tesis-n1191-Schwarcz

Vista previa del material en texto

Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. 
Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : digital@bl.fcen.uba.ar
Tesis de Posgrado
Purificación y propiedades de laPurificación y propiedades de la
NAD aldehído deshidrogenasa deNAD aldehído deshidrogenasa de
levadura de panaderíalevadura de panadería
(Saccharomyces cerevisiae)(Saccharomyces cerevisiae)
Schwarcz, Martha Norma
1964
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias
Químicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca
Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser
acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico
Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding
citation acknowledging the source.
Cita tipo APA:
Schwarcz, Martha Norma. (1964). Purificación y propiedades de la NAD aldehído
deshidrogenasa de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae). Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1191_Schwarcz.pdf
Cita tipo Chicago:
Schwarcz, Martha Norma. "Purificación y propiedades de la NAD aldehído deshidrogenasa de
levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae)". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1964.
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1191_Schwarcz.pdf
http://digital.bl.fcen.uba.ar
http://digital.bl.fcen.uba.ar
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1191_Schwarcz.pdf
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1191_Schwarcz.pdf
mailto:digital@bl.fcen.uba.ar
EQ“\
_;7 ¿ga k¿8; I:,-Á_u,..;
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES .
' FACULTADpá CÍÉÉCIAS'EXACTñS Y NATÚRALES
W
PUBIFICACION Y PROPIEDADES DE LA NAD ALDÉHIDO DESÉIDROGENÁSA DE
LEVADUBADE PANADBRIA(gggcharomyées'cereVisiag) .Ïa
. j;.ü. I, ‘
_ H
MARTHA NORMA. S_CT¡ARCZ
-. l"
".3; " r
. ‘ '. Í.
¿74M mx 11r- 1-»
Resúmenpresentado pafá optar al títuln'de Doctora en Quínápa
RESUMEN
Purificggión de la enzigg.
Obtención del polvo cetónico gg levadura: de acuerdo a ln
técnica modificada por Stoppani y Milstein (8). Se utiliza leve­
dura de panadería (Sachnromyces Cerevisiee) producto comercial,
prensado y libre de fécula.
Extracciqnudg_la enzima: con solución de fosfato bipotási­
co 0.092 M, en frio, con agitación ocasional durante 5 dias, man­
teniendo el pH siempre superior a 6.6 mediante el agregado de
amoniaco concentrado.
ggggulgción pqg_gglor de proteina inactiva: se ajusta el
pHdel sobrenadante de le extracción a 6.3 con ácido cítrico
1 My se calienta a 55°C durante 15 minutos; se enfría rápidamen­
te y se centrifuga.
Precipitación_ágidg¿ sobrenadante de la etapa anterior se
le baja el pH a 4.5 mediante el agreg do lento de ácido cítrico
1 M, agitando continuamente y en frio. Actividad queda en el
precipitado que se redisuelve en solución de fosfato bipotásico
0.025 M pH 6.3.
Fraccionggiento salido con sulfato de amonio: se hace me—
diante el agregado de solución saturada de sulfato de amonio.
El grueso de la actividad cae en el corte entre 45 y 68%de se­
turación. Precipitedo se redisuelve en solución amortiguadora
de fosfato de potasio 0.5 M, cloruro de potasio 0.5 M, EDTAl
mM, pH 7.0.
Filtrggióu a través de gel de dextrgggt Sephedex G-200
en una columna de 1.5 cm. de diámetro y 18 cm de largo equili­
brada con amortiguador de fosfato de potasio 0.5 M, cloruro de
potasio 0.5 M, EDTAl mM, pH 7.0. Se eluye con el mismo buffer.
Fracciones de mayoractividad especifica se recronatografian
por la misma columna en iguales condiciones.
Propiedadegpde la enzigg.
1.- Eggggifieidgd de sustrato: La enzima presenta una es­
pecificidad muyamplia hacia sus sustratos; estos pueden ser a1­
dehidos alifáticos o aroméfiicos. Entre los primeros son oxidar
dos el glicolaldehido, propionaldehido, butiraldehido y oroton­
aldehido; entre los segundos el benzaldehido y anisaldehido
(p-metoxibeqaldehido). Nose oxidan el gliceraldehido, p-dimetil­
aminobenzaldehidoni el salicilaldehido.
Excepto el gliceraldehido, todos los demás aldehidos ensa­
yados, aún los que no tienen actividad, se unen a la enzima dar
do que son inhibidores del sistema enzimática cuandoéste oxida
al acetaldehido.
2.- Especificidad de coenzigg¿ la aldehido deshidrogenasa
además del NAD reduce al NADP, deamNAD, APADy APdeamAD. El
deamNADes el más activo, la velocidad de la reacción es del
88%respecto a.la del testigo con NAD,la del NADPes del 33%,
APdeamAD 18% y APAD 10%. PyAlAD y PyAldeamAD no son reducidos
por el sistema enzinático si bien pueden ser reducidos quimica­
mente o por acción de otras íeshidrogenasas.
3.- Necesidad de aptivadores de la enzigg: la NADaldehido
deshidrogenasa necesita cisteina para alcanzar el máximode su
actividad, en ausencia de la misma, la velocidad de la reacción
es sólo del 14 al 16%de la correspondiente a la presencia de
eisteina l mM.Si en esas condiciones se agrega al sistema enzi­
mático aquellos complejantes de metales que en presencia de cis­
teina inhiben la acción Catalitica (OP, HOQy DDC)se ve que en
ausencia de la mismala activan. La adición de cisteina l mMa
una preparación parcialmente activada por OP aumenta ligeramen­
te la actividad, pero no tanto comocuando actúa sola. La acti­
vación de la enzima en función de la concentración de OPllega
a un máximo, concentraciones de 0P por encima de ese valor
(1 mM)producen inhibición.
El cupferrón que no es inhibidor tampoco produce activación.
Cuando se cambia el aceptador de hidrógeno por análogos del NAD.
se obtiene que la velocidad inicial de la reacción en ausencia
de activador depende de la coenzima presente en el sistema enzi­
mática , así con APADla reacción no se produce, con NADy AP­
deam ADla velocidad de la reacción enzimática es 9 y con
deanNADes de 18. Los complejantee no tienen el mismo efecto ac­
tivador (comparadocon la cisteina) cuando los sistemas enzimá­
tieos a los cuales se agregen tienen distintas coenzimasasí,
con HOQse tienen las siguientes velocidades: 83 (NAD),72 (de­
amNAD), 87 (AIPdeamASD) y 67 (APAD).
El estudio de la cinética de activación indica que la OP
actúa sobre el KNAD,aumentando la asociación de la coenzima
a la enzima.
4.- inhibidores de la reacción de la NADaldehido deshidro­
genasa de levadura: La enzima es inhibida por distintas clases
de compuestos, los que se pueden agrupar en: I) coenzima, aná­
logos y derivados del mismo, II) sustratos y análogos del sus­
trato y III) compuestoscuya estructura no está relacinada ni
con el sustrato ni con la coenzimu, este grupo comprende: a)
sustancias orgánicas e inorgánicas capaces de formar complejos
con metales, b) hidroxilamina, c) reactivos de tioles.
I) Análogos del NAD.derivados piridinicos y adenílicos:
los componentes de la molécula iel NAD,adenina, nicotinamida
y sus derivados, asi como los análogos del NAD( ¿PAD, APdean­
AD, NABP)inhiben la reacción enzimática. Se comportan como inhi­
bidores competitivos la adenina, nicotinamida, piridina, AMP,
ADP, ATP, PyAlAD y PyAldeamAD. NMN,pirofosfato y fosfato no
modifican la velociiad de la reacción enzimática.
II) Inhibición por sustratogy sustancias análogas al sus­
trato: los aldehidos oxidados por el sistema enzimático (gli­
colaldehido, benzaldehido y anisaldehido) son inhibidores del
mismocuando se los agrega junto con acetaldehido. El salieil­
aldehido y el p-dimetilaminobenzaldehido.que no son oxidadoe
por la enzima.son inhibidores de la misma, especialmente el
último de los nombrados, que cuando se agrega concentración i­
gual a la del acetaldehido inhibe el 100%de la actividad. En
cambio el glicerqldehido, que no es oxidado, tampoco es un in­hibidor de la enzima. El estudio cinético de la acción de es­
tos aldehidos sobre el sistema enzimático, en presencia de a­
cetaldehido, no revela un comportamiento definido.
III) Compuestoscuya estructura no está relacionada ni
con las coenzimgí ni con el sustrato:
a) Sustancias comclejantes de metales: la inhibición por agen­
tes orgánicos e inorgánicos capaces de formar complejos gcn¿y
metales indica que hay un metal involucrado en la reacción cata­
lizada por la enzima. Son inhibidores la l,lO-fenantrolina, la
8-hidroxiquinolina y el dietil-ditiocarbamato; el cupferrón, el
dqrí’-dipiridilo y la azida sódica tienen muypoca o ninguna
acción.
Estudios detallados de la influencia de la OPsobre la reac­
ción de la NADaldehido deshidrogenasa muestran que esta gustan­
cia produce dos tipos de inhibición, una instantánea y reversi­
ble y otra dependiente del tiempo e irreversible. Tambiénel di­
etilditiocurbamato produce una inibición irreversible dependien­
te del tiempo. No se obserVa lo mismo con el zincón.
La inhibición irreversible por OPdepende del tiempo de in­
cubación, del grado de pureza de la preparación enzimática. cuan
to más pura más sensible a la acción del inhibidor y de la tem­
peratura de incubación, aumenta con la misma.
Estudios de protección por distintas sustancias de la inhi­
bición irreversible por OPconducen a los siguientes resultados;
la cisteinc. dietilditiocarbamato y 8-hidroxiquinolino previenen
completamente la acción de la OP; cianuro y EDTAson también
fuertemente protectores. De la coenzima. análogos de la misma
y mononucleótidos que la componen sólo el PyAlADy el Pynlicxn—
ADactúan como protectores, los demás o bien potencian la acción
de la 0P como el NAD. NADP, ADP y APADo no ofrecen ninguna
acción comola adenina. El pirofosfato es ligeramente protector.
El único catión que protege totalmente la enzima de la acción
de la 0P es el Zn++3el K+; Rb+ y Sr*+ son algo protectores. El
acetaldehido aumenta lige3amente el efecto inhibidor de la 0P.
Estudios oinóticos de la acción de la 0P, HOQy DDCsobre
los complejos enzima-coenzima y enzima-sustrato muestran que la
inhibición instantánea es competitiva con el NADy mixta del
tipo competitivo-no competitivo con el acetaldehido. La ciné­
tica es consistente con la suposición de que se forma un com­
plejo entre el metal unido a la enzima y la OP en el que ambos
estín en relación 1:1.
b) Mxilnmina: la inhibición de lo. NADaldehido deshi­
drogenasa por hidroxilamina depende de qué análogo del NAD
actúa como coenzima del sistema enzimática, es del 90%con el
APADo APdeamADpara una concentración de hidroxilamina de 10
mm. En iguales condiciones con el NADo deamNADla inhibición
obserVada es sólo del 15%.
