar por el 
título de Bióloga 
 
 
 
 
 
Directora 
NEYLA BENITEZ CAMPO 
M.Sc. 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGIA 
SANTIAGO DE CALI 
2012 
 
 
 
 UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGIA 
SANTIAGO DE CALI 
2012 
 
 
 
 
 
 
CLAUDIA PATRICIA PALACIOS AVELLA, 1984 
 
 
 
 
 
 
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DEGRADACIÓN DE 
ETILENTIOUREA (ETU) POR PARTE DE MICROHONGOS AISLADOS DE 
SUELOS EXPUESTOS AL FUNGICIDA CURZATE 
 
 
 
 
 
 
 
TEMAS Y PALABRAS CLAVES: Trichoderma sp., mancozeb, etilentiourea, 
biodegradación microbiana. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
 
 
 
A Dios por haberme dado Fé, Fortaleza, Valentía y ser siempre mi guía; 
A mi madre amada Gilma por su inmenso cariño y apoyo incondicional; 
A mi amado esposo Elkin por su gran amor y por ser mi ayuda idónea; 
A toda mi familia por su confianza, a mis compañeros por su amistad y a mi 
profesora Neyla por su guía. 
 
 
 
 
Todo tiene su tiempo, y todo lo que se quiere debajo del cielo tiene su hora…un 
tiempo para plantar y otro para cosechar. Eclesiastés 3:1-2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A la profesora Neyla Benitez Campo, directora de tesis, por su 
acompañamiento, enseñanzas, apoyo y cariño. Y al profesor Rubén por su 
colaboración. 
Al personal del laboratorio de Biología y de Microbiología Industrial y Ambiental, 
en especial a Esperanza Obando por su inmensa colaboración y compañía. 
A Carlos Rodríguez y Luis Eduardo Hurtado del laboratorio de 
Espectrofotometría por su gran ayuda. 
A Erika Meñaca por su apoyo incondicional y amistad. 
A todos mis compañeros del Grupo de Investigación en Microbiología y 
Biotecnología Industrial por ofrecerme su amistad y por todo lo que aprendí de 
ellos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Contenido 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
RESUMEN 
2. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 1 
3. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE ...................................................................... 4 
3.1. DESCRIPCIÓN GENERAL DEL MANZATE .............................................................. 4 
3.1.1. Manzate .................................................................................................................... 4 
3.1.2. Etilentiourea.............................................................................................................. 5 
3.2. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LA BIORREMEDIACIÓN ........... 7 
3.3. CARACTERÍSTICAS DE LA CEPA SELECCIONADA PARA LOS 
BIOENSAYOS: Trichoderma sp......................................................................................... 10 
4. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 14 
4.1. GENERAL ...................................................................................................................... 14 
4.2. ESPECÍFICOS .............................................................................................................. 14 
5. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................. 15 
5.1. QUÍMICOS ..................................................................................................................... 15 
5.2. MICROORGANISMOS ................................................................................................ 15 
5.2.1. Reactivación de las Cepas ................................................................................. 15 
5.3. SELECCIÓN DE CEPAS CON POSIBLE TOLERANCIA AL MANZATE Y 
ETILENTIOUREA ................................................................................................................. 16 
Los microhongos aislados del suelo expuesto al fungicida Curzate en el Cauca, se 
sembraron en agar PDA y se incubaron a 30ºC por 10 días. ....................................... 16 
5.3.1. Prueba de tolerancia al Manzate ........................................................................ 16 
5.3.2. Identificación del microhongo seleccionado ...................................................... 17 
5.3.3. Bioensayo con Etilentiourea ................................................................................ 17 
 
 5.4. CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) ....................................................... 18 
5.5. CURVA DE CRECIMIENTO ....................................................................................... 19 
5.6. BIOENSAYO DE DEGRADACIÓN DE ETILENTIOUREA Y MÉTODO 
ANALÍTICO ............................................................................................................................ 20 
5.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................... 21 
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................................... 22 
6.1. SELECCIÓN DE CEPAS ............................................................................................. 22 
6.1.2. Caracterización de la cepa seleccionada .......................................................... 26 
6.1.3. Tolerancia a la ETU .............................................................................................. 27 
6.2. CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA ............................................................. 29 
6.3. CURVA DE CRECIMIENTO ....................................................................................... 31 
6.4. DEGRADACIÓN DE ETILENTIOUREA .................................................................... 34 
7. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 36 
8. REFERENCIAS .................................................................................................................... 38 
10. ANEXO A. TABLAS DE POST-ANOVAS ..................................................................... 41 
11. ANEXO C. DIAGRAMA DE FLUJO METODOLOGÍA ................................................. 42 
 
 
 
 
 
 
 
 
 LISTA DE FIGURAS 
 
 
FIGURA 1:Fórmula estructural de Mancozeb…………………………...............5 
FIGURA 2:Fórmula estructural de la Etilentiourea………………………………6 
FIGURA 3: Diseño bioensayo para determinar la tolerancia de las cepas al 
Mancozeb. ………………………………………………………………………… 17 
FIGURA 4: Curva de crecimiento en diámetro con respecto al inóculo de las 
cepas sembradas en medio PDA con Mancozeb a una 
concentración de 1,75g/L, incubadas durante 10 días a 
28ºC…………………………………………………………………...23 
FIGURA 5: Vista macroscópica de las cepas aisladas tratadas con 
Mancozeb…………………………………………………………….24 
FIGURA 6: Vista microscópica de Trichoderma sp………………………….......26 
FIGURA 7: Tolerancia de Trichoderma sp., a la ETU.………………………...27 
FIGURA 8: Alteraciones en las características macroscópicas de Trichoderma 
sp., y del medio de cultivo en función del tiempo de incubación en 
presencia de ETU…………………………………………………….28FIGURA 9: Curva de crecimiento para determinar la concentración mínima 
Trichoderma sp. Se emplearon concentraciones desde 0ppm 
hasta 1600ppm de ETU diluido en medio de sales basales líquido 
(Caldo Czapeck Dox)…………………………………………….…..30 
FIGURA 10: Curva de crecimiento de Trichoderma sp., inoculado en caldo 
Czapeck Dox con una concentración de 600ppm de ETU y un 
control sin ETU……………………………………………………….32 
FIGURA 11:Curva de degradación de ETU a través del tiempo…………….....34 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
La Etilentiourea, siendo el componente activo del Manzate y Mancozeb 
(considerados como moderadamente tóxicos) tiene carácter mutagénico, 
cancerígeno y teratogénico, debido a su inadecuado uso se acumula en los 
suelos logrando contaminar cuerpos de agua. Frente a este problema y con 
base en los beneficios que brindan los métodos de Bioremediación, se busca 
evaluar la capacidad de aceleración de degradación de Etilentiourea (ETU) 
utilizando microorganismos aislados de un suelo tratado con fungicida Curzate 
(Cymoxanil 8% , Mancozeb 64%); sometiendo dichos microorganismos a 
pruebas de tolerancia y bioensayos de degradación del plaguicida. Según los 
resultados obtenidos de mayor tolerancia y bajo efecto nocivo en las 
estructuras biológicas, se seleccionó un microhongo del género Trichoderma 
para realizar los bioensayos de degradación de la ETU en solución acuosa. Se 
encontró que Trichoderma logró acelerar el proceso de degradación (67,8%) 
después de seis días de exposición a 170ppm. La importancia a nivel agrícola 
de este microhongo, sus características y versatilidad metabólica lo convierten 
en un elemento importante para estudios aplicados a la Bioremediación de 
aguas y suelos contaminados con plaguicidas. 
 1 
2. INTRODUCCIÓN 
La agricultura en Colombia ocupa el 40% de la fuerza laboral y representa el 
50% de las divisas (González, 2011) y dada su importancia, el desarrollo y 
aplicación de plaguicidas ha sido indispensable para combatir una variedad de 
plagas y enfermedades, que de no ser controladas disminuirían el volumen y 
calidad de la producción alimentaria. 
 
