Taller-3-Biologia-Celular-2019

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Taller 3 Biología Celular 
1° Unidad Académica de Biología Celular, Histología, Embriología y Genética 
FMED, UBA 
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TALLER 3 DE BIOLOGÍA CELULAR 
Guía de actividades 
 
Introducción: 
Diversas técnicas de investigación se utilizan para evaluar experimentalmente algunos indicadores 
de la expresión génica de células y tejidos, permitiendo determinar la abundancia y localización de 
transcriptos y proteínas de interés. 
Estos métodos son también utilizados en el ámbito clínico ya que pueden aportar información 
relevante sobre procesos patológicos. Como ejemplo de esto último, en este Taller se analizará 
una aplicación médica de la técnica RT-qPCR (PCR cuantitativa con retrotranscripción). Los 
fundamentos de la misma son los procesos de replicación de los ácidos nucleicos. 
 
 
 
Técnica de RT-qPCR (PCR cuantitativa con retrotranscripción). 
La técnica de PCR cuantitativa con retrotranscripción (RT-qPCR) permite cuantificar moléculas de 
ARN. Usualmente, la técnica comienza con la extracción de ARN de una muestra y su 
retrotranscripción (transcripción inversa) a moléculas de ADN complementario (cADN). La 
retrotranscipción se realiza frecuentemente utilizando una enzima recombinante (producida por 
ingeniería genética) de origen viral, como la retrotranscriptasa MMLV (del Virus Moloney de 
Leucemia Murina). 
¿Qué significa que una polimerasa tenga actividad de ‘transcriptasa inversa’ o 
‘retrotranscriptasa’? 
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 Complete el siguiente cuadro: 
 
 
Enzima Origen Función ¿Posee actividad de 
transcriptasa 
reversa? (SI/NO) 
¿Puede polimerizar 
de novo? (SI/NO) 
ADN polimerasa epsilon humano 
Telomerasa humano 
Primasa humano 
ARN polimerasa II humano 
Retrotranscriptasa VIH-1 
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Para contestar las siguientes preguntas, le sugerimos que lea previamente los fundamentos de la 
técnica de RT-qPCR de la bibliografía sugerida (qPCR es también llamada PCR en tiempo real en 
diversas fuentes bibliográficas). 
 
 Explique por qué la RT-qPCR puede dar información cuantitativa acerca de la abundancia o 
nivel de expresión de un transcripto (ARN). ¿Qué relación tiene la capacidad cuantitativa de 
esta técnica con la medición de la aparición de productos “en tiempo real”? 
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Aplicaciones en medicina: Determinación de la carga viral de VIH-1 en muestras de plasma 
La infección con el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es una epidemia mundial 
que afecta aproximadamente a 37 millones de personas1 
La determinación de la carga viral VIH-1 es casi imprescindible para el manejo de los pacientes 
infectados por este virus, sobre todo, por su utilidad como marcador de eficiencia del tratamiento 
antirretroviral. En este momento, la metodología empleada en la mayoría de los servicios de 
microbiología clínica es la PCR cuantitativa. Esta metodología presenta como ventajas respecto a 
otras metodologías utilizadas anteriormente: un mayor rango de cuantificación, mayor 
sensibilidad y que los resultados se pueden obtener en un período muy corto. 
El genoma del VIH está formado por una molécula de ARN que mide aproximadamente 9,8 Kb y 
consta de 3 genes esenciales: gag, pol y env. Cuando infecta una célula humana (CD4+), el ARN es 
inmediatamente transcripto por la acción de una ADN-polimerasa-ARN dependiente, comúnmente 
conocida como retrotranscriptasa o transcriptasa inversa, generándose un ADN de doble hebra 
que ingresa al núcleo y que por la acción de otra enzima viral, la integrasa, se integra de manera 
crónica en el genoma humano. El provirus integrado sirve como molde para la transcripción de 
genes virales por ARN polimerasas endógenas, generando copias de ARN de 
VIH-1. 
La cuantificación del ARN del VIH-1 es un reflejo de la replicación viral activa y es esencial en 
algunas situaciones clínicas de la infección por este virus. Las indicaciones principales son las 
siguientes: 
 
A- La carga viral es un marcador predictivo del tiempo de progresión de los síntomas del síndrome 
de inmunodeficiencia adquidida (SIDA) independientemente del número de linfocitos CD4+. 
 
 
1 Estadística correspondiente al año 2016, Organización Mundial de la Salud, 
http://www.who.int/hiv/data/en/ 
http://www.who.int/hiv/data/en/
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B- La cuantificación de la carga viral de VIH-1 debe ser realizada antes de iniciar un tratamiento 
con antirretrovirales para medir la eficacia o respuesta al tratamiento y en el caso de que se 
sustituya o añada algún fármaco, bien por efectos secundarios o por sospecha de fracaso. 
C-Hay situaciones excepcionales en las que la carga viral es muy útil para el diagnóstico o 
confirmación de infección por VIH-1. Por ejemplo, en el diagnóstico de infección neonatal (la 
determinación de anticuerpos no es útil) e incluso cuando se sospecha infección aguda (reduce el 
período ventana). 
 