E1 estudio cinética indica que la hidroxilanino presenta
una inhibición incompetitIVa respecto de las coenzimas mientras
que para el acetaldehido si la cocnzima es NADo deamNADse ob­
serva una inhibición mixta del tipo competitivo-no competitivo.
casi purzuc¡üe competitivo. mientras que cuando el sistema enzi­
mática actúa con APADla inhibición es del tipo competitivo.
c) Beastivos de tioles: en un trabajo anterior Stoppani y
Milstein encontraron que la NADaldehido deshidrogenasa es sen­
sible a los reactivos de tioles (72). Se estudió el comportamien­
to de los complejnntes de metales frente a la acción del o-iodo­
sobenzoato y del óxido de melarsen: tanto la OP como le HOQauf
mentan ln sensibilidad de la enzima hacia los reactivos de tio­
les.
También se vió qué efecto tienen los análogos y componen­
tes del NADcuando se los incuba en presencia de los mismos; el
NAD, NADP, PyAlAD, PyAldennAD y deamNADactúan protegiendo a la
enzima. E1 ABADy APdeanAD, sustancias que se sabe que se combi­
nan con la enzima, no sólo no la protegen sino que aumentan la
inhibición por los reactivos de tiolea utilizados. Los uononu­
cleótidos adenilicos AMP.ADPy ATPson protectores, aunque no
tanto comoel dinucleótido; el piridinico es muchomenosefi­
082.
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
.PURIFICACION Y PROPlEDADES DE LA NAD ALDEHIDO DESHIDROGENASA DE
LEVADURA DE PANADERIA ( Saccharomyces cerevisiae )
MARTHA NORMA SCHWARCZ
75m; 1 1 8-1
Tesis presentada para optar al título de Doctora en Química
1964
'El presente trabajo se realizó en el Ins­
tituto de QuimicaBiológica de la Facultad de
Ciencias Médicas de la Universidad de Buenos
Aires bajo la dirección del Dr Andrés O. M.
Stoppani quien propuso el tema y a quien es­
toy profundamente agradecida por su apoyo y
dedicación en la conducción del mismo.
Al Consejo Nacional de Investigaciones
Cientificas y Técnicas por las becas otorga­
das durante los años 1958 y 1959.
Al Dr T. R. Selix del Instituto Nacional
de Microbiologia y al Dr H. Isnardi de la
Comisionde Investigaciones Cientificas de la
Provincia de Buenos Aires, por haber autori­
zado al Sr. T. Giovambatista, quienes reali­
zaron los estudios de ultracentrifugación.
A las señoritas Lilia B. Viñas y Maria
Inés Tassara y al Sr Alberto Schwarcz la ayu­
da prestada en la preparación de los origina­
les.
CAPITULO I
INTRODUCCION
Las aldehido deshidrogenasas catalizan un conjunto de reac­
ciones que se pueden resumir en la siguiente ecuación:
n-cso + PN++ AH R-COA + PNH + H+
en el cual PNrepresenta al piridin nucleótido.
De acuerdo a la naturaleza de A se puede dividir a estas
enzimas en tres grupos; I) A = OH, es decir el término AHrepre­
senta H20. Históricamente la primera aldehido deshidrogenasa ca­
racterizada es la aislada por Racker, a partir de higado de va­
cuno (4); esta enzima unida al NAD_oxidauna serie de aldehidos
alifáticos y aromáticos. el sistema no es activo con NADP,es es­
timulado por mercaptanes y EDTA.De higado de conejo se han ais­
lado dos aldehido deshidrogenasas que se asemejan por su amplia
especificidad de sustrato, pero se diferencian en su sensibili­
dad hacia los esteroides, solubilidad en soluciones salinas y
efecto que sobre ellas produce el ión magnesio (91). A partir
de levadura se han preparado dos aldehidos deshidrogenasas de
propiedades bien diferenciadas; una activada por potasio o rubi­
dio (2) puede actuar ya sea con NAD como con NADP, aunque con
esta última la reacción es muchomás lenta, ademásnecesita cis­
teina para desarrollar totalmente su actividad; la otra activada
por magnesio o calcio (3) es especifica para el NADP.También se
incluyen en esta categoria a las semialdehido deshidrogenasas,
entre las queise.encuentran las succinico semialdehido deshidro­
genasas, enzimas especificas de la oxidación del semialdehido
succinico a ácido succinico, aisladas a partir de bacterias
(93) o de cerebro de mono (93), y la malónico semialdehido CoA
deshidrogenasa presente en el Clostridium kluyveri. La aldehido
deshidrogenasa aislada de Pseudomonasfluorescens (92) tiene
una amplia especificidad de sustrato, requiere arsenato o fos­
fato para su actividad asi comotambién un mercaptan; el pro­
ducto final es el ácido libre. II) A a fosfato, arsenato o mer­
captán. A este grupo pertenece una enzima aislada del Clostri­
diumkluyveri (94) que cataliza la oxidación dependiente del
NADy de CoAde varios aldehidos alifáticos dando comoresulta­
do la formación del derivado acil-CoA respectivo; la formaldehí­
do deshidrogenasa de higado de vacuno (95) que cataliza la oxi­
dación del formaldehído en presencia de glutation dando como
producto S-formiglutation y la aspártico ssmialdehido deshidroge­
naaa de levadura (103) que cataliza 1a conversión de L-aspártico
fi-semialdehido a fi»aspartilfosfsto, ligado a fosfato inorgánico
y NADP.III) Aquellas enzimas que combinan otra función con las
arriba mencionadascomopor ejsmllo la decarboxilación'oxidativa
del semialdehido malónico (96): la enzima es especifica para la
oxidación y decarboxilación del semialdehido malónico a acetil­
CoA, reacción que necesita 00A y NADo NADP.
La reacción se puede representar por:
9OOH 983
(¡mz + COASH + m1" a COSCoA + 002 + PNH + H+
CHO
La enzima no actúa ni sobre elmalonil-COA, ni sobre acetaldehi­
do.
Ninguna de las aldehido deshidrogenasas descriptas se obtie­
ne suficientemente pura comopara poder estudiar en forma adecua
da el mecanismode la reacción que catalizan; por lo tanto para
poder esbozar un mecanismo común de acción de todas las aldehido
deshidrogenasas debe tenerse en cuenta las propiedades comunes
a todas ellas. Estas propiedades, que si bien no han sido ensa­
yadas 001 todas las enzimas disponibles pertenecientes a este
grupo, son comunes a un número de ellas; son las siguientes;
1) Transferencia directa del hidrógeno del sustrato al piridin
nucleótido siendo la mismaestereoespecifica para la posición m­
del anillo nicotinamida (88, 89).
2) Grupos sulfhidrilos. Todas las aldehido deshidrogenasas ensa­
yadas son inhibidas por una serie de reactivos de grupos tioles.
No todas reaccionan de la misma manera, algunas son más suscep­
tibles que otras, y no todos los reactivos tienen el mismoefec­
to siendo algunos más inhibidores que otros. Ademásalgunas de
las enzimasnecesitan sulfhidrilos exógenospara desarrollar su
actividad, mientras que otras son estimuladas por los mismos; es
de suponer por lo tanto. que estas enzimas tienen grupos sulfhi­
drilos cuya destrucción conduce a la inactivación de las mismas.
Las causas por las que al oxidarse o bloquearse los grupos
tioles, disminuye o desaparece la actividad de la enzima son va­
rias; se pueden producir cambios en la estructura secundaria o
terciaria de la proteina, el grupo unido al sufhidrilo puede e­
jercer efectos estéricos o quimicos sobre el centro activo o
bien se puede destruir un sulthidrilo presente en el centro
de unión del sustrato o la ooenzina. por lo tanto el hecho de
que las enzimas sean sensibles a los reactivos de tioles no
es una evidencia suficiente para afirmar de que éstas tengan gru­
pos tioles en el centro activo.
La protección de 1a enzima frente a la inhibición por reac­
tivos de tioles por los sustratos que intervienen en la reacción
se puede interpretar postulando que esos últimos tienen mayor
afinidad por un sulfhidrilo particular que el inhibidor. Se sabe
que tres aldehido deshidrogenasas de higado de Vacuno y de le­
vadura son protegidos por los piridin nucleótidos especificos
de la reacción (6, 72),así la enzima de leVaduraiespecifica pa­
ra el NADes protegida solamente por el NADy no por el NADP,
en cambio la de higado. que puede actuar con ambos, es protegi­
da tanto por el NADcomo por el NADP.El grado de protección
varia con la enzima y el inhibidor (6, 72).
3) Inhibición por arsenito. El arsenito es un inhibidor de las
aldehido deshidrogenasas a una concentración relativamente baja
pero solamente en presencia de mercaptanes exógenos; la inhibi­
ción desaparece por adición de dimercaptanes, pero no en presen­
cia de monomercaptanes(92). Está claramente establecido que el
arsenito forma un complejo relativamente no disociable con gru­
pos sulfhidrilos situados muycerca en sistemas de .cetoácido
oxidasas ligadas a ácido lipoico. En base a estas obserVaciones
se sugiere que la acción inhibidora del arsenito sobre las al­
dehido deshidrogenasas se debe a que se combina con dos grupos
-SH muycereanos, necesarios para la actividad de la enzima.
Comose sabe que en estas enzimas no hay ácido lipoico se pos­
tula que los grupos sulfhidrilos involucrados están muypróximos
unos a otros comoconsecuencia del enroscamiento de la cadena
proteica (104). La necesidad de mercaptanes exógenos para la
inhibición por arsenito, se explica suponiendo que estos reduciw
rian una unión disulfuro previamente a la adición del arsenito.
De esto se puede deducir en forma razonable que la activi­
dad enzimática no tiene que depender necesariamente de la se­
cuencia de aminoácidos de la cadena lineal, sino que puede estar
presente en centros que se encuentran próximos en virtud a la
forma helicoidal de la cadena proteica. Por lo tanto la neutra­
lización de un grupo -SH o la ruptura de un puente disulfuro
alejados del centro activo puede resultar en un cambio de la
configuración de la proteina, siendo la nueva configuración
de la mismacataliticamente inactiva.
4) Inhibición por concentraciones relativamente bajas de alde­
hido. Este efecto se puede explicar comodebido al bloqueo de
grupos sulfhidrilos necesarios para la actividad enzimática,
por el exceso de aldehido que sirve de sustrato para la enzima
correspondiente (88, 92). El hecho de que aparezca un máximo
en las curvas de actividad en función de la concentración de
sustrato, se puede deber a la formación de dos compuestos enzi­
ma-sustrato. El primero, activo. constituido por una molécula
de acetaldehido, por cada centro activo de 1a enzima; el segun­
dojinactivo, formado por dos moléculas de acetaldehido por cen­
tro activo de la enzima (40); la segunda molécula de acetalde­
hido bloquearia un grupo esencial para la actividad de la enzi­
ma.
5) Enzima, piridin nucleótido y aldehido forman un complejo
ternario activo. Se ha estudiado la cinética de oxidación de al­
dehidos por cuatro enzimas asociadas con piridin nucleótidos,
tres de las cuales se obtienen a partir de Pseudomonasy son
especificas para el semialdchido succinico (93, 99); la otra
aislada de levadura oxida aldehidos alifáticos de bajo peso
molecular 69). Los resultados obtenidos son consistentes con
la formación de un complejo ternario. enzima, coenzima y sus­
trato, comoparticipante activo; se excluye la existencia de
un complejo binario.