Según el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), en Colombia las 
formulaciones de plaguicidas se han duplicado en los últimos treinta años; en 
1974 se formularon 770 productos basados en 186 componentes activos, cifra 
que aumentó para el 2003 a 1.370 productos con base en 400 componentes 
activos, de los cuales aproximadamente una quinta parte se encuentran 
prohibidos o restringidos en otras partes del mundo por su nivel de 
contaminación ambiental y de alimentos. (Vivas et al., 2008). 
Los ingredientes activos de mayor producción reportados entre 2004 y 2007 en 
Colombia fueron Curzate, Manzate y Cymoxanil, principalmente estos 
compuestos son empleados para eliminar hongos de los cultivos de plátano, 
banano, arroz, papa y frijol (González, 2011), porque tienen un amplio espectro 
de acción y son de bajo costo. Estos componentes son considerados 
compuestos de toxicidad moderada, sin embargo su principal producto de 
degradación es la Etilentiourea (ETU) (González, 2008), la cual posee carácter 
cancerígeno, mutagénico y teratogénico alto (Figuerredo, et al., 2006). 
 
Las pruebas de toxicidad de estos plaguicidas, en muchas ocasiones son 
realizadas por los mismos laboratorios que los fabrican, en cuyo caso, la falta 
 2 
de ética y el interés por una mayor comercialización del producto relega a un 
segundo plano el impacto ambiental causado. 
 
Por lo anterior, la contaminación del suelo por uso de plaguicidas es de 
particular importancia, debido a la transferencia de dichos compuestos 
xenobióticos hacia los alimentos, aguas subterráneas y superficiales, en donde 
pueden llegar fácilmente a acumularse en el tejido vivo (bioacumulación) e ir 
ascendiendo en la cadena trófica con el efecto de aumento en su 
concentración, fenómeno denominado magnificación (Calvelo, 2008). 
 
Frente a lo anterior, se ha observado que dichos compuestos químicos, 
constituyen una adecuada fuente de carbono y donadores de electrones para 
ciertos microorganismos del suelo. Existen estudios realizados con bacterias y 
hongos aislados de suelos y cuerpos de agua contaminados, que han logrado 
degradar rápidamente compuestos xenobióticos a sustancias más amigables 
con el medio ambiente, algunos ejemplos de ellos son Pseudomonas, 
Aspergillus fumigatus, A. niger, A. terreus, Rhizopus microsporus, Rhodococcus 
sp., Sphingomonas wittichii, entre otros miscroorganismos (Torres, 2003). 
 
Con el propósito de evaluar la capacidad de Trichoderma sp., para degradar el 
compuesto tóxico ETU (el cual se acumula en el suelo como resultado de la 
aplicación incorrecta por parte de los usuarios) se utilizaron microhongos 
aislados por Bedoya (2009) de suelos cultivados con frijol e irrigados con 
fungicida Curzate® (Cymoxanil 8% y Mancozeb 64%), los cuales resistieron al 
tratamiento. Al realizar las pruebas a dichos microorganismos, la cepa asilada 
 3 
del género Trichoderma mostró resultados positivos al acelerar el proceso de 
degradación de la ETU, pudiendo ser usado en campo para eliminar más 
rápidamente la Etilentiourea del suelo, teniendo en cuenta que Trichoderna no 
se considera fitopatógeno. 
 
De esta manera, frente al problema de contaminación de suelos producida por 
aplicación indebida de plaguicidas, el uso de microorganismos como 
Trichoderma, brinda un método potencialmente viable para aumentar la tasa de 
degradación de compuestos tóxicos, evitando así la contaminación de cuerpos 
de agua por escorrentía o lixiviación con plaguicidas, sus componentes activos 
o productos de degradación acumulados en el suelo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 4 
3. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE 
 
3.1. DESCRIPCIÓN GENERAL DEL MANZATE 
 
3.1.1. Manzate 
El fungicida Manzate es considerado medianamente tóxico; al igual que el 
Curzate (aplicado en el cultivo de frijol a partir del cual se aislaron las cepas) 
cuya composición en mayor proporción es Mancozeb, el Manzate presenta un 
80% de Mancozeb en su composición y el 20% restante corresponde a 
ingredientes aditivos e inertes, El principal producto de degradación del 
Mancozeb en ambos fungicidas es la Etilentiourea (imidazolidina-2-tiona). 
El Mancozeb pertenece a los Etilenbisditiocarbamatos (EBCD’s), es un 
compuesto de coordinación polimérico de manganeso y zinc cuya composición 
es: 62% EBDC, 16% manganeso, 2% zinc y 20% aditivos (González, 2008). Su 
formula química es (C4H6MnN2S4)x(Zn)Y, donde x/y corresponde a 11. La 
formula estructural se muestra en la figura 1. 
 
Figura 1. Formula estructural de Mancozeb 
Según la FAO, en el suelo, el Mancozeb es poco persistente y su 
semidesintegración sobre el terreno es de uno a siete días. Se degrada de 
 5 
forma rápida y espontánea en etilenotiourea (ETU) en presencia de agua y 
oxígeno, y durante la cocción de alimentos que contiene residuos del fungicida. 
Según la ficha técnica expedida por Export Rubicon SL (España – China), 
dado que el Mancozeb es prácticamente insoluble en el agua, es poco probable 
que se infiltre en aguas subterráneas. Además, se considera que debido a que 
es fácilmente hidrolizado en agua, no se bioacumula en los organismos 
acuáticos, mostrando una baja toxicidad para peces y aves. Adicionalmente, el 
Mancozeb tiene una vida media en suelo extremadamente corta (3 a 40 horas). 
Este compuesto tiene un moderado potencial de movilidad en suelos, pero 
debido a la relativamente alta velocidad de degradación química y microbiana 
no es fácil su migración a capas más profundas, y en el aire debido a su 
insignificante presión de vapor, tiene un bajo potencial de volatilización. Sus 
productos de degradación al hidrolizarse en agua son ETU, Etilenourea y 
Etilenbisisotiocianato (González, 2008). 
 
3.1.2. Etilentiourea 
 
Constituyeuno de los residuos más importantes estudiados en el medio 
ambiente, su estructura química se observa en la figura 2, su formula química 
es C3H6N2S, y se conoce también como 4,5-dihidroimidazola-2(3H)-tiona. La 
ETU es el principal producto de degradación del Mancozeb, y está clasificada 
en la categoría toxicológica I debido a que es carcinogénico, teratogénico y 
mutagénico, lo que lo convierte en un compuesto de alto riesgo para la salud 
de las personas (Domínguez et al., 2009). 
 
 6 
 
Figura 2. Formula estructural de Etilentiourea 
 
 La ETU en agua es relativamente estable a la hidrólisis y en suelo es química 
y biológicamente degradado a Etilenourea, con tiempos de vida media de 1 a 8 
días bajo condiciones aeróbicas en campo. Sin embargo, debido a la 
frecuencia de aplicación que excede su vida media, su concentración aumenta 
con el tiempo, generando un riesgo potencial de contaminación de acuíferos 
persistiendo durante un período más largo, del orden de cinco a diez semanas. 
 