Los resultados de la medición de carga viral suelen expresarse en número de copias/ml de plasma. 
Se muestran tres ejemplos: 
 
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La técnica de RT-qPCR también es muy utilizada para cuantificar la 
presencia de mARNs específicos en células y tejidos. Constituye, por ello, 
una técnica central para cuantificar la expresión de genes y estudiar su 
regulación. 
1.4- Durante una determinación de carga viral de VIH-1 en muestras de plasma de distintos 
pacientes por medio de la técnica de RT-qPCR, se observan las siguientes curvas que muestran la 
evolución de la fluorescencia (proporcional a la amplificación del cADN) en función de los ciclos de 
amplificación. Interprete las curvas y determine –en orden creciente- la abundancia de copias de 
ARN de VIH-1 en cada una de las muestras (P,Q,R,S y T). Explique el proceso de razonamiento que 
utilizó para interpretar el gráfico. 
 
 
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Ejercicios tomados de parciales de años anteriores 
CASO: 
La testosterona, la progesterona y los estrógenos son hormonas esteroideas producidas 
principalmente en las gónadas (ovario, testículo). Éstas están implicadas en diferentes funciones al 
unirse a sus receptores en los tejidos diana o blanco. 
 
1- Hay descriptos diferentes formas de proteínas que actúan como receptores estrogénicos (ER); 
ejemplo ERα y ERβ; cada uno codificado por genes distintos y se expresan en tejidos distintos, 
aunque el ligando es el mismo. En las células endometriales se observa la presencia de receptores 
ERα. En células del pulmón se observa la presencia de receptores ERβ. Esto ejemplifica los 
siguientes mecanismos celulares-moleculares involucrados: 
a) Corte-empalme alternativo (Splicing alternativo) en cada tejido 
b) Recombinación génica en cada tejido 
c) Expresión génica diferencial en cada tejido 
d) Glicosilación diferencial de las proteínas receptoras en cada tejido 
 
2- La expresión del receptor ERα puede estar reguladapor la acción de diferentes microARN, entre 
ellos microARN-206. Esto podría producirse en base al siguiente mecanismo: 
a) El microARN se une al ARN mensajero disminuyendo su vida media. 
b) El microARN se une al ARN mensajero aumentando su traducción. 
c) El microARN favorece la ubiquitinización del ARN mensajero. 
d) El microARN se une al ARN mensajero impidiendo su exportación al citosol. 
 
3- Luego de la unión ligando-receptor de estrógenos, se pueden observar diferentes eventos que 
median la respuesta celular; por ejemplo, la liberación de una proteína específica de una 
chaperona y la posterior translocación de la proteína específica desde el citosol al núcleo (acción 
en nucleoplasma), en estos eventos se observa que: 
a) La proteína se mantenía en el citosol aunque su acción la cumple en el nucleoplasma porque la 
chaperona ocultaba el sitio señal de localización nuclear (NSL) de la proteína 
b) La proteína se transloca al núcleo, aunque no tenga en su secuencia la señal de localización 
nuclear (NSL) porque la liberación de la chaperona es suficiente para la translocación 
c) El proceso de translocación de la proteína al núcleo es mediado por vesículas revestidas de 
clatrina y direccionadas por el complejo multiproteico SNARE-Rab GTPasa nucleares 
d) El proceso de translocación de la proteína al núcleo es mediado por importinas que son 
proteínas carrier de transmembrana de la envoltura nuclear 
 
4- Una vez en el nucleoplasma, esta proteína específica permite el reclutamiento de la enzima 
Histona acetil transferasa (HAT) que participará del proceso de remodelación de la cromatina en 
ciertos dominios génicos, usted esperaría que esto produzca: 
a) Favorecimiento de la trascripción al posibilitar la descondensación cromatínica 
b) Podría interpretarse que la acción de esta proteína es reclutar correpresores 
c) Desfavorecimiento de la transcripción al posibilitar la condensación cromatínica 
d) El agregado de grupos acetilos a las histonas mediados por la HAT aumenta la afinidad de las 
Histonas por el ADN 
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PREGUNTA SUELTA: 
La localización subcelular de una proteína puede determinarse con la tecnología de ADN 
recombinante, mediante: 
a) La expresión de un ARN de interferencia del transcripto de esa proteína. 
b) La amplificación del gen de la proteína mediante PCR. 
c) La utilización de vectores virales para regular negativamente la expresión de la proteína. 
d): La expresión de una proteína de fusión con una proteína fluorescente. 
 
 
 Preguntas tomadas de finales de años anteriores 
 
1. Explique qué son los microARNs y qué funciones pueden cumplir. 
 
2. a) Explique qué relación funcional existe entre la desacetilación y la metilación de las 
histonas, y los factores de transcripción. b) Describa la diferencia entre los factores de 
transcripción basales y específicos.