tesis-n6820-Marino

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Universidad de Buenos Aires
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Computación
Modelos computacionales para
tratamientos oncológicos basados en
electroporación
Tesis presentada para optar al t́ıtulo de
Doctor de la Universidad de Buenos Aires
en el área de Ciencias de la Computación
Lic. Mat́ıas Daniel Marino
Director: Dr. Ing. Guillermo R. Marshall.
Consejero de estudios: Dr. Esteban E. Mocskos.
Lugar de trabajo: Instituto de F́ısica del Plasma, FCEyN, UBA.
Buenos Aires, 2020
RESUMEN:
Modelos computacionales para tratamientos
oncológicos basados en electroporación
Uno de los grandes desaf́ıos cient́ıficos en la lucha contra el cáncer es la búsqueda de soluciones
más económicas y con menos efectos secundarios adversos. En este contexto, surge un grupo de
terapias alternativas basadas en la electroporación (EP). La EP es un fenómeno f́ısico en el cual
la aplicación de pulsos eléctricos a través de dos o más electrodos sobre una célula causa un
incremento en la permeabilidad de la membrana que lo recubre. De este modo, podŕıan ingresar a
la célula moléculas que en condiciones normales no lo haŕıan. Existen numerosas aplicaciones en
diversas áreas de la ciencia y la tecnoloǵıa basadas en la EP, como la medicina, la biotecnoloǵıa, el
procesamiento de alimentos y el medio ambiente, entre otras. En medicina, las más utilizadas son la
Electroquimioterapia (ECT), la Electrotransferencia Génica (GET) y la Electroporación Irreversible
(IRE). En este contexto, el modelado matemático y computacional se convirtió en una poderosa
herramienta para estudiar y predecir el