La ETU se adsorbe muy débilmente al suelo, y debido a su bajo peso molecular 
y alta solubilidad en agua, presenta un alto grado de lixiviación a través del 
perfil del suelo convirtiéndose en un potencial agente de contaminación de las 
aguas subterráneas en concentraciones que ponen en riesgo la vida acuática. 
Adicionalmente, el agua de escorrentía, representa el proceso de movimiento 
de agua de mayor arrastre de contaminantes. Dependiendo de las 
características del cultivo, una gran cantidad del fungicida aplicado tiene una 
elevada posibilidad de ser arrastrado por las aguas lluvias o aguas de riego 
hacia las fuentes de agua superficial haciendo potencial el riesgo de 
contaminación por diversas sustancias agrotóxicas (González, 2008). 
 
González (2008) analizó la dinámica de la Etilientiourea, Mancozeb y Zinc en 
el suelo, y encontró que la ETU (derivado por hidrolisis del Mancozeb) era un 
potencial contaminante de aguas subterráneas, gracias a su alta movilidad en 
 7 
el suelo; se encontraron cantidades de 20.3ppb de ETU en aguas 
subterráneas, siendo el máximo permitido de 0.02ppm (González, 2008). 
 
Existe evidencia suficiente de que tres Etilenbisditiocarbamatos (Maneb, 
Mancozeb y Metiram), pueden inducir cáncer de tiroides por la formación del 
derivado común ETU. En Finlandia, se han estudiado los efectos en roedores, 
encontrando una disminución en la tiroxina y un incremento en la estimulación 
de la hormona tiroidea. En experimentación animal se ha comprobado que 
causa efectos cancerígenos, siendo considerado por el Instituto Nacional de 
Seguridad y Salud Ocupacional, como un potencial cancerígeno humano 
(Kurttio et al., 1990). 
 
Se ha estudiado en el río Bogotá (municipio de Suesca), el impacto del 
vertimiento de plaguicidas organofosforados, carbamatos, ditiocarbamatos y 
organoclorados, sobre la fauna íctica (pez capitán de la sabana, Eremophilus 
mutisii) y la población que lo consume, debido a que en este río se vierten gran 
cantidad de residuos orgánicos y plaguicidas a lo largo de su recorrido, y 
pobladores consumen y comercializan éste pez (Salcedo et al., 2008). 
 
 
 
3.2. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LA BIORREMEDIACIÓN 
 
 
La Biorremediación hace uso de las habilidades metabólicas de los 
microorganismos para degradar compuestos orgánicos. Esta tecnología está 
basada en el uso de organismos naturales o modificados genéticamente para 
recuperar sitios contaminados y proteger el medio ambiente (Torres, 2003). De 
 8 
acuerdo al organismo que se utilice en la degradación del compuesto 
xenobiotico, la Bioremediación puede clasificarse en los siguientes tipos: 
 
Fitorremediación. Es el empleo de plantas para remover, contener o neutralizar 
metales pesados o compuestos orgánicos (Torres, 2003). Un ejemplo es el 
empleo de Myriaphyllum aquatinum en la degradación de T.N.T. Thlaspi 
caurulencens se usó en suelos contaminados con zinc y cadmio. Lombi et al 
(2001) encontraron que esta especie lograba eliminar más de 8 mg/Kg de 
cadmio y 200 mg/Kg de zinc en suelos agrícolas. 
 
Biorremediación microbiana. Consiste en la utilización de microorganismos 
para transformar diferentes compuestos nocivos en otros de menor impacto 
ambiental. Aunque las bacterias han sido las más empleadas, en la actualidad 
se estudian y usan diferentes microhongos, algas, cianobacterias y 
actinomicetes para la degradación de compuestos contaminantes (Torres, 
2003). 
 
Bioremediación enzimática. Empresas biotecnológicas comercializan enzimas 
obtenidas en cantidades industriales a partir de microorganismos (bacterias y 
hongos) que las producen naturalmente o son modificados genéticamente, 
estas enzimas son empleadas en el sitio contaminado con el fin de degradar el 
compuesto nocivo. Un ejemplo lo constituyen las enzimas lipasas (que 
degradan lípidos), que se usan junto a cultivos bacterianos para eliminar los 
depósitos de grasa de las paredes de las tuberías que transportan los efluentes 
(Alcalde, et al. 2006). 
 9 
En respuesta a la problemática de contaminación ocasionada por plaguicidas, 
los estudios que involucran microorganismos en la degradación de compuestos 
xenobióticos cada vez son más recurrentes. Godoy et al (2003) determinó que 
la bacteria Sphingopyxiz chilensis S37, es capaz de degradar el 2,4,6- 
Triclorofenol, compuesto altamente tóxico, persistente y bioacumulable utilizado 
en el blanqueamiento de madera y como biocida. 
Fournier et al (2002) citado por Torres (2003), realizaron ensayos para estudiar 
la transformación del herbicida atrazina por la bacteria Rhodococuss sp. este 
compuesto logró ser tranformado en nitrito (30%), óxido nitroso (3,2%), amonio 
(10%) y formaldehido (27%). Bordjiba et al (2001) citado por Torres (2003) 
aislaron varias especies de hongos de suelos contaminados con plaguicidas en 
Argelia, encontrando Aspergillus fumigatus, A. niger y Rhizopus microsporus 
entre otras 53 especies aisladas se destacaron por su habilidad para 
degradadar el herbicida metribuzin en medio líquido. Absidia y Fusarium 
lograron eliminar el 50% del compuesto después de 5 días. Mientras que 
Botrytis cinerea eliminó el herbicida linuron casi por completo. Bhalerao & 
Puranik (2007) usaron colonias Aspergillius niger aisladas de suelos tratados 
con el pesticida endosulfan, y encontraron que lograba metabolizar el 
compuesto logrando su mineralización. 
 
Estos estudios entre otros, presentan un panorama alentador para el campo de 
la Bioremediación tanto en aguas como en suelos por parte de los 
microorganismos que pueden además de tolerar los contaminantes lograr 
transformarlos o eliminarlos del medio contaminado. 
 10 
3.3. CARACTERÍSTICAS DE LA CEPA SELECCIONADA PARA LOS 
BIOENSAYOS: Trichoderma sp. 
En el presente trabajo, al realizar los bioensayos de selección del 
microorganismo con posibilidad de degradar la ETU del medio acuoso, el 
género Trichoderma mostró una tolerancia mayor al ser expuesta al 
contaminante y menores alteraciones morfológicas, por lo cual se eligió para 
las pruebas de degradación del contaminante. Adicionalmente, es un 
microhongo que raramente ataca plantas superiores, y las especies 
pertenecientes a éste género, han sido plenamente caracterizadas por tener 
aplicación en el ámbito agrícola, principalmente para el control biológico de 
otros organismos patógenos que atacan a los cultivos (Alcalde, et al. 2006. Sin 
embargo, los estudios sobre su comportamiento y su efecto en ambientes 
terrestres y acuáticos contaminados han sido escasamente estudiados 
(Argumedo et al., 2009). 
 
Trichoderma es un hongo filamentoso y se adapta fácilmente a condiciones 
severas comparado con otros microorganismos; dado que no son sensibles a la 
presión osmótica pueden crecer en sustratos con concentraciones de azúcares 
elevados, creciendo lentamente de 5 a 7 días. El pHes fundamental para el 
desarrollo, a pH alto se ve afectada la solubilidad de los metales y a pH bajo se 
afectan los sistemas enzimáticos, el ingreso de vitaminas esenciales, ácidos 
orgánicos y la toma de minerales. El pH óptimo está entre 4 y 6, sin embargo, 
se ha encontrado que puede tolerar pH entre 2 y 9 (Arias & Piñeros, 2008). 
 11 
Su aislamiento y cultivo es sencillo y la temperatura óptima de crecimiento se 
encuentra entre los 25ºC y 30ºC. En condiciones adversas desarrolla 
clamidosporas como estructuras de resistencia. 
 