No exhne una evidencia directa que permita postular la
formación ordenada del compuesto ternario. El argumento a fa­
vor de un mecanismo de orden ¿ompulsivo se basa en el hecho de
que muchas de las aldehido deshidrogenasas deben incubarse con
piridin nucleótido previamente a la adición del sustrato como
es el caso de las aldehido deshidrogenasas de Pseudomonas. Sin
embargoeste requisito puede deberse solamente a la naturaleza
inhibidora de los aldehidos que al combinarse con un sufhidri-.
lo de la enzima.necesark>para su unión con la coenzima, inhi­
ben la reacción. La preincubación con piridinnucleótido protey
geria a la enzima de la formación de hemimercaptales inactivos
con el sustrato.
De acuerdo con las propiedades enumeradas y teniendo en
cuenta la gran reactividad de los grupos sulfhidrilos con alde­
hidos Yacoby (97) propone el siguiente esquema para representar
el mecanismode acción de las aldehido deshidrogenasas:
oH oH |
SH R-CHO--Ï-g-S-Ii->G—S-Ó—R -C—R s-c-a
Ï 4*
-——-——% H i (III)
PN N PNH
(I) (HI; | íH o I-R-GOQH
2 ,L ..;.RI-5H‘* .AÑ\/._/«_a—-*
r-—SH II
R-COOH + L- Rï-S-C-R
'--PNH.
(IV)
Es decir, postula la formación de un tiohemiacetal enzimá­
tico (II) por la adición directa de un aldehido a un grupo tiol
de la enzima o por intercambio con un intermediario del tipo
de tiohemiacetal que se forma entre glutation y aldehido. Como
resultado de la oxidación se formaría un éstertiólico de la pro­
teina (III) el que puede romperse ya sea por hidrólisis o por
acción de un mercaptan (por ej. glutation o CoA) para formar
la enzima reducida (IV) y el producto respectivo ya sea el á­
cido libre o el éster tiólico del mismo.
Una omisión de este esquema cs que no explica le función
de los dos grupos sulfhidrilos situados muypróximos entre si.
A pesar de que el arsenito y el aldehido compiten por el mis­
mocentro de la enzima, sugiriendo que existe una relación en­
tre la oxidación del aldehido y la inhibición por arsenito, se
debe tener en cuenta que ésta última sólo tiene lugar en presen
cia de un mercaptan exógeno mientras que la actividad oxidante
de la enzima, en muchos casos, se evidencia en :usencia de
los mismos. Una forma de eXplicar este efecto es que el sulfhi­
drilo exógeno rompa un puente disulfuro de la proteina dando
grupos tiolcs libres, uno de los cuales estaria disponible para
combinarse con arsenito el cual se uniria además con el sufhi­
drilo de la proteina involucrado en la formación del tiohemi­
acetal (97). Nirenberg y Jacoby (86) proponen otra explicación
para el papel de los dos grupossulfhidrilos próximos de la
proteina, que implica la formación de un compuesto intermedio
enzima-ortoácido.
r--NA.DP NABP vam + NADP
—-SH Boi“? s-p-R —-—> S-‘Ï-R :1) s.\ ,R
. OH OH ,‘c\
SH SH s OH
B c D
NADPH, Héo r-—NADPH +1,20 l___¿> ______;
H -R—Coorf t SH
—R—COOH
S-g-R SH
E o F
SH
A
Este mecanismono puede diferenciarse experimentalmente del
anterior en el que participa un sólo grupo tiol, y es el tiohemi­
acetal formadoel que se oxida directamente a tiol-éster.
Por su parte Hacker, estudiando las propiedades de la 3-fos­
fogliceraldehido deshidrogenasa (100) observa que cuando se a­
grega NADa la enzima, se produce un cambio espectral con un má­
ximo en 360 mu, que coincide con el valor hallado por Van Eys
y Kaplan (101) para el complejo NAD-glutation, compuesto que se
obtiene en forma no enzimática; Si en esas condiciones se agre­
gan al sistema reactivos de tioles, iodoacetato o p-cloromercuri­
benzoato o el sustrato, desaparece 1a banda de absorción a 360 mu
(102). El cambio de abosrción por agregado de coenzima se inter­
pretó comoresultado de la formación de un complejo entre el
NADy los grupos sulfhidrilos de la enzima. El primer paso de la
adición de sustrato seria una "aldehidólisis" de la unión NAD­
SH, con la formación directa de 1a coenzima reducida y de un
tiol-éster sobre la enzima, mecanismoque se puede esquematizar
de la siguiente manera:
PN r-PNH PNH
+ R-CHO hs-g-rz Hzo ama-00011
Este tipo de mecanismosupone el ataque de un azufre electrone­
gativo sobre el C electropositivo del carbonilo. La necesidad de
algunas aldehido deshidrogenasas de ser preincubadns con NADan­
tes de la adición de eldehidos y la protección de las enzimas
por la coenzimacontra_la inhibición por los reactivos de tio­
les)están de acuerdo con el concepto de aldehidólisis.
Los resultados obtenidos por Stoppani y Milstein (72) están
en total desacuerdo con estos mecanismos dado_que si estos se
cumplieran con las aldehido deshidrogenasas estudiadas por ellos,
el sustrato tendria que ser capaz de preservar a la enzima en
forma efectiva de la acción inhibidora de los reactivos de tio­
les.
En las tres enzimas ensayadas, dos de levadura y la terce­
ra de higado de vacuno, se ha demostrado la presencia de sulfhi­
drilos esenciales (72); en ningún caso el acetaldehido fue capaz
de una protección general frente a todos los reactivos de tioles.
Sólo frente a algunos, la acción protectora del sustrato so­
bre la enzima de higado fue suficientemente significativa. En
cambio los resultados obtenidos con NADy NADPaldehido deshidro­
genasas de levadura son bien concluyentes especialmente si se
tiene en cuenta los valores de las constantes aparentes de Micha­
elis del complejo enzima-sustrato que,siendo del orden de 10'.5 M
indican que la reacción está netamente desplazada hacia la for­
mación del complejo enzima-sustrato. Más aún, los valores de las
constantes aparentes de Michaelis para el complejo enzima-coenzi­
ma son del orden de 10-4M,sin embargo siempre protegieron a la
enzima frente a los reactivos de tioles ensayados.
Los experimentos cinéticos realizados con la NADaldehido
deshidrogenasa de leVadura por Stoppani y Milstein (40) conducen
a dos posibilidades respecto a la acción del acetaldehido, sien­
do el resultado final de ambosun complejo ternario activo. La
primera posibilidad seria que los compuestosbinarios enzima-acet­
aldehido y enzima-coenzima se formaran independientemente, pre­
valeciendo para el sistema condiciones de equilibrio. Estos com­
puestos binarios formarian a su vez el complejo ternario, unién­
dose al sustrato o a la coenzima a igual velocidad que la enzima
libre.
La segunda posibilidad, que requiere condióiones de flujo
estacionario y coincidencia en algunas constantes, sería que el
acetaldehido se uniera al compuesto enzima-NAD,porejemplo a
través del NAD,proceso que se puede esquematizar de la siguien­
te manera:
HO OH 0 .OH\ /
0/ -———> ¡1+ + \CH/\ “_ / \CH H CH
3 3
4 H '*
’ CONH
í i 2
Ü J
N-HS-E
v á
OH
H_ H H‘ .. (i; x\ /
\)\ f. 3
/9H ICONHQ ¿5' ._CONH2
° =°.., + ii ll .P- ¡I ¡E
CH3 fl I; : :\
IÏ-HS-E x — HS -E
R R'
En un primer paso, la forma aniónica del hidrato de alde­
hido se uniría al compuesto enzima-NADa través de la coenzima,
ya que el acetaldehido en solución acuosa, a temperatura ambienta
está hidratado en un 60%aproximadamente y el hidrato está en
equilibrio con su forma aniónica en solución de pH alto.
En el presente trabajo se continúa con la investigación
del centro activo de las tres aldehido deshidrogenasas en es­
tudio en este laboratorio; NAD(2) y NADP(3) aldehido deshidro­
genasas de levadura y NADaldehido deshidrogenasa de higado de
vacuno (4).
Comose conoce que una serie de deshidrogenasas ligadas
a piridin nucleótidos; alcohol deshidrogenasa de hígado y de
levadura, glutámico deshidrogenasa de higado y láctico deshi­
drogenasa de músculo de esqueleto de conejo (27) contienen
cinc comocomponente estructural y funcional, se pensó que o­
tras deshidrogenasas dependientes de nicotinamida adenina dinu­
cleótido podrian contener un metal en su centro activo o mante­
niendo la estructura activa de los mismos. Por ello se ensayó
la presencia de metal en las tres enzimas.
Uncriterio funcional para determinar si ciertos grupos
de la enzima son necesarios para su acción catalitica, es ver
qué efecto producen sobre la actividad enzimática reactivos que
se conocen que actúan especificamente sobre el gripo en estudio.
En base a esto se ensayo el efecto que tienen una serie de agen­
tes orgánicos e inorgánicos eapaces de formar complejos con
iones metálicos, sobre las aldehido deshidrogenases en estudio.
Se completó además el estudio de las progiedides de la
NADaldehido deshidrogenasa de leVadura en relación a 1) especi­
ficidad de sustrato, 2) especificidad de coenzima, 3) necesidad
de activadores de la enzima, 4) inhibidores de la reacción, en­
tre los que se encuentran análogos del NAD,derivados piridini­
cos y adenilicos, sustratos y sustancias análogas al sustrato,
sustancias complejantes de metales, hidroxilamina y reactivos
de tioles. .
En base a los resultados obtenidos se pudieron sacar algu­
nas conclusiones sobre; grupos esenciales de la enzima y la
coenzima, mecanismo por el cual actúa la cisteina y mecanismo
de la reacción de la NADaldehido deshidrogenasa de levadura.
HAB
NADH
NADP
AMP
ADP
ATP
Nm:
deamNAD
AÏñD
¿PadáEAD
PyAlAD
PyAldeath
Iris
OP
OHQ
DDC
BAL
EDTA
DEAE- celulosa
TEAE- celulosa
0M - celulosa
ABREVIATURAS
:Nicotinamida udenina dinuoleátido
:Nicotinamida adenina dinucleótido reducido
:Niootinamida adenina dinuoleótido fosfato
:Adenosina monofosfato
:Adenosina difosfato
:Adenosinatrifosfato
:Niootinamida mononucleótido
.:Desamino NAD
:3 aoetilpiridina AD ,
:3 acetilpiridina desamino AD
:Piridina 3 aldehido AD
:Piridina-3-aldehido desamino AD
:2-amino-2-hidroximetilprOpane-l,3-diol
21,10 - fenantrolina
:8 —hidroxiquinolina
:Dietilditiocarbamato
:Dimercaptopropanol
:Etilendiaminotetraacetato
:Dietilamino otil-celulosa
:Trietilamino etil-celulosa
:Onrboximetil-celulosa
CAPITULO II
MATERIALES Y METOH)S
MATERIALES l
NADy NADH(95 % de pureza) de Sigma Chemical Co.