Trichoderma, es un hongo común en el suelo, se caracteriza por tener una 
velocidad de crecimiento alta, abundante esporulación y un metabolismo 
versátil, producto de la gran variedad de enzimas que posee (quitinasas, 
glucanasas, celulasas, xilasas, hemicelulasas, sulfatasa, entre otras), lo que 
hace que pueda desarrollarse en todas las latitudes, obteniendo carbono y 
energía de diferentes sustratos orgánicos incluso complejos, lo que le brinda 
una alta eficiencia como saprófito y competencia antagónica; éste último 
aspecto es útil en control biológico, por lo cual es altamente estudiado (Infante 
et al., 2009). Por sus innumerables características, se podría considerar a 
Trichoderma como el hongo beneficioso, más versátil y polifacético que se 
encuentra en los suelos (Argumedo et al., 2009). 
 
Con base en esta capacidad enzimática, las especies de Trichoderma pueden 
contribuir en la degradación potencial de compuestos orgánicos contaminantes 
depositados en el suelo, como resultado de las prácticas agrícolas. De manera 
específica, los microorganismos pueden transformar los contaminantes orgá-
nicos en compuestos que presenten menor o mayor toxicidad, con respecto al 
compuesto original. En contraste, algunos microorganismos pueden degradar 
completamente los contaminantes orgánicos, lo que implica su completa 
mineralización hasta compuestos inocuos como agua y dióxido de carbono 
(Argumedo et al., 2009). 
 12 
Gracias a que varias especies de Trichoderma, poseen resistencia innata a la 
mayoría de los agroquímicos, puede ser utilizado como elemento de 
biorremediación en la destoxificación de contamiantes orgánicos e inorgánicos, 
tanto en agua como en suelos. Tal es el caso de T. viride, que contribuye en la 
degradación del herbicida Triflurina en más del 90 % en aproximadamente 10 
días. Anderson y Domsch (1976) citados por Argumedo et al. (2009), 
mencionan que la degradación del herbicida Arvadex realizada por T. 
harzianum es muy lenta en cultivo líquido, ya que fue menor al 20% después 
de 10 días de incubación. En contraste, las especies T. harzianum y T. 
longipilus son sensibles al herbicida fosfinotricina. 
 
Por otro lado, la mayoría de plaguicidas organoclorados como el DDT, el 
dieldrin y el endosulfán, son persistentes en la naturaleza y presentan alta 
toxicidad. No obstante, se ha documentado que Trichoderma es capaz de 
degradar estos tres plaguicidas, generando sulfato de endosulfán y el diol de 
endosulfán, resultado de la acción de un sistema enzimático oxidativo, por 
parte de T. harzianum. Lo anterior sugiere que la enzima hidrolítica sulfatasa es 
la responsable indirecta de la formación del diol de endosulfan (Mukherjee & 
Mittal, 2005). 
 
Los compuestos sintéticos organofosforados son empleados como insecticidas, 
plastificantes y como armas químicas, que se caracterizan por tener alta 
toxicidad hacia mamíferos y que se encuentran contaminando tanto 
ecosistemas acuáticos como terrestres. T. harzianum es capaz de utilizar el 
insecticida organofosforado Clorpirifos como fuente de azufre y de fósforo y 
 13 
también es capaz de degradar glifosato y ácido aminometil fosfórico (Argumedo 
et al., 2009). 
En suelos contaminados con elementos potencialmente tóxicos (EPT) de 
origen inorgánico generalmente de carácter metálico, que afectan al ambiente 
ya que pueden ser movilizados en el suelo y lixiviados a través del perfil edáfico 
hacia los mantos freáticos, produciendo contaminación del agua, se han 
encontrado aislados fúngicos del género Trichoderma, denotando con ello su 
capacidad para tolerar estos contaminantes inorgánicos, cuyo potencial tóxico 
es elevado (Argumedo et al., 2009). 
 
Frente a la innegable contaminación de suelos y cuerpos de agua por el uso 
irracional e indiscriminado de pesticidas de un alto efecto residual, causantes 
de grandes daños para la salud animal y humana, Trichoderma presenta una 
opción valiosa de estudio en el campo de la biodegradación de diversos 
compuestos contaminantes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 14 
4. OBJETIVOS 
 
 
4.1. GENERAL 
Evaluar la capacidad de degradación de Etilentiourea (ETU) por parte de 
microorganismos de suelo preadaptados al fungicida Curzate 
(Cymoxanil 8%, Mancozeb 64%). 
 
4.2. ESPECÍFICOS 
4.2.1. Seleccionar la cepa de microhongo que exhiba mejor crecimiento y 
menor alteración morfológica frente a diferentes concentraciones de 
Manzate. 
4.2.2. Determinar la tolerancia del microorganismo seleccionado a diferentes 
concentraciones de ETU. 
4.2.3. Determinar la eficiencia de degradación de la Etilentiourea en medio 
acuoso, inoculado con la cepa que exhibió resistencia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 15 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
5.1. QUÍMICOS 
Para el bioensayo inicial se utilizó el fungicida de uso agrícola Manzate® 200 
WP, fabricado por Griffin de Colombia S.A., distribuido por Dupont de colombia 
S.A., y considerado un fungicida de categoría toxicológica III (medianamente 
tóxico). El 80% de su composición es Mancozeb y el 20% restante corresponde 
a ingredientes aditivos e inertes. El componente activo de éste fungicida es la 
Etilentiourea (imidazolidina-2-tiona) la cual fue utilizada con una pureza del 
98% en los bioensayos de concentración mínima inhibitoria (CMI), curva de 
crecimiento y degradación. 
 
5.2. MICROORGANISMOS 
Las cepas empleadas fueron aisladas de muestras de un suelo cultivado con 
plantas de frijol bajo invernadero, en la finca “la Rejoya” de la Universidad del 
Cauca, las cuales resistieron al tratamiento con fungicida Curzate (Cymoxanil 
8% , Mancozeb 64%) (Bedoya, A. 2009). Estas cepas se sembraron en tubos 
con PDA inclinado y posteriormente se conservaron en agua estéril a 15 ˚C. 
 
5.2.1. Reactivación de las Cepas 
De cada cepa conservada en agua destilada, se extrajo con micropipeta 0,5mL 
de suspensión de esporas, los cuales se depositaron en la superficie de medio 
PDA y se esparcieron uniformemente usando asa de vidrio. Las cajas se 
incubaron de 5 a 7 días entre 27˚C - 28˚C. Pasado este tiempo se verificó el 
crecimiento de colonias y se describieron morfológicamente. Todos los 
 16 
procedimientos se realizaron con estrictas medidas de asepsia y en Cabina de 
Flujo Laminar. 
 
 
5.3. SELECCIÓN DE CEPAS CON POSIBLE TOLERANCIA AL MANZATE Y 
ETILENTIOUREA 
 
Los microhongos aislados del suelo expuesto al fungicida Curzate en el 
Cauca, se sembraron en agar PDA y se incubaron a 30ºC por 10 días. 
Con el fin de verificar y seleccionar las cepas que presentaron una mayor 
competitividad al crecer en medios contaminados con el fungicida y su 
derivado, se realizaron pruebas de tolerancia en caja con Manzate y ETU. 
 
5.3.1. Prueba de tolerancia al Manzate 
Se extrajeron porciones cuadradas de 1cm de lado de cinco cepas reactivadas 
en agar PDA pertenecientes a los géneros Penicillium, Paecilomyces, y 
Trichoderma, se sembraron en medio PDA suplementado con plaguicida 
Manzate® 200 WP a una concentración de 1,75g/L (cantidad recomendada 
para cultivos en frijol), el cual se adicionó luego de esterilizar el medio. 
Posteriormente, se incubaron a 30ºC durante 10 días, se midió el crecimiento 
según el diámetro del inóculo cada 24 horas y se realizaron observaciones de 
topografía, textura y color; un control de cada cepa sembrado en PDA sin ETU 
tambiénfue incubado y medido. Las siembras se realizaron por triplicado 
(Figura 3). 
 
 17 
 
Figura 3. Diseño bioensayo para determinar tolerancia de las cepas al Manzate 
 
Se seleccionó aquel microhongo que presento un mayor crecimiento durante el 
período de incubación y que no mostró una alteración considerable en su 
topografía, textura y color al ser expuesto a la ETU. 
 
5.3.2. Identificación del microhongo seleccionado 
Se utilizaron las técnicas de la cinta adhesiva y microcultivo con el fin de 
observar las estructuras reproductivas, empleando azul de lactofenol para la 
tinción, adicionalmente se utilizó la clave taxonómica de Gilman (1963) para la 
identificación. El microhongo seleccionado e identificado se utilizó en los 
posteriores bioensayos 
5.3.3. Bioensayo con Etilentiourea 
Terminado el tiempo de incubación de la cepa en PDA con Manzate, se extrajo 
una porción de 1cm de lado de la cepa que exhibió mayor tolerancia a la ETU. 
Se sembró en Agar Czapeck Dox (ACD), cuya composición por litro fue 
Sacarosa (30g), Sulfato de Magnesio (0,5g), Nitrato de Sodio (2,0g), Sulfato 
dipotásico (0,35g), Sulfato ferroso (0,001g), Agar-agar (12g) y adicionalmente 
ETU a concentraciones de 20ppm, 35ppm y 50ppm con el fin de establecer un 
 18 
rango inicial de tolerancia y capacidad de metabolizar dicha sustancia. Se 
utilizó un control negativo de agar ACD sin ETU. Paralelamente, se sembró la 
cepa en medio Agar-Agar para descartar que este componente presente en el 
medio utilizado en el bioensayo de tolerancia pudiera ser usado como fuente 
nutritiva de tal manera que desviara significativamente los resultados respecto 
al empleo de ETU por parte del microorganismo. 
 
Se midió diariamente el crecimiento, según el diámetro en centímetros, las 
características de textura y coloración. Este procedimiento se realizó dos veces 
sucesivas para ejercer una mayor presión selectiva al agotar las posibles 
reservas de alimento en el microorganismo y observar la capacidad de 
crecimiento de la cepa y los efectos al ser expuesta al contaminante. 
 
5.4. CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) 
La CMI se realizó para determinar la concentración adecuada en la que el 
microorganismo presentó una mayor tolerancia a la ETU. En el bioensayo se 
utilizó Caldo Czapeck Dox (CCD) sin Sacarosa cuya composición por litro 
fue: Cloruro de Magnesio (0,5g), Sulfato Dipotásico (0,35g) y Sulfato Ferroso 
(0,001g). Se vertió porciones de 50mL en erlenmeyer de 125mL previamente 
esterilizados y se añadió la cantidad de ETU en gramos necesaria para 
preparar caldos con concentraciones de 200ppm, 400ppm, 600ppm, 800ppm, 
1000ppm, 1200ppm, 1400ppm y 1600ppm de ETU con tres replicas cada una. 
Paralelamente, se preparó caldo sin ETU, el cual fue usado como control 
negativo; se ajustó el pH a 5,8, se inoculó con 0,5mL de suspensión de esporas 
con concentración de 1 x 107 esporas/mL (conteo realizado con cámara de 
 19 
Neubauer), y se incubó a 30ºC con agitación constante (120rpm) durante 10 
días empleando Shaker I6 marca New Brunswick Scientific. Transcurrido el 
tiempo de incubación cada tratamiento fue filtrado por gravedad usando papel 
filtro whatman número 2 (previamente pesado), con el fin de determinar el 
peso seco de la biomasa. Posteriormente, se secó el papel filtro en horno 
Heraeus que mantuvo la temperatura constante de 60 ºC durante 20 minutos. 
Por último, se determinó el peso seco usando balanza analítica con precisión 
de ± 0,0001g. 
 
5.5. CURVA DE CRECIMIENTO 
 
Con el propósito de conocer el comportamiento de la biomasa del 
microorganismo durante el tratamiento con ETU, 6 Erlenmeyers de 125mL, 
cada uno con 50ml de caldo Czapeck Dox y 600ppm de ETU (concentración a 
la cual se observó mayor crecimiento microbiano en la CMI), y 6 erlenmeyers 
con caldo sin ETU (control), fueron inoculados con 0.5mL de suspensión de 
esporas con concentración de 1 x 107 esporas/mL e incubados a 30ºC y 
120rpm. Con el fin de establecer la curva de crecimiento, se retiró un 
erlenmeyer cada 24 horas y su contenido se filtró y peso del mismo modo que 
en el numeral 5.4, para determinar la biomasa en gramos. Este procedimiento 
se realizó por triplicado. 
 
Se utilizó Agar Papa Zanahoria y Agar-Agar para estimular la esporulación de 
Trichoderma, la cual fue disminuyendo considerablemente al ser sometido 
constantemente al contaminante. 
 
 20 
5.6. BIOENSAYO DE DEGRADACIÓN DE ETILENTIOUREA Y MÉTODO 
ANALÍTICO 
Para determinar el porcentaje de degradación de la ETU se utilizó el método de 
Espectrofotometría Ultavioleta/Visible (UV/VIS) usando el espectrofotómetro 
UV – 1700 pharmaSpec UV/VIS Spectrophotometer Shimadzu. Se verificó que 
no se generara un “efecto matriz” que corresponde a un aumento o disminución 
de la señal analítica por la presencia de otros componentes al medir la 
absorbancia de cada muestra, en este caso los componentes del CCD utilizado 
en el tratamiento. Para lo anterior, se prepararon diez soluciones con 
concentraciones conocidas y sucesivas de ETU en agua destilada y diez 
soluciones en CCD. Se determinó la absorbancia para cada grupo de muestras 
a una longitud de onda de 232nm, longitud a la cual absorbió el analito al 
realizar el barrido. Se compararon las pendientes de las dos curvas obtenidas, 
las cuales no presentaron diferencias significativas por lo que se concluyó que 
el usar el CCD no alteraba la determinación de la concentración de ETU por 
éste método. 
 
Para realizar los bioensayos de degradación de ETU se seleccionó la 
concentración de 170ppm ya que a 600ppm la toxicidad de la ETU retardó el 
crecimiento microbiano inicial (concentración a la que se dio mayor crecimiento 
micelial en el bioensayo de CMI). Este fenómeno no se evidenció en el 
bioensayo de CMI donde solo se determina el peso de la biomasa al final del 
tiempo de incubación y no se toma en cuenta la cinética del crecimiento a lo 
largo del tratamiento. 
 
 21 
Posteriormente, seis erlenmeyers de 125mL cada uno con 50mL de Caldo 
Czapeck Dox y 170ppm de ETU fueron inoculados con 0,5mL de suspensión 
de esporas (concentración de 1 x 107 esporas/mL) e incubados a 30ºC y 
120rpm durante 6 días. Paralelamente se incubaron 6 erlenmeyers con 50ml 
de caldo y 170ppm de ETU sin inoculo, con el fin de observar la degradación 
química de ETU (control negativo). Cada 24 horas un erlenmeyer de cada 
tratamiento fue extraído de la incubadora , luego se filtró su contenido 
utilizando papel whatman número 2 para retirar la biomasa y se midió su 
absorbancia por el método de espectrofotometría UV/VIS con el fin determinar 
su concentración usando el método de interpolación sobre la curva de 
calibración de ETU en CCD. El blanco usado en el análisis espectrofotometrico 
fue el caldo de sales basales sin ETU (cada tratamiento y dato de absorbancia 
fue realizado por triplicado). 
 