NADE:(90 % de pureza) de Sigma Chemical Co.
Tris: de Sigma Chemical Oo. Tris 7-9
Olorhidrato de cisteina: de la British Drug HousesLtd.
01K: de The Coleman and Bell Co. I
Acetaldehido: de la British Drug Houses Ltd.
Análogos de NAD:de Pabsm Laboratories Co.
Nucleótidos: de Sigma Chemical Oo. l
EDTAy Azida Sódica: de British Drug Houses Ltd.
Glicina y Histidina: de Eastman Kodak Co.
Glicil-glicina y Diglicil-glicina: de Hoffman-LaRoche
1,10 fenantrolina: Fluka A.G.
8 hidroxiquinolina: de Riedellt
Dietil ditiocarbamato: de B.D.H.
Cupferrón: de la Eastman Kodak Co.
Md'-dipiridilo: H;M.ChemicalCo.,grado P
Hidroxilamina: Anular 4
Oxido de melarsen: Mhyy Baker Ltd.;Dagenham,Inglaterra
Sephadex: de Pharmacia Uppsala Sweden
G-25;coarse,Lot No To 8024 0, Wr: 2,5 gffl2qfig.de gel seco
G-50;medium,Lot N° To 8341 M, Wr: 4,7g,E20/g.de gel seco
G-75;medium,Lob N° To 8869 M, wr: 7,3 g.H20/g.de gel seco
A-25;finc,Lot N° To 6891 F, Capacidad 2,9 m.cq/g
A-50gmedium,Lot N° 5307874M Capacidad 3,9 mcg/g
G-lOO,140-4OO mesh Lot N° mo 33,w;-: 10 g Ego/gnc gel seco
G-200,40—400mesh Wr: 20 g.H20/g.de gel seco
O-iodosobenzoato preparado según Askenasy y Meyer
Oxido de melarsen: May y Baker,Ltd I \
Adenina: Nutritional Biochemicals Corporation.
Piridina: Merck
BAL: de Boot Pure Drug Co.Nottingham.
Levadura de panadería (Sacharomyces cerevisiae) producto comer­
cial prensado y libre de fécula obtenida de 1a Cía.Argcntina de
Levadura E.N.
METODOS
Medición de la concentragiégfprotéiqg: Se midió espectrofo­
tométricamente a 280 mAcon corrección para ácidos nucléicos segúni
Warburgy Christian (1).
Medición de EH: Se le hizo potenciométricamente utilizando
indistintamente los aparatos de Beckman,modeloH2 y Metrohm,modelo
E 166. Las mediciones de pH de extractos enzimáticos se hicieron
colorimétricamonte por comparación con las soluciones buffer de
Sürensen, utilizando rojo de fenol (pH 6.3-8.0) comoindicador.
Medidasggpectrofotométricas: Se utilizó un espectrofotóme­
tro Beckman,modeloD.U. provisto de cámara termostatizada,coneo—
tado a un potenciómetro (10 m V) registrador Leeds y Northrup
"Speedomax", modelo G.
Oentrifugación en 35i938eutilizó una centrífuga refrigera­
da de la International Equipment Co. modelo PR-2, provista del
rotor 840a.
ggperiencias de electroforesis libre:Se llevaron a cabo en
un aparato de electroforesis libre del tipo ideado por Tiselius,
fabricado por Perkin-Elmer Corp.,modelo 38 A,utilizándose la cel­
da de 2 ml de sistema abierto.
Egggrioneia de ultracgntrifugación:8e lleVaron a cabo en una
ultradontrifuga Spinco ModeloE.,rotor AN-D.
Determinación de lq‘_actividades enzimáticas: Las activida­
des de las deshidrogenasas se midieron por la velocidad de reduc­
ción del NADo NADP,medida con el espectrofotómetro, en celdas
de corex de l cm.de espesor óptico, a temperatura ambiente (l7°­
25°) siendo el volumen final de la mezcla de reacción 3.0 ml.So
toma comocororla densidad óptica del blanco (mezcla de reacción
con todos los componentes menos el aoetaldehido) y la reacción
se inicia añadiendo el acataldehido; a partir de ese instante se
mide el aumento de absorción cada 10-30 segundos.La medida de
la NADaldehido deshidrogenasa de levadura se realiza según'
Black (2). La concentración final de los_reaetivos es la siguien­
te: Tris 0.1M, pH8.0; NAD;0.45 mM;01K 0.05 M;cisteina 0.001 M
y acetaldehido 17 x 10_5M. La medida de la NADPaldehido deshi­
drogenasa de levadura se realiza segun Seegmiller (3) si bien la
glicil-glicina se sustituye por Tris. Cohpentracionesfinales
usadas son: Tris 0.915 M, pH 7.7;012 mg 0.015 M;NADP0.12 mMy
acetaldehido 0.5 mM.
La medida de la DPNaldehido deshidrogenaea de higado, se
efectúa según Racker (4), con las siguientes concentraciones fi­
nales: pirofosfato 0.01 M, pH 9.3, NAD0,45 mMy acetaldehido
3.5 mM.
Determinación del acetaldehido (5): Aldehidos pueden ensayar­
se espectrofotométricamente con enzimas relacionadas con NAD,mi­
diendo la absorción del NADHa 340 mk. Se usó indistintamente la
NADaldehido deshidrogenasa de higado o de levadura. Cantidad
de acetaldehido a agregarse debe estar entre 0.02 y 0.4 micromo­
les; las lecturas de densidad se hacen hasta que la reacción se
detiene. Los cálculos se hacen teniendo en cuenta que la oxidación
de 0.1 micromoles de acetaldehido producen un cambio de la densi­
dad óptica de 0.21.
Métodosgenerales de inhibición y protección de las deshi­
grgggnggag: En los experimentos de preincubación de la enzima con
los complejantes de metales se procede de la siguiente manera.
En un tubo de ensayo pequeño se coloca Tris 0.1 M; pHBO; ClK
0.05 M, el complejante de metales en la concentración que se
indica en cada caso,agua destilada hasta completar un volumen de
0.5 m1 y por último la enzima. A1 cabo del tiempo indicado, me­
dido con cronómetro a partir de la adición del extracto enzimá­
tico, se toman alicuotas de 0.02 ml que se diluyen en la mezcla
utilizada para medir la actividad enzimática de cuyos componen­
tes solo falta el acetaldehido.Cuando se trabaja con reactivos de
tioles se procede de la mismamanera,solo que los tubos de incu
bación no tienen cloruro de potasio. En cada caso se hace un
testigo que se incuba en las mismas condiciones pero sin comple­
jante de metales.
Las actividades (V) se expresan comovariación de densidad
óptica a 340 m/ por minuto «AE340 x 103/min). Comola activi­
dad decrece a través del tiempo (especialmente con la NADalde­
hido deshidrogenasa de levadura) se representan gráficamente las
variaciones de absorción (ordenadas) en función del tiempo
(abscisas) tomandoel valor de la tangente de la curva en el
orígen de coordenadas, comola velocidad inicial de la reacción.
La inhibición (I) de la actividad enzimática se calcula
con la ecuación:
1% = 100 (1 — Vi/Vt )
donde Vi y Vt representan las actividades de la enzima en presen­
cia del infiibidor y del testigo‘respectivamente.
El error de I, e tI 100 2 2 2 2
eI — /Vt\\V// e Vi+ (Vi.evt/Vt)
y disminuir Vi. LaPuede verse que e disminuye al aumentar V
velocidad del testigo está limitada por la: concentraciones del
sustrato y de la enzima, mientras que la velocidad de la enzima
inhibida está limitada además,por la concentración del inhibi­
dor.
En los experimentos de protección el complejante de metales
se agrega a la enzima en presencia del protector y el porcentaje
de inhibición (I ) se calcula con relación a un testigo tratado
con protector solamente.El porcentaje de protección (P) de la
enzima se calcula de la ecuación p = lOO (IuIP)/I
donde I es la inhibición e I es la disminución de actividad de
la enzimatratada con protector/Ïnhibidor,respecto a la actividad
de la enzima con protector solamente.
El error de p,e e = lOO/I e2 i (Ip e2 ) / Ip p IPs I
epaumenta a medida que aumenta I
2
y disminuyeI.Por lo tanto las protecciones observadas frente a
reactivos de bajo poder inhibidor resultan afectadas de un error
tanto mayorcuanto menores la actividad inicial del testigo y
la inhibición observada.
Ereparación de la acetaldehido deshidroggggsa de higado
i3acker2.: Se sigue el método de Hacker (4) modificado por
Stoppani Milstein (6) hasta la etapa de fraccionamiento con
etanol inclusive.Se introduce a continuación un fraggiggamigntg
con ácidos nucléicos: por cada 20 ml de sobrenadante que contie­
ne 20 mgs de proteina por mililitro se agrega 1.5 ml de solución
neutralizada de ácido nucléico al 5%. Se ajusta el pH a 5.2 con
acético 0.1M, se deja l5 minutos y se centrífuga. El precipita­
do formado se descarta. Al sobrenadante se le agrega 5 ml de so­
lución de ácido nucléico por cada 20 ml de extracto original
y se baja el pH a 4.7. Se centrífuga y el precipitado se disuel­
ve en solución amortiguadora de pirofosfato 0.05 MpH 8.3 y se
le agrega sulfato de protamina 1%(Roche) en fracciones peque­
ñas a pH 6.5 hasta que la relación de absorción de 280 mP/260 md
indique la eliminación del ácido nucléico.
Fraccionagiento con sulfato de amonio: In solución se lleva
hasta 45%de saturación con solución saturada de sulfato de amo­
nio obteniéndose un precipitado que se centrífuga y se redisuel­
ve en un volumen minimo de agua destilada.
Esta solución conservada a -17°C se utilizó en experimentos
que se describen más adelante.
Preparación de la NADPaldehido dgghidroggggsa de levgggga
(Seegmiller): Se sigue el método de Seegmiller (3) modificado
por Stoppani y Milstein (6).
gggparación de 1a NADaldggido deshidrogenasa de_levadura
(Black): Se procede de acuerdo al método de Black (2) modificada
por Stoppani y Milstein (6) hasta 1a etapa de la coagulación por
el calor de la proteína inactiva.La precipitación ácida usada
por cotos aútbreBJSÏha modificado comose describe en el capítu­
lo siguiente. La etapa de precipitación acetónica descripta por
los mismos autores se usó solamente al comienzo en determinacio­
nescinéticae y de la acción de diversas sustancias sopre la en:
zima por cuanto permite 1a eliminación de electrolitos. Másade­
lante se lo sustituyó por el método muchomás conveniente de
cromatografía a través de Sephadex G-25.
CAPITULOIII
PURIFICACIONïgNALISIS FISICOQUIMICO Y ANALISIS DE METALES
DE LA NAD ALDEHIDO DESHIDROGENASA DE_ÉEVADURA.
El sobrenadante proveniente de la centrifugación del ex­
tracto calentado a 55° durante 15 minutos de acuerdo al método
de Black (4) se somete a una precipitación ácida: agregandose­
le acido cítrico 1Mlentamente y con agitación para evitar con­
centraciones locales altas de ácido que desnaturalizan la enzi­
ma; hasta alcanzar el pH 4,7 medido con potenciómetro. Sc tra­
baja con el extracto en baño de hielo. Se lo lleva a la cámara
de 2° donde se lo deja alrededor de dos horas al cabo de las
cuales se centrífuga a 0° a 3.500 r.p.m. durante 20 minutos.