5.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 
En el bioensayo de tolerancia al Mancozeb con las cinco cepas iniciales, se 
aplicó una prueba de Bartlett y Post-Anova de TuCkey para observar 
diferencias significativas. Por otro lado, para analizar la tolerancia de la cepa 
seleccionada, se aplico una ANOVA de medidas repetidas, donde el factor de 
estudio fue la concentración de ETU (ppm), conjuntamente con una prueba de 
normalidad de Shapiro-Wilk y homgenidad de varianza de Levene, por último 
se realizó un análisis de Post-anova de Dunnett. 
 
Para el análisis de Concentración Mínima Inhibitoria, se aplicó prueba de 
Kruskal-Wallis y Post-anova de comparaciones por pareja de Mann-Whitney. 
 22 
Para la curva de crecimiento se utilizó la prueba de Bartlett y Anova de dos 
vías, donde los factores fueron: día de medición y el tatamiento (control Vs ETU 
600ppm). Por último, se realizó una Anova de dos vías de medidas repetidas, 
para el análisis de datos en el bioensayo de degradaciónde ETU. 
 
 
 
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
6.1. SELECCIÓN DE CEPAS 
En la figura 4, se observa que las cepas uno y cuatro no toleraron el 
tratamiento con Manzate, al no exhibir crecimiento. Las cepas dos y cinco 
toleraron la presencia de ETU en el medio, sin embargo su crecimiento no fue 
superior a 6,0cm de diámetro y en la cepa dos el crecimiento ceso alrededor 
del séptimo día de incubación. Adicionalmente las características de textura, 
color y topografía variaron considerablemente respecto al control (Figura 5), 
mostrando así un efecto negativo mayor que el generado en la cepa tres, la 
cual alcanzó los 9,0cm de diámetro correspondiente al diámetro total de la caja 
de petri, sin alteraciones morfológicas macroscópicas considerables (Figura 5). 
En la figura 5 se evidencia un crecimiento de ésta cepa con tendencia 
ascendente durante los 10 días de incubación. Lo anterior mostró que éste 
microorganismo tolero y posiblemente asimilo el compuesto activo del Manzate 
(ETU), logrando un desarrollo mayor, por lo que fue seleccionado para los 
ensayos posteriores. 
 23 
 
 
Figura 4. Curvas de crecimiento en diámetro con respecto al inóculo de las cepas sembradas 
en medio PDA más 8,75pp m Manzate. 
 
Se realizó la prueba de Bartlett que confirmó la existencia de diferencias 
significativas entre los cinco microorganismo (F(2, 47)=29,347, p=,00000). El 
análisis de Post anova de TuCkey (tabla a del anexo A), evidenció que entre 
las cepas dos y cinco no existen diferencias significativas en el crecimiento, 
mientras que la cepa tres produjo un crecimiento significativamente mayor. 
 
 
 
 
 24 
 
a.Cepa 1. Morfoespecie 1 del género Penicillium. 
 
 
b.Cepa 2. Morfoespecie 2 del género Penicillium 
 
c.Cepa 3. Género Trichoderma. 
 
 
d.Cepa 4. Morfoespecie 1 género Paecilomyces 
 
e.Cepa 5. Morfoespecie 2 género Paecilomyces 
 
f.Cepas que toleraron al tratamiento con Manzate 
Figura 5. Vista macroscópica de las cepas aisladas tratadas con Manzate. En las imágenes a, b, 
c, d y e, se observan las cincos morfoespecies tratadas con Manzate. En cada imagen la caja de 
arriba corresponde al control en PDA y en las cajas de abajo a la izquierda y derecha el 
tratamiento con Manzate por duplicado. La imagen f muestra las morfoespecies dos, tres y 
cinco que toleraron los tratamientos. 
 
En las figuras 5a y 5d, se observan las cepas uno y cuatro respectivamente, en 
donde no hubo crecimiento de micelio ni esporulación. En contraste, la figura 
5b y 5e, muestra las dos cepas que exhibieron crecimiento micelial, pero que 
 25 
presentaron alteraciones considerables en sus características de textura, 
topografía y color. Adicionalmente, su crecimiento se restringió debido a la 
toxicidad inicial del fungicida, el cual se caracteriza por ser multisitio, es decir 
que tiene la capacidad de interrumpir diferentes puntos en el metabolismo 
microbiano de hongos. Sin embargo, gracias a que la versatilidad metabólica 
de estos dos hongos, lograron tolerar y crecer en este medio. 
 
Por otro lado, en la figura 5c, se observa un efecto adverso menor en la cepa 
tres con respecto al crecimiento, dado que las diferencias frente al control en 
PDA sin Mancozeb no fueron significativas. La textura y topografía no se 
afectaron considerablemente, mientras que la esporulación se inhibió en gran 
medida, observándose en su mayor parte un color blanquecino y ausencia total 
de coloración verde la cual si se observa en el control, y que es 
correspondiente a la alta esporulación. Lo anterior, confirma la habilidad de 
esta cepa (identificada como Trichoderma sp), para poder obtener carbono y 
energía de diferentes compuestos orgánicos, e incluso tóxicos, y la capacidad 
de tolerar ambientes adversos. 
 
Se puede observar en la figura 5f la diferencia significativa entre la cepa tres 
con respecto a la dos y cinco, por lo que se reitera el uso de la cepa tres en los 
bioensayos siguientes. 
 
 
 26 
6.1.2. Caracterización de la cepa seleccionada 
Se identificó la cepa con mayor resistencia como Trichoderma sp, éste 
microhongo es común en los suelos. Su micelio se extendió rápidamente sobre 
el medio PDA, presentó inicialmente un color blanco; posterior al quinto día se 
empezaron a formar bandas concéntricas de color verde oscuro con 
esporulación densa, alternadas con bandas blancas. El micelio es filamentoso, 
visto al microscópio, se observan hifas hialinas delgadas y septadas (Figura 
6a). Los conidióforos son ramificados, en forma de árbol diminuto, con ramas 
dispuestas de manera piramidal (Figura 6b). Al final de ellas, se ubican las 
fiálides, que se identifican por su forma de botella, y a partir de las cuales se da 
origen a los conidios (esporas asexuadas), que presentan una coloración 
verde, lisas y ligeramente ovoide o globosas (Figura 6c). 
 
 
(a) 
 
 
(b) 
 
 
(c) 
Figura 6. Vista microscópica de Trichoderma sp. (a) micelio vista microscópica (40x) 
Trichoderma sp. (b) conidióforo de Trichoderma (40x), se observan las fialides (1), conidios (2) 
y clamidosporas (3). (c) conidiosporas de trichoderma (100x). 
 
Adicionalmente se observaron clamidosporas en las cepas tratadas con 
Manzate y ETU, éstas se presentaron intercalares e incluso terminales. Las 
clamidosporas son estructuras de resistencia que toleran condiciones 
ambientales adversas (como es el caso de exposición a fungicidas y 
 27 
derivados), permitiendo que el microhongo perdure a través del tiempo. Las 
características mencionadas anteriormente confirman que el microhongo 
pertenece al género Trichoderma. 
 
6.1.3. Tolerancia a la ETU 
En la figura 7, se observa que los tratamientos con ETU (0ppm, 20ppm, 35ppm 
y 50ppm) mostraron un crecimiento significativamente mayor con respecto al 
medio Agar-Agar (Friedman χ2 = 14.88: p = .00496) y una tendencia similar 
entre ellos (p>0.05). 50ppm y 20ppm fueron muy similares hasta el tercer día 
presentándose el mayor crecimiento a 20ppm hasta los cinco días de 
incubación. Los tratamientos de 0ppm y 35ppm fueron muy similares hasta el 
tercer día, luego se disparó el crecimiento con ETU, y el crecimiento a 20ppm 
y 35ppm fue similar todo el tiempo, presentando a 20ppm una pendiente 
mayor, por lo tanto mayor velocidad de crecimiento. Es evidente que el 
microhongo utiliza como fuente nutritiva la ETU para su crecimiento. 
 
 
 
Figura 7. Tolerancia de trichoderma sp., a la ETU 
 28 
La exposición al contaminante afecta considerablemente las caracteristicas 
macroscópicas de Trichoderma.Como se observa en la figura 8a (caja a la 
derecha), el crecimiento de micelio en medio con ETU fue incipiente y la 
esporulación se inhibió en respuesta a uno de los métodos de acción del 
fungicida, mostrando ausencia total de coloración verdosa. El medio por su 
parte se torna amarillo comparado con el medio inicial ( figura 8a, izquierda), 
debido a la presencia de productos de degradación como urea y amoniaco 
resultantes del proceso metabólico. 
 
(a) 
 
(b) 
Figura 8. Alteraciones en las características macroscópicas de Trichoderma sp., y del medio de 
cultivo en función del tiempo de incubación en presencia de ETU., en el momento de 
inoculación, presenta un color blanco translúcido ((a) izquierda). Apariencia de medio despues 
de diez dias de incubación ((a) derecha). (b) Trichoderma sp., sembrado en agar papa 
zanahoria. 
 
Al inocular en medio Agar Papa Zanahoria el microhongo tratado con ETU, se 
pudo apreciar la alteración morfológica e inhibición en producción de esporas 
causada por la exposición al contaminante ( figura 8b), el micelio no fue 
abundante, presentó una elevación alta, ausencia de esporas y coloración 
verdosa. 
 
 29 
Sin embargo, es clara la versatilidad de Trichoderma sp al ser expuesto a 
condiciones extremas, debido a que los mecanismos de acción de este 
compuestoacitvo están involucrados en todos los estados de desarrollo del 
hongo, desde la espora hasta el micelio, inhibiendo la esporulación y la 
germinación. Gracias a su variedad enzimática y generación de mecanismos 
para su supervivencia, Trichoderma cuenta con la capacidad de tolerar y 
aprovechar la ETU para su desarrollo a pesar de ser un compuesto tan 
agresivo, pudiendo así ser utilizado para acelarar el proceso de degradación 
del mismo. 
 
6.2. CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA 
En la figura 10, se observa que Trichoderma presentó un crecimiento 
ascendente en los tratamientos con 0ppm a 600ppm de ETU; a partir de 
concentraciones de 700ppm el peso en biomasa decreció considerablemente. 
Se encontró que éstas diferencias de crecimiento fueron significativas entre las 
concentraciones de ETU menores a 600ppm y mayores a 700ppm (H (8, N= 
27) =20.58201 p=0.0083), indicando que el microorganismo no tolera de igual 
manera tan altas concentraciones del contaminante. Adicionalmente a 
concentraciones mayores de 700ppm no se presenta diferencias significativas 
con respecto al control que no contiene ETU. 
 
 30 
 
Figura 9. Curva de crecimiento para determinar la concentración mínima inhibitoria de 
Trichoderma sp. Se emplearon concentraciones desde 0ppm hasta 1600ppm de ETU diluido en 
medio de sales basales líquido (Caldo Czapeck Dox). 
 
Se ha reportado que el Manzate, a una concentración de 1000ppm inhibe el 
100% de crecimiento micelial en hongos como Colletotrichum gloeosporioides 
(Rondon, et al. 2006). Trichoderma exhibe crecimiento micelial a 
concentraciones mayores de 1000ppm de ETU en solución acuosa (figura 9), 
componente activo del Manzate. A concentraciones mayores de 800ppm, la 
ETU afecta la capacidad de obtención de nutrientes de Trichoderma 
considerablemente, produciendo un efecto de mayor de inhibición del 
crecimiento sin embargo, sigue exhibiendo crecimiento; es probable que la 
generación de estructuras de resistencia (clamidosporas) en los primeros días 
le permitan soportar el grado de toxicidad y posterior a una degradación 
química en solución acuosa de ETU, germine aprovechando los productos 
secundarios de degradación (etilenourea, tiourea, amoniaco). 
 
Podemos observar en la figura 9 que a la concentración de 200ppm de ETU, 
Trichoderma aumento considerablemente su biomasa con respecto al 
 31 
crecimiento dado en el tratamiento sin ETU. A 400ppm la biomasa aumentó 
levemente y el pH paso de 6,0 unidades a 6,3, mientras que a 600ppm se 
observó el mayor crecimiento y el pH bajo ligeramente a 6,2 unidades. A 
800ppm el crecimiento decrece drásticamente, manteniéndose constante hasta 
1600ppm, el pH continuó bajando levemente, lo cual indica que el 
contaminante está siendo metabolizado y sus subproductos logran acidificar el 
medio. 
 
 Debido a que la solubilidad de la ETU se ve afectada después de los 
1600ppm, no fue posible continuar con el bioensayo, haciendo difícil la 
determinación de la concentración en la cual Trichoderma no presentara 
crecimiento. Sin embargo, se ratifica la habilidad de dicho microorganismo 
para tolerar ambientes que presenten condiciones de alto nivel de toxicidad o 
contaminados, demostrando una vez más su potencial uso en el campo de 
Bioremediación. 
 
6.3. CURVA DE CRECIMIENTO 
Con base en el resultado del bioensayo de CMI, se seleccionó la concentración 
de 600ppm para realizar la curva de crecimiento, ya que a dicha concentración 
se observó que el microhongo presentó mayor biomasa al finalizar el tiempo 
de incubación. 
En la figura 10 se observa que el comportamiento exhibido por el cultivo en la 
curva de crecimiento mostró una etapa de crecimiento exponencial hasta las 48 
horas, luego de las cuales se observa una fase estacionaria que va de las 72 
horas hastaa las 96 horas, donde nuevamente se da crecimiento con tendencia 
 32 
logarítmica, este comportamiento puede deberse a los productos secundarios 
resultantes de la degradación química y biológica como la etiourea ó amoniaco 
que puede afectar, ya sea inhibiendo o estimulando el crecimiento. 
 
 
Figura 10. Curva de crecimiento de Trichoderma sp., inoculado en Caldo Czapeck Dox con una 
concentración de 600ppm de etu y un control sin ETU. 
 
Por otro lado, el control a las 24 horas presentó un crecimiento mayor que el 
tratamiento, el crecimiento fue tan rápido que agotó los nutrientes, afectando el 
crecimiento, el bajo crecimiento en el tratamiento con ETU indica que 
inicialmente la toxicidad afecta el crecimiento micelial. Pasadas 48 horas, el 
control muestra un declive fuerte en la biomasa que tiende a estabilizarse luego 
de las 96 horas, posiblemente debido al agotamiento del sustrato, a que éste 
deja de ser utilizable ó a la acumulación de productos metabólicos 
(producidos por la biomasa) que alcanza niveles inhibidores. El crecimiento al 
finalizar el tiempo de incubación se mantuvo alrededor de los siete gramos en 
el tratamiento con ETU, y de solo dos gramos en el control. 
 