El precipitado que se forma contiene parte de la enzima. Al
sobrenadante se le baja el pH a 4,5 y luego de dejarlo media
hora en la cámara fria se centrífuga igual que en el paso an­
terior. Conlos precipitadbo obtenidos a pH 4.7 y 4.5 se pro­
cede de la siguiente manera: se los suspende en 30 ml de solu­
ción de fosfato bipotúsico 0.025Majustándose el pH a 6.3 con
amoniaco 3M, se centrífuga y se vuelve a suspender el precipita­
do en la solución de fosfato bipotasico, se centrifuga y el so­
brenadante se une con el anterior. La solución contiene la en­
zima y se puede conservar bien congelada a -20° durante un mes.
No se puede determinar la actividad específica de los extractos
resultantes dado que la alta concentración de ácidos nucléicos
que contiene, alrededor del 40%, introduce un error muygrande
en la determinación de proteínas por el método espectrofotomé­
trico. La actividad especifica aproximadade los extractos ob­
tenidos por precipitación ácida es de alrededor de 3.000 unida­
des/mg y tiene un promedio de 150.000 unidades/m1.
De acuerdo con el método de Black (4) la etapa siguiente
es un fraccionamiento por solventes orgánicos, pero la frac­
ción acetónica que se obtiene es muyinestable, pierde activi­
dad aún durante el transcurso de los experimentos por lo que se
busca un método que dé comoresultado un extracto más estable.
Cromatografía en columna dg_gg¿yoximgtilgglulggg_1_ggég­
celulosa del extracto obtenido por precipitación ácida: En
todos los experimentos se usa una CMFcelulosapreparada por
Whatman,Floc CM70 que puede utilizarse directamente sin pre­
vio lavado. Para la preparación de las columnas se procede de la
siguiente manera: se suspende la celulosa en amortiguador fos­
fato 0.1M, pH 6.8, EDTAlmMen la proporción de l gramo en 50 ml
de amortiguador y se deja en reposo; el materhll que no sedimen­
ta en 45 minutos se elimina deeantando la suspensión sobrenadan­
te. La celulosa se resuspende en el mismoamortiguador y se eli­
mina el aire ocluído colocándolo en un desecador en el que se
hace el vacio. Para el llenado de la columna de 1 cm de diáme­
tro interno por 15 cmde largo, se obtura el extremo inferior
de la misma con un pequeño tapón de algodón o de lana de vidrio.
A la parte superior de la columna se le ajusta mediante una uni­
ón de gomaun reservorio cónico y se llena todo rápidamente con
la suspensión de celulosa en cantidad suficiente comopara que
una vez compactada la columna, tenga la altura deseada (lO cm.),
permitiendo simultáneamente que el líquido fluya por la parte
inferior. En caso de que el flujo sea demasiado rápido se puede
regular con un tubo de gomaajustado al extremo inferior de la
columna y una pinza de Mohr.El compactado de la columna se com­
pleta mediante la aplicación de una presión hidrostática equiva­
lente a 0.05 atmósferas mediante la aplicación en la parte supe­
rior de la columna de un tubo de vidrio de un metro de longitud
lleno de amortiguador.Antes de utilizarse la columnase lava
con el amortiguador que se va a emplear en la corrida hasta que
el pH del efluyente sea igual al del amortiguador usado.Veloci­
dad de elusión varía entre 5 y 7 ml en 10 minutos. Se cromatogra­
fía el extracto ácido sin dializar,o dializado durante 12 horas
contra amortiguador de fosfato de potasio l mMpH 6.8,EDTA l mM
en columna de CM-celulosa equilibrada con el mismo amortiguador.
En ninguno de los dos casos se adsorbe la enzima,pues eluye en
el primer tubo con amortiguador fosfato bipotásico 5 mM,pH 6.8,
EDTAl mM,con una purificación aproximada de dos veces y con
un rendimiento del 70%. No se eliminan los ácidos nucléicos.
Extracto ácido dializado durante 12 horas contra amortigua­
dor fosfato bipotásico l mMpH 6.8, EDTAl mMse cromatografía
en columna de DEAE-celulosa equilibrada con el mismo amortigua­
dor. Enzima eluye en los dos primeros tubos con fosfato hipoté­
sico 5 mMpH 6.8 EDTAl mM,purificada una vez y media y se eli­
minan completamente los ácidos nucléicos que en el extracto
ácido exceden el 20%.
Los resultados obtenidos por cromatografía del extracto
ácido a través de columnas de derivados celulósicos no es satis­
factoria, por lo que se ensaya el fraccionamiento con sulfato
de amonio.
Fraccionamiento con sulfato de aggjíp: Se debe tener espe­
cial cuidado en el control del pH de la solución saturada del
sulfato de amonioa utilizar. Los fraccionamientos se llevan a
cabo mediante el agregado de solución saturada a la temperatura
de precipitación (entre Oy 5°) a pH 7, preparada con solución
de EDTA5 mM.La concentración de sulfato de amonio se expresa,
como es comúnen estos casos, comoporcentaje de saturación to­
tal. El cálculo de la cantidad de solución saturada necesaria
para alcanzar un dado porcentaje de saturación total se realiza
con la siguiente fórmula:
¿”8.235%f
en la que Va es el volumen de solución saturada de sulfato de
amonio que es necesario agregar a un volumen VS de solución con
un porcentaje de saturación total Si, para que el mismose ele­
ve a SÍ. En esta fórmula se consideran despreciables los efectos
de la contracción de volumen. El añadido de sulfato de amonio
seïhace lentamente con agitación continua. Se deja en reposo no
menos de 2 horas, generalmente una noche y se centrífuga a 3.500
r.p.m. Los precipitados obtenidos se redisuelven en solución
amortiguadora de fosfato de potasio 0.5 M, EDTA1 mMpH 7.0.Se
hacen dos cortes: en el primero se lleva al extracto a 45%de
saturación, se procede en la forma descripta y luego a1 sobrena­
dante se le agrega solución saturada de sulfato de amoniohasta
alcanzar el 68%de saturación. En esta fracción cae el grueso
de la actividad con una purificación término medio de tres ve­
ces y un rendimiento del 80-85%siempre que se trabaje en presen
cia de EDTA5 mM.La actividad específica de los extractos obte­
nidos es en promedio de 12.000 unidades/mg, la concentración de
ácidos nucleicos sigue siendo alta, entre lO y 20%, aunque no
tanto comoen los extractos obtenidos después de la precipita­
ción ácida porque gran parte de los mismoscae en el primer cor­
te del fraccionamiento.
Eliminación de sales del extracto obtenido por precipita­
ción con sulfato de amonio: El paso preliminar para poder cro­
matografiar estos extractos es eliminarlos el sulfato de amonio
remanente que impide su adsorción en las columnas. Para ello se
ensayan distintos métodos.ADiálisis: se estudia 1a estabilidad
de la enzimadializándola contra distintas soluciones: Tris lO
mMa pH 7.0 y 8.0 y fosfato bipotásico lO mMpH 6.0 solos y
agregando a cada uno: EDTAl mMy 50 mM, cisteina l mM, ZnÏÏ x
10-4My KT 50 mM.Se dializa durante 4 horas sin agitación. Nin­
guno de los extractos pierde actividad capecifica, la que se man­
tiene hasta 3 dias si se lo conserva congelado a -16°C. Los di­
alizados contra fiH 6.0 no son estables. Rendimiento es de 70%.á_
Precipitación con acetona: se diluye el extracto obtenido luego
de la precipitación con sulfato de amoniohasta tener una concen­
tración de proteina de 3.5 mg/ml con solución de citrato lO mM,
pH 5.4 en presencia de EDTAl mM.La acetona se agrega lentamen­
te cuidando quela temperatura no suba de 0°C. La enzima precipi­
ta cuando se alcanza el 45%de saturación con acetona, se centri­
fuga a -8°C durante 5 minutos y el precipitado se redisuelve en
Tris 0.015 MpH 8.0. La actividad específica es la misma que la
del extracto dc sulfato de amonio 68%de saturación y el rendi­
miento de la Operación es bajo.
c, gramatografia a través de la columna de Sepnadex G:gfi: pre­
viamente equilibrada con una solución amortiguadora adecuada, se
eluyc con el mismoamortiguador,Este mótodo es altamente satis­
factorio puesto que el sulfato de amoniose elimina totalmente,
se recupera el 100%de la actividad enzimática, el extracto se
diluye muypoco y la operación es muy rapida.
Cromatografía en 1a columna de DEAEx TEAE-celulosa del ex­
tracto obtenido por precipitación con sulfato de amonio: el ex­
tracto acetónico que se obtiene después del fraccionamiento con
sulfato de amonio se cromatografía en una columna de DEAE-celu­
losaquuilibrada con amortiguador de Tris 10 mMpH 7.5, EDTA
l mM.Secluye con el mismoamortiguador al cual se le agrega
01K 50 mM;enzima sale en el segundo tubo con una purificación
de casi dos veces y un rendimiento del 100%.Laconcentración de
ácidos nucleicos baja de 26 a 3%.
Si bien la purificación obtenida por pasaje a través de
columna de DEAE-celulosano es satisfactorio, se eliminan casi
completamente los ácidos nucleicos, por lo que se ensaya sepa­
rarloe agregando directamente al extracto obtenido por precipi­
tación con sulfato de amonioel derivado oelulósico, se deja
equilibrar ea frio durante quince minutos, se centrífuga y se
determina la actividad del sobrenadante. El método no dá resul­
tado, no se eliminan los ácidos nucloieos y disminuye la acti­
vidad especifica.
Se prueba pasar la fracción sulfato de amonio 68%sin di­
alizar por una columna pequeña, de l cm de diámetro interno
por 3 cm de alto, de DEAE-celulosa equilibrada con amortigua­
dor Tris 10 mM, pH 7.5, EDTAl mM. Se cluye con el mismo amor­
tiguador al que se le agrega ClK 50 mM.Actividad comienza a sa­
lir inmediatamente deepuós de agregado el eluyente con EEGgggis
miente del 95%y una purificación de 1.3 veces. Los ácidos/se
eliminan casi completamente.
También se eliminan los ácid>e nucleieos cuando se cremato
grafía la fracción sulfato de amonio por una columna de TEAE­
celulosa equilibrada con amortiguador de fosfato lO mMpH 6.0
EDTAl mM; el eluyente contiene ademas 01K 50 mM. Enzima eluye
inmediatamente después de agregado el mismosin purificarse.