 33 
Al iniciar el bioensayo el control muestra mayor crecimiento que el tratamiento 
con ETU, sin embargo al final del tratamiento éste último exhibió mayor 
crecimiento que el control, se infiere que el microorganismo podría reponerse a 
la toxicidad del compuesto y entrar en una fase de síntesis enzimática inicial 
que le permite posteriormente utilizar la ETU para el crecimiento celular, 
obteniéndose un crecimiento lento y sostenido, lo que le confiere 
características interesantes para la degradación de contaminantes tóxicos. 
Como ya mencionamos, inicialmente el microhongo puede generar 
clamidosporas para resistir la toxicidad. Luego de un período en el cual la ETU 
puede haberse degradado y disminuido su concentración en el medio, es 
posible que Trichoderma utilice dichos compuestos de degradación y empiece 
a crecer con mayor facilidad asimilando los componentes. 
 
Considerando que el ensayo a 600ppm mostró un efecto negativo inicial en el 
crecimiento del microhongo, se seleccionó una concentración de 170ppm para 
realizar el bioensayo de degradación de ETU. 
 
Es necesario aclarar que el método de la CMI para hongos debe utilizarse con 
cautela, debido a que el peso de biomasa se determina al final del tiempo de 
incubación, y no se tienen en cuenta los efectos de inhibición del crecimiento 
en el tiempo inicial, ejercida por la toxicidad del compuesto. 
 
 
 
 
 34 
6.4. DEGRADACIÓN DE ETILENTIOUREA 
 
En la figura 11 se observa la disminución de la concentración de ETU con 
respecto al tiempo por medio de degradación química y por degradación 
biológica. Las concentraciones de ETU en el control químico se mantienen por 
encima de las concentraciones en los tratamientos con el microhongo, lo cual 
indica que Trichoderma sp., está logrando que la ETU se pueda degradar más 
rápido en comparación con la degradación química. 
 
Como no se observo normalidad (Shapiro-Wilk= 0.921; p= 0.0016), pero sí 
homogeneidad de varianzas (Bartlett: Chi cuadrado= 14.13, p= 0.226), se 
realizó una Anova de dos vías (medidas repetidas), donde no se encontraron 
diferencias significativas entre los tratamientos (F(1, 21)=1.9381, p=0.17844). 
sin embargo, entre los datos de días si se encontraron diferencias significativas 
(F(1, 6)=112.84, p<0.001). 
 
Figura 11. Curva de degradación de ETU a través del tiempo. 
 35 
 
Por degradación química se obtuvo un porcentaje de degradación de 62,2% a 
los 6 días, y por degradación biológica se logro en el mismo tiempo el 67,8% 
del total de ETU presente en el medio (tabla 1). Lo anterior manifiesta que la 
presencia de Tichoderma sp., favorece el proceso de degradación de ETU, 
transformandolo más rápidamente. 
 
 
Tabla 1. Porcentajes de degradación de ETU por factores bióticos y abióticos. 
Parámetro 
% de Degradación 
Día 1 Día 6 
 
Degradación biológica40,2% 67,8% 
Degradación química (ETU sin microorganismos) 
 
31,5% 62,2% 
 
Sin embargo, el análisis estadístico realizado por Anova de dos vías indicó que 
la diferencia de degradación entre tratamientos no fue significativa 
(F(1, 21)=1.9381, p=0.17844). No obstante, es evidente la potencial influencia 
de Trichoderma en la aceleración del proceso de degradación de ETU, que se 
afecta por la alta concentración de la sustancia tóxica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 36 
7. CONCLUSIONES 
 
Trichoderma sp., fue seleccionado entre cinco cepas evaluadas para realizar 
bioensayos de degradación de ETU, por tolerar mayores concentraciones del 
fungicida Mancozeb y no exhibir en medio sólido alteraciones considerables 
de morfología ni de velocidad de crecimiento. 
 
Trichodema sp mostró alta tolerancia a la ETU a diferentes concentraciones, 
en medio sólido se observó un excelente crecimiento a 20ppm y 50ppm muy 
superior a su crecimiento sin ETU (p=0,0496). A concentraciones mayores de 
600ppm en medio líquido el crecimiento se ve afectado considerablemente 
debido a la alta toxicidad del medio. Sin embargo este microhongo toleró 
concentraciones de ETU superiores a 1000ppm. 
 
Trichoderma sp., posee capacidades metabólicas para tolerar, asimilar y 
degradar altas concentraciones de Etilentiourea, posibilitando la eliminación 
del contaminante por degradación biológica más rápido que por degradación 
química a la concentración de 170ppm. Estas características sumadas a la 
versatilidad metabólica hacen de éste microhongo un elemento importante para 
estudios aplicados en Bioremediación en agua y suelos contaminados, que 
requieren con urgencia empezar procesos de descontaminación. 
 
Se requiere un mayor estudio para identificar aquellos mecanismos fisiológicos, 
bioquímicos y moleculares que tienen las especies del género Trichoderma 
para tolerar, acumular, transformar o mineralizar el contaminante. Es 
 37 
importante realizar validaciones de la tolerancia y capacidad de degradación de 
ETU en condiciones in vitro utilizando suelos contaminados de manera natural 
o artificial. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 38 
8. REFERENCIAS 
 
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 41 
10. ANEXO A. TABLAS DE POST-ANOVAS 
 
Tabla a. Post Anova de TuCkey. 
CEPA 2 0,000127 0,634405 
CEPA 3 0,000127 0,000127 
CEPA 5 0,634405 0,000127 
 
 
Tabla b. Post Anova de Dunnett. MS = ,06185, df = 16,000 
Concentración 
ETU (ppm) 
AGAR 
AGAR 
0 ppm 
ETU 
0 0,003217 
20 0,000011 0,011838 
35 0,000013 0,016544 
50 0,000024 0,052488 
 
 
Tabla c. Post anova comparaciones por pareja de Mann-Whitney. 
[ETU] ppm 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000 0 0,026953333 0,02695 0,026953 0,063467 0,02695 0,333333 0,333333333 0,22083 
200 0 0,33333 0,127567 0,026953 0,22083 0,026953 0,026953333 0,06347 
400 0 0,127567 0,026953 0,22083 0,026953 0,026953333 0,02695 
600 0 0,026953 0,06347 0,026953 0,026953333 0,02695 
800 0 0,02695 0,026953 0,063466667 0,22083 
1000 0 0,026953 0,026953333 0,02695 
1200 0 0,333333333 0,22083 
1400 0 0,22083 
1600 0 
 
 
 
 
 
 
 42 
11. ANEXO C. DIAGRAMA DE FLUJO METODOLOGÍA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Reactivación de cepas aisladas de 
suelos de cultivo tratado con 
Cimoxanil. 
Realización de prueba de tolerancia 
al Mancozeb en caja con PDA 
Selección e identificación del microhongo que exhibió 
mayor tolerancia, correspondiente a Trichoderma sp. 
Realización de prueba de tolerancia de 
Trichoderma sp., a la ETU en caja con PDA 
Determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI) en 
caldo Czapeck Dox (CCD) con ETU, con el fin de seleccionar 
concentración adecuada usada en los siguientes bioensayos. 
Determinación de la curva de crecimiento de 
Trichoderma sp., en CCD con 600ppm de ETU, 
concentración recomendada por la CMI. 
Determinación del porcentaje de degradación de ETU por vía 
química y biológica empleando el método analítico de 
espectrofotometría UV/VIS y una concentración inicial de 170ppm.