Que la enzima no ee adsorba a la columna de DEAE-celulosa
puede deberse a que la fuerza iónica del extracto enzimático
es alta, por lo que so bajó a 5 mMla concentración de la so­
lución amortiguadora de Tris en que se resuspcnde la fracción
que precipita entre 45 y 68%de saturación con sulfato de amo­
nio. Contra esta mismasolución se dializa el extracto obteni­
do y con ella se equilibra la columna. Se trabaja a pH 7.7. En
estas condiciones la enzima se adsorbo. Se eluye aumentando la
fuerza iónica de la solución amortiguadora de equilibrio me­
diante el agregado de cloruro de potasio on concentración cre­
ciente; la enzima comienza a eluir con una solución de Tris
5 mMEDTAl mMcloruro de potasio 140 mM; los resultados de
la purificación no son satisfactorios: 1.5 veces con un rendi­
miento del 50%. Se ensaya la elución con gradiente lineal en­
tre concentraciones do Tris 5 mM,EDTAl mMy cloruro de pota­
sio 50 nM y Tris 5 mM, EDTAl mMy cloruro do potasio 400 mM
ambos a pH 8.0. La enzima comienza a cluir cuando la concentra­
ción del eluyente llega a 120 mMde cloruro de potasio pero sa­
le muydiluída y tanto el rendimiento comola purificación son
malos. Si se pasa por la columna un extracto mucho más crudo,
el que se obtiene después del calentamiento a 55°C, y se eluye
con gradiente lineal en las condiciones anteriores, la coneen­
tración de la elución es la misma, la purificación es de 6 ve­
ces pero el rendimiento es sólo del 50%, el eluído está muy
diluido por lo tanto es muyinestable; no se eliminan los áci­
dos nueléicos.
Llama la atención que el rendimiento de las columnas de
DEAEsea tan bajo, por lo que se hacen ensayos de estabilidad
de la enzima a distintos pH en Trio 5 mM,EDTA1 mM, cloruro
de potasio 50 mm, pH 7.0 y 8.0 y fosfato potásico 5 mM,EDTA
l mM, cloruro de potasio 50 mm, pH 7.0. La enzima es mucho más
estable a pH 7.0 tanto en fosfato bipotásico comoen Tris. Lue­
go de preeipitar con sulfato de amonio se suspenden alicuotas
del precipitado en cada una de las soluciones amortiguadores y
se dializan centra las mismas. La ensima resuspendida y dializa­
da durante 12 horas a pH 7.0 mantiene su actividad, no asi la
que se encuentra a pH 8.0, la que se va inactivando paulatina­
mente;
Se repite la cromatografía en columna de DEAE-celulosa pc­
ro equilibrada con fosfato bipotdsico lO mM,EDTAl mMpH 7.0.
La fuerza iónica de los eluyentes se aumenta, aumentando la
concentración de fosfato. Actividad eluye con fosfato bipotási­
co 50 mM,EDTAl mM,la actividad especifica se duplica, los
rendimientos mejoran notablemente (alrededor del 80%).
El eluido está muydiluido y, al tratar de coneentrarlo
se pierde parte de la actividad. Se han ensayado distintos mó­
todos de concentración: precipitación con solución saturada do
sulfato de amonio, diálisis del egtracto contra solución de
sulfato de amoniode concentración adecuada, liofilizaeión,
Plasdone, y pasaje por columna de DEAE-celulosa de dimensiones
reducidas pero con todos ellos, excepto con la liofilizaeión
en que la disminución de la actividad cepecifiea es del 14%,
la perdida es de 20 a 30%.
Electroforesis de Zona en columna de celulosa: A fin de
aumentar la purificación alcanzada hasta ese momentose ensaya
la electroforesis de zona en columnade celulosa de acuerdo a
la técnica de Porath (12). Comosoporte se utiliza polvo de ce­
lulosa Whatmanpara cromatografía. Columnaelectroforética uti­
lizada tiene un diámetro interno de l cmy una longitud efecti­
va de 40 cm. Una vez completada la electroforesis se separa la
columnaelectroforética del resto del aparato y se eluye el con­
tenido de la misma en cámara fria. con el mismo amortiguador con
el que se equilibró la columna, recogiendo fracciones de l m1.
Se trabaja con los extractos provenientes de la precipitación
con sulfato de amonio de 68%de saturación que se resuspenden
y se dializan contra la solución amortiguadora con la que está
equilibrada la columna de celulosa: Tris 5 mm,EDTAl mM,cloru­
ro de potasio 50 mMpH 8.0 y Tris 5 mM,cloruro de potasio 50
mM.EDTAl mMpH 7.0 en sendos experimentos. La electroforesis
dura 7 horas con un voltaje de 500 V y un amperaje de 23 mA. la
purificación es de 2 veces y se recupera el 85%de la actividad
y el 74%de la proteina.
Comola actividad especifica máximaalcanzada es de 20.000
unidades/mg. ya sea por el método de electroforesis de zona co­
mo por cromatografía a través de columna de DEAE-celulosa, se
estudia el comportamientoelectroforético de muestras obtenidas
por ambosmétodos. Los resultados obtenidos con el extracto cro­
matografiado por la columna de DEAEse ven en la figura 4. El
extracto obtenido por electroforesis de zona se precipita con
solución saturada de sulfato de amonio, el precipitado se sus­
pende en solución amortiguadora de fosfato potásico 0.1 M, EDTA
1 mM,pH 7.1 y se dializa contra la misma solución durante 15
horas y se estudia su comportamientoelectroforético en el apa­
rato de Perkin-Elmer. La actividad específica del extracto an­
tes de dializar: 15.000 unidades/m5., concentración de prote­
inas: 6.4 mg/ml, concentración de ácidos nucléicos 1%. Las fo­
tos obtenidas muestran dos componentesprotéicos.
En vista de los resultados obtenidos, debe continuarse con
la purificación a fin de eliminar la probable impureza que se
evidencia en los modeloselectroforéticos y de ultracentrifuga­
ción.
Egitración a través deggel_gextrang: El métododifiere
de otros procesos cromatográficos tales comocromatografía de
adsorción o de partición, en quelos volúmenes de elución son
muypequeños y que el gel es insensible a la variación de con­
centración de eoluto. Por lo tanto la separación de los componen­
tes depende muchode las propiedades fisicas de la columna arma­
da. Una zona debe pasar a través de la columna comouna banda an­
gosta, sin distorsionarse. Esto requiere un cuidadosopretrata­
miento del gel y armado de la columna. Una vez armada una columna
puede usarse durante largos periodos sin necesidad de rearmado.
Para armar una columna de Sephadex se procede de la siguien­
te manera: el gel seco tiene un grado de solvatación que depende
del grado de entrecruzamiento y del poder de solvataoión que es
función de la interacción gel-solvente; por lo tanto al poner el
gel en contacto con el agua, se hincha. Por eso un paso prelimi­
nar al armado de la columna es el de echar al gel on un exceso
de la solución amortiguadora con la que se va a equilibrar la
columna, agitando para evitar la formación de grumos. El equili­
brio se alcanza muylentamente por lo que conviene dejarlo no
menos de 24 horas a temperatura ambiente; si no se procede así
las particulas del gel continuan hinchándose una vez en la colum­
na lo que conduce.a una velocidad de flujo muybaja o al tapona­
miento de la misma.
Durante el proceso de aumento de tamaño del gel es convenien­
te eliminar las partículas másfinas. para ello se agita la sus­
pensión y se la deja sedimentar hasta que se forma una capa li­
mite neta. se decanta el sobrenadante y se repite el proceso has­
ta que el sobrenadante quede claro. Generalmente alcanza con 4 o
5 tratamientos con un volumen de sobrenadante de 10 a 20 veces
el del gel. Antes de introducirla en la columna, la suspensión
de gel se diluye hasta que su viscosidad sea tal que las burbu­
jas de aire puedan pasar a través de ella y se la coloca en un
desecador en el cual se hace el vacio para eliminar el aire
ocluido.
Armadode la columna: 1a columna utilizada es un tubo de vi
drio cilíndrico de 1.5 cmde diámetro interior y 25 cm de largo,
uno de cuyos extremos es un capilar y el otro un cierre esmerila­
do. Para evitar la dilución de lae zonas durante su remoción de
la columna, debe tenerse un cuidado especial con la salida de
la misma. Se obtura el capilar con un pequeño tapón de lana de
vidrio de 0.1 mm.Una vez montada la columna en forma perfecta­
mentevertical, se cierra la salida. Se la llena hasta un tercio
con la solución amortiguadora a usar en este caso fosfato de po­
tasio 0.5 M, EDTAl mMy cloruro de potasio 0.5 M, pH 7.0 y se
coloca en su sitio la lana de vidrio y las perlitas. Unidopor
el esmeril se adiciona un tubo de extensión que termina en un
reservorio cónico. Tanto la columna comoel tubo de extensión
se llenan con 1a suspensión de gel, la que comienza a sedimen­
tar inmediatamente. Una vez que se ha formado una capa de 2-5
cmse abre la salida dejando pasar una corriente lenta de solu­
ción. A medida que el tubo de extensión se vacia de gel, se eli­
mina el sobrenadante y se la vuelve a llenar con la suspensión,
cuidando de que en ningún momento haya sedimentado todo el gel
antes de agregar más suspensión. Ésto se repite hasta que el gel
alcance la altura deseada en 1a columna. Una vez armada se lava
la columna con la solución amortiguadora a emplearse, hasta que
el pHdel efluyente sea igual a la de ésta. Se usa una solución
amortiguadorade fuerza iónica alta para evitar la interacción
entre las moléculas de proteina. Antes de agregar la mezcla se
coloca sobre la superficie del gel un disco circular de papel
de filtro de diámetro ligeramente menorque el diámetro interior
del tubo de vidrio.
Introducción de la muestra: Se elimina todo el sobrenadante,
se cierra la salida y mediante una jeringa se agrega lentamente
la muestra. Se abre la salida y se deja que la solución penetre
en el gel, en el momentoque desaparece de la superficie se a­
grega un pequeño volumen de eluyente para lavar la misma; una
vez que se absorbió se comienza con la elución. Para evitar que
las zonas se extiendan mucho1a velocidad de elución no depe
ser grande. Se recogen fracciones de 0.5 ml cada 3 minutos.
Se prepararon columnas de l cm de diámetro interno y ll cm
de largo de cada uno de los siguientes geles: Sephadex G-2S,
G-50, G-7S, G-lOO y G-200; DEAE-Sephadex A925 y A-SO equilibrav
das y eluidas con amortiguador de fosfato potásico 5 mMpH 7.0,
EDTA l mM.
Excepto con los Sephadex G-lOOy 6-200 los resultados ob­
tenidos no son muysatisfactorios, los rendimientos son altos,
entre 85 y 10o%, pero la purificación no pasa de una vez y me­
dia.
Los distintos Sephadexempleados difieren entre si en el
grado de entrecruzamiento de las cadenas de polisacáridos que
fonman la red, lo que determina la porosidad de la misma. Del
grado de porosidad depende el rango de tamaños moleculares expre­
sados comopesos moleculares, que pueden separarse, asi el Sepha­
dex 6-25 que es el de mayor grado de entrecruzamiento separa fra­
cciones de pesq molecular de hasta 5.000 mientras que con Sepha­
dex 6-200 muyporoso, se pueden separar fracciones de pesos mo­
lecular arriba de los 100.000. Si se observa la figura S se ve
que los dos componentes proteicos corren muyJuntos, vale decir
que sus pesos moleculares no difieren considerablemente; además
la velocidad de sedimentación indica que el peso molecular de
los mismosno es bajo. Esto explica por que se obtiene resulta­
dos más satisfactorios con el Sephadex G-200.
Las columnas de Sephadex G-lOO y G-200 y las de DEAE-Sepha­
dex separan los ácidos nueleicos, en las dos primeras la separa­
ción es total, primero eluye la fracción con actividad enzimática
y luego los ácidos nucleicos.
Cromatografía en columna de Sephadex G-200 en las condicio­
nes indicadas en las figuras l y 2 conduce a la obtención de un
extracto de actividad específica 31.000 unidades/mg. el que so­
metido a un análisis en la ultracentrífuga reVela la presencia
aparentemente de un solo componente.
FIGURA 1
Ï Ï Ï I I l I I I I l
(17.500)
0.600- (19.000 -200
ahoo- 4601
l
ICC?
(17.500)
(8.000)
l 80
(15.000)
e8 l
dadenzimat(12.500)
Densidado'ptíca280;”
¡wl l l l l L l l4 e 31012114161820222u
Fracción número
Cromatografía en columna de Sephadex 6-200 de ln NADaldehi­
Act
de deshidrngenasn de levadura.
Columna de 18 x 1.5 cm.Se siembran 34 m1 de un extracto que
cantiene 150 mgde proteína y 1.250.000 unidades totalas
(actividad específica “.200 unidades/mgr).Columns se aluye
con solución amortiguadorn de fosfato de potasia O.5M,EDTA
1 mM,clorurn de potasio 0.5M.Se recogen volúmenes de 0.5 m1.
Se recupera el 70%de la actividad totu1.Los valores entre
paréntesis corresponden a las actividades específicas de ca»
da fracción.Fracciones 7,8 y 9 se uniersn,liofilizaron y vol­
vieron a cromatografiar.
FIGURA 2
/)x70‘
- l l l l l l L l
o 4012 m 4a 4a zo 22 24
Fracción número
Ls
:1 I l I l I l l r
0300 _ _8
N ' ' EL
Ü " " Ü
.20200- _gox x
\C) - ‘CJ_ _eo
Ü N
balon- _ Q
TD <1)
a — -ao
s — — s
Q a :9
.>s:
C)q
Cromatografía en columna de Sephadex G - 200
de la NADaldehido deshidrogenasa de leVadúra.
Iguales condiciones que en figura 1.Eracciones
de mayor actividad específica obtenidos en ce­
lumnade ln Fig.l se liéfilizaron y se volvie­
ran a cromatografiar.8c siembra l m1. que tie­
ne 19 mgr. de preteína y 300.000 unidades (IC­
'tividnd específica 16.000 unidades/mgr.).80 re­
cupera el 85%de la protein. y el 100%de ll ac­
tividnd total,el 67%del mismocae en las frac­
ciones de mayer actividad específica mientras
que 8610 el 37%de la proteína corresponde a
los mismeS.Va-loresentre paréntesis cerraspon­
den a las actividades específicas de cada frac­
cián.
RESUMEM DEL METODO QUE SE EMPLEA PARA PURIFICAR LA NAD ALDEHIDO
DESHIDROGEHASADE ppvwmm.
gptgggión del polvo cetónioo de levadura: de acuerdo a la
técnica modificada por Stoppani y Milstein (8). Se utiliza leva­
dura de panaderia (Sacharomyces Cerevisae) producto comercial,
prensado y libre de fécula.
' Extracción de la enzima: con solución de fosfato bipotásico0.092 M, en frio, con agitación ocasional durante S dias, mante-.
niendo el pH siempre superior a 6.6 mediante el agregado de amo­
niaco concentrado.
Coagulaciónpor calor de proteing_igggtiïg: se ajusta el
pH del sobrenadante de la extracción a 6.3 con ácido cítrico l M
y se Calienta a 55°C durante 15 minutos; se enfría rápidamente
y se centrífuga.
Precipitación ácida: sobrenadante de la etapa anterior se
le baja el pH a 4.5 mediante el agregado lento de ficido cítrico
l M, agitando continuamente y en frio. Actividad queda en el
precipitado cue se redisuelve andalución de fosfato bipotásico
0.025 M pH 6,3
Fraccionamiento salino con sulfato deágmggig: se hace mer
diante el agregado de solución saturada de sulfato de amonio.
El grueso de la actividad cae en el corte entre 45 y 68%de sa­
turación. Precipitado se redisuelve en solución amortiguadora dc
fesfato de potasio 0.5 M, cloruro de potasio 0.5 M, EDTA1 mM,
pH 7.0.
Filtragión a travég_ge gel de dextrano: Sephadex G-200 en
una columna de 1.5 cm de diámetro y 18 cm de largo equilibrada
con amortiguador de fosfato de potasio 0.5 M, cloruro de pota­
sio 0.5 M, EDTAl mM,pH 7.0. Se eluye con el mismo buffer. Fra­
cciones de mayoractividad especifica se recrouatografian por
la misma columna en iguales condiciones.
FIGURA 3
_Mpdeloelectroforético de la NADaldehido deshidrogenggg
de levadura de pangfiería correspondiente a la etagg de precipim
tación acetónica. Concentración proteica 5.3 mg/ml. Actividad
especifica 3.200 unidades/mg. Amortiguadorutilizado: veronal­
veronal sódico pH 8.6, fuerza iónica 0.1. Duración 105 minutos,
a 105 V y 7 mA. Temperatura 1° m 2°. Limbo ascendente.
¿«‘IGURA 4
Modelo electroforético de la NADaldehido deshidrogenggg
de leVadura de panadería purificgfia por crqggtografía en colga­
na de QEAE-celulosa. Concentración proteiCa lO mg/ml. Activi­
dad especifica 18.000 unidades/mg. Amortiguador utilizado:
Tris-citrato 0.1 M, pH 7.35. Duración 30 minutos, a 150 V y 7
mA. Temperatura 1° —2°. Limbo ascendente.
ANALISIs_g;g;gggggggggs“pgp_ggnno DE PUREZADE LAS PREPARACIO­
ygg_ggg;g¿ggg¿s_pp LEVADURAQE PANADERIA CON ACTIVIDAD DE NAD
¿EQEDIDO DESHIDROQENASA DE LEVADURA:
1.Enggigentos de Electroforesis: en varias etapas de la
purificación de la enzima se realizaron experimentos de electro“
foresis libre para investigar el comportamientoelectroforético
de los distintos componentesde los extractos obtenidos. Se
utilizó a tal efecto el modelo 38 A de Perkin Elmer. Aproximada­
mente 3 ml del extracto a analizar se dializan previamente duran
te una noche a O°Ccontra 600 m1 de amortiguador a utilizar cn
el experimento.
El extracto proveniente de la precipitación acetónica de
actividad especifica 3.000 unidades/mg, muestra una gran hetero­
geneidad proteica (Figura 3). El modelo electroforético se sim­
plificó bastante (Figura 4) después de cromatografiar el extrac­
to obtenido por precipitación con sulfato de amonio, a través
de una columna de DEAE-oelulosa. Actividad especifica del extrao­
to analizado: 18.000 unidades/mg.
II.Estudios de Ultracentrifugación: La preparación obtcniw
da deepués del pasaje a través de la columna de DEAE-cclulosa,
fue sometida a un análisis de pureza en la ultracentrifuga. Pa­
ra ello se liofiliza a las fracciones de mayoractividad especi»
fica. La actividad específica de los eluidos de columnaes de
17,000 y el del liofilizado baJó a 13.000. El lioÍilizado tiene
'26.4 mgs de proteina por ml, se lo diluye con solución de clo­
rurc de potasio 0.075 Mhasta concentración protóica de 6.15
mg/ml. El modelo que se obtiene revela la presencia de 2 compo­
nentes proteicos que corren (Figura 5) muyJuntos, semejantes
al modeloelectrofcrético de la figura. 4.
En la figu a 6 se ve los resultados obtenidos al someter
a ultracentrifugación la preparación obtenida por cromatogra-.
fia a través de la columna de Sephadex G;2OOen las condiciones
indicadas en la figura 2. Actividad especifica de los eluidos:
29.000 unid/mg; luego de liofilizar la mismabaja a 20.000
unidades/mg. Concentración proteica 5.25 mg/ml. El modelo que
se obtiene revela la presencia de aparentemente un solo compo­
nente que se desplaza lentamente y no se resuelve en otros compo
nentes a lo largo de su trayectoria.
Observando la figura 5, se Ve que lo que se supone es la
ComportamientoenlaultracentrifugadelaNADaldehidgdeshidrogenasadelevadugg.
“.wi­
Concentraciónproteica6.15mg/ml.Actividadespecíficadelapreparaciónenzimática 13.000unidades/mg.Temperaturadelrotor8°.Velociiaümáxina58.500rpm.Lasedimenta­ ciónprocededederechaaizquierda.Lasfotosfuero:tomaóqscada16minutos.
EMMA
ComportamientoenlaultracentrífugadelaNAD¿ldehidodeshidrogenasadeleVadura.Con­
centraciónproteica5.2mg/ml.Actividadespecíficadelapreparación20.000unidades/mg. Temperaturadelrotor21°.Velocidadmáxima59.000rpm.“asedimentaciónprocededederecha aizquierda.Lasfotosfuerontomadasalos:1,9,17,5,33,41,49,57,73,89,105,121, 137,153,169,185,201,y217minutosdehabersealcanzadolavelocidadmáxima.
FIGURA 6
impureza tiepe aproximadamente dos quintoe de la concentracdón
de la enzima. La actividad especifica de esta muestra es 17.000,
por lo tanto la enzimapura_debería tener_una actividad especí­
fica de alradedor de 26.000. Esto corroboraría lo observado en
1a figura 6.
ANALISÏS DE METALES DE LA NAD ALEQHIDO DESHIDROGENASA DE LEVADU
RA POR ESPECTROGRAFIA DE EMISION. .
El extracto de actividad especifica 28.000 unid/hg, que so­
metida a un análisis de pureza en la ultracentrífuga aparentemen­
te revela un solo componente, se recupera y se lo somete a un_
análisis cualitativo de metales en un espectrógrafo de emisión.
Se trabaja con un eSpectrógrafo Varrell Ash, modelo Ebert
de 3,40 m de longitud focal; con electrodos rotatorios de gra­
fito por lo que no es necesario calcinar la muestra.
Fuente de excitación usada para provocar y controlar la
chispa: Varisource, condición: arco interrumpido. Intensidad de
chispa: 5A; intensidad de arco: 2A.
Red: 15.000 lineas/pulgada. _
Placa fotográfica: Ilford ordinary N° 30.
Se preparó un testigo con 012 Zn 12 X/bl, espectrográfica­
mente puro. Comola muestra está disuelta en solución de fosfato
de potasio l My cloruro de potasio 1 M, también se analizan las
soluciones respectivas.
Elementos
Soluciones: K Mg Ag Na Zn Cu Al Fe Si
P0 41m2 + + - + - + .- + + +
ClK + + + - p + + + + ­
Extracto + + + + + + + + + +
Estos resultados, si bien no son concluyentes, corroboran
1a hipótesis de la presencia de Zn en la enzima.
> \
'n
s‘.......—-.._.¡.­
m """M'ÚKPÏTIÉO'"HIM"
7 ¿CCION DE AGENTES COMPLEJANTES QE
METALES SOBRE ALDEHIDO DEgfiggROGENASAS
_ La relación que existe entre sistemas que contienen metalo;
‘ con los procesos vitales ha sido reconocido desde hace muchotien"
po, ya en 1869 Raulin encontró que el ASpergilus Niger necesita Í
‘ Zn para sulorecimiento. La explicación de la funciénlfirdógica dé
los metales se ha buscado en su asociación con prcteinas particu&
Iarmente con aquellas que tienen actividad enzimática (14-17). í
LSe pueden diferenciar dos grupos de proteinas asociadas con meta}
Eles que tienen*ono actividad enzimática (15). '
gggplgigg_ggjgl;pggtgigg. En los cuales la proteina se com?
íbina revereiblemente con uno de varios cationes diferentes. Ï
. El significado funcional de la asociación entre metales y f
preteina se.ve facilitada cuandola proteina pura tiene función'
enzimática. A este grupo pertenecen los complejos metal-enzima
cuya.actividad depende de una combinaciün rápidamente disociablé
I con una variedad de iones metálicose,
La constante de asociación del metal con el grupo reactivo
de la proteina es bajo,pon ¡logica¡el metal puede eliminarse fácil­
mentepor diálisis con pérdida parcial de la actividad; ésta
Ïpuede restablecerse por agregado del metal. Diferentes metales
pueden sustituirse mutuamenteen la activación de la enzima. Po.
Mg++,Zn++, Mn++ ó Fe++.
Metaloproteina . La proteina está combinada con un dado me
Eeji la enolasa puede activarse con
..__...—...
.tal de unamanera determinada, de modo que se puede considerar
a ambas como una entidad.
í Cuando.la proteina que esta unida al metal en las condicio%
ïnes de la definición tiene actividad enzimática especifica, se
513 denomina metaloenzima.
Él metal, en todos los casos oonócidos hasta ahora, anhi- 5
drasa carbónica (18), carboxipeptidasa (19), alcohol deshidrom ¡
genasa de levadura (20) y de hígado de caballo (21), glutámico Ï
deshidrogenasa de hígado de vaca (22), láctico deshidrogenasa
(‘- LSLL1 .1de músculo esquelético de conejo (23) y fo asa alcalina de
I -u . ñ . . . .irinón de pOÏClHO(¿4), es un grupo reactivo de la analma, La a­
i dición de sustancias que se cónoca que tzenen gran afinidad put;' i
¡el metal y propiedades estéricas compatibles con la configura» í
._n. .u .-4._. ._-—-- . .- -.-- .—- ... _ . ... -_-..... ..
ción del centro de localización del metal. da comoresultado una
inhibición parcial o total de la actividad enzimática (15). La
inhibición es reversible cuando se forma un complejo disociable
entre el inhibidor y el metal y este queda unido a la proteina.
Los dos tipos de interacción metal-enzima probablemfldé se
correspondan con los complejos metálicos y los quelatos metálicos
que se encuentran en sistemas más simples. En la formación de
complejos con otros iones o moléculas no cargadas, llamñdes li­
gantes, se considera que los iones de metal actúan comoacepto­
res de pares de electrones de átomos dadores en el ligante.
En el quelato, dos o más átomos dadores de una molécula de li­
gante están unidos al mismo ión metálico, lo que los provee de
una estabilidad adicional (25).
En los últimos años se ha dedicado un gran esfuerzo a di­
lucidar el rol de los metales en la cetálisis enzimática. Histó­
ricamente la inhibición de enzimas por agentes quelantes ha serh
vido comoun medio clásico para establecer si un metal es o no
esencial en el proceso cetalitico. Ultimamentese sintetizaron
Varios agentes complejantes cuyo empleo ha permitido ampliar el
estudio de este importante aspecto del comportamiento.del metal.
Tales agentes quelantes inhiben la actividad catalitica debido
a una interacción especifica con el metal a través de la forma­
ción de un complejo mixto enzima-metal quelante
' [E Tie] + InÉLE Me) In
El empleo de estos inhibidores se basa en su conocida inter­
acción con iones en solución para formar complejos de coordina­
ción estables, unido al hecho de que los metales incorporados a
las proteinas retienen gran parte de su actividad quimica especi»
fica (26).
En este laboratorio (8) se ha estudiado el área activa de
tres aldehido deshidrogenasas, a saber, NADaldehido deshidroge­
nasa de levadura (2), NAD?aldehido deshidrogenasa de levadura
(3) y NADaldehido deshidrogenasa de higado de vacuno (4) con
respecto e la presencia de grupos sulffihidridos. El hecho de que
se encontró que una serie de deshidrogenasas dependientes de NAD
(27) contienen cinc, sugiere que un metal puede ser el campo»
nente funcional de otras deshidrogenasas. Por esa razón se probó
el efecto de los complejantes de metales sobre las tres enzimas
en estudio.
Besultados
Se exPondránpor separado los resultados obtenidos con Cada
una de las enzimas.
NADaldehido deshidrogenasa de levadura. De los complejantefi
ensayadosla 8-hidroxiquinolina, la l,lO-fenantrolina y el die­
tilditrocarbamato tienen acción inhibidora en el orden indicado
(Tabla l). En cambioel cupferrón, eláÏgE'-dipiridilo y la azi­
da sódica tienen muypoca o ninguna acción. Estos resultados se
obtienen en presencia de cisteina que es necesaria para la acti­
vidad de la enzima.
En ausencia de cisteina, la actividad de la enzima es sólo
del 14 al 16%de la correspondiente a la presencia de cisteina
1 mMen el tubo de medida. Si en esas condiciones se agrega los
complejantes de metales en las concentraciones indicadas en la
Tabla 2, se ve que la B-hidroxiquinolina, la 1,10-fenantrolina
_yel dietilditrooarbamato, que en presencia de cisteina inhibe
la acción catalitica, en ausencia de la mismala activan aunque
no en la mismaproporción que la cisteina. Es de notar que al
orden decreciente de inhibición corresponde un orden decreciente
de activación. La edición de cisteína l mMa una preparación par­
“cialmente activada por 1,10 fenantrolina aumenta ligeramente la
actividad pero no tanto comocuando actúa sola.
El cupferrón que no es inhibidor tampoco produce activación.
Si se estudia cuantitativamente la acción de la fenantroliw
na en presencia y en ausencia de cisteina se vé (Table 3, figura
proyencla de
l) que on/tisteina, la inhibición aumenta con el aumentode con­
centración de la fenantrolina, mientras que sin cisteina la ae­
tivación llega a un máximo cuando la concentración de OP es apro—
ximadamente l mMy luego comienza a decrecer, lo cual es de es­
perar si se supone que comoactivadores ambas sustancias actuan
de la misma manera. En la Tabla 4 se vé comovaria la activacion
de la enzima, en ausencia de cisteína, con la concentracion de
dietilditiccarbamato.
NADP-aldehidodeshidrogenagg ie levadura. Esta enzima re­
quiere comoactivador esencial un catión bivalente, calcio o mag"
nesio, pero comola oxiquinolina precipita en presencia de magnew
sio se lo ha reemplazado por calcio en algunos do los experimen­
tos. Los rcsu ados obtenidos por la accion de los complejantes
se resumen en la Tabla 5, donde se ve que son inhibidores: el
í Tabla l
{Acción de agentes complejantes de metales sobre la actividad dqÏ' "‘—-2
i¡la NADaldehido deshidrogenasa de levadura.
Bolug de proteina dieuelta en 3 ml de Tris 0.1 MpH 8.0, en pre;
sencia de cisteina 0.001 m, NAD0.45 my, 01K 0.050 M, las edicion
nee que se indican y acetaldehido 17 x 10-5g. Actividad del tee­
“tigo (¿EMO x 103/min.)exp. A: V124, exp. B: 118 y exp. c: 14o.
Adiciones Inhibición enzimática_(%)
Exp. A Exp.B Exp. C ;
1,10-Fenantrolina 1.o mM —- -- 7 '
1,10-Fenantrolina 2,5 my —- 24 19
1,10-Fenantrolina 5.0 mM 42 -- 39
8-Hidroxiquinolina 1.0 mM -— —— lO
8-Hidroxiquinolina 2.5 mm -- -- 45
8-Hidroxiquinolina 5.0 mM 87 —- 90
Cupferrón 1.0 mM -- -- 13
Cupferrón 2.5 mE —- ll ——
Cupferrón 5.0 mM 9 -- -­
Dietilditiccáz‘bámaio .2.5 mM -— 13 _— Í
Dietilditiocarbemato 5.o un 35 —— 36 ï'
¿CX-°('-Dipiridilo 2.5 m1_VI_ —- o —-
0(-o(’-Dipiridilo 5.o mM 10 -- --
'Tiourea 2.5 mE —- 0 - 3
Tiourea 5.0 mM O —— -- ¡
,Azida Bódica 2.5 mM -- 0 P- í
¿Azida sódica 5.o m1]; 7 _— -­
-- á .1 Hb—-.<su n-u-av-- n co. . ans-um“... 'F’v--'v n- v A-Uds \*“_h* -—-’-—-.—
Tabla 2
Efecto de los cgmplejantes de mptales sobre la activacióg gp ln-n...-_
NADaldehido deshidrqgenasa de levadura en ausencia de cisygígí
50 ¡ug de proteína _en exp. A y Ski/ug en exp. B, disuel'ta en 3 ml
de Tris 0.1 M pH 8.0 en presenc1a de NAD0u45 mE, ClK 0.059 M,
las ediciones en las concentraciones indicadas y acetaldehido
17 x 10'5 Magregado al fina].
Exp. Adiciones . v Actividad Actividadïé
enzimática en relación
¿3 Ew‘x 10-3.) ‘In. as.-n--.-——
a la enzima
min tratada con
of 531;eri na m};
A Ningvxa 39 16
Cisteina l mfi \ 248 100
BWHidroxiquinolina 2.1 my, 154 62
Cupferrón 4 my 34 14
1,10-Fenantrolina 5 mE 126 51
1,1ümFenantrolina 5mM+ Cisteínal.OmM 156 64
B Ninguna 18 I 14
Cisteína l mm 125 100
Dietilditiocarbamato 5 mM 40 32
Tabla 3
Influencia de la concentración de 1.1.-:gnantrqlina sobre la ac“
tividad de la NADaldehidodfleshidrogenagg de levadura en presenm
cia y ausencia de cisteína.
fiolpg de proteina disuelta en 3 ml de Tris 9,1 MpH 8.0 en pre­
sencia de NAD0.45 mM, 01K @.oso M, cisteina 0.001 M (exp.A) y
sin cisteina (exp.B); 1,10 fenantrolina en las concentracicnes
indicadas y acetaldehido 17 x 10-5Magregado al final.
A
Actividad vñnhia"Actividad Actividad
enzimática bición enzimática en rela­
Adioianes f E34ex lO % __E34Ox19 016? a la_ ensima
mr“ mÏH tratada
con cis­
toína'mM
ma)
Ninguna 145 — 4 3
l,lO-Fenantrolina 10,5 mM 28 81 lO 7
l,l®-Fenantrolina 5,2 mM 75 48 42 29
1,18-Fenantralina 1,3 mM 119 18 61 42
1,10-Fenantrolina 0,3 mM 98 32 29 20
FIGURA 1
l l l l l l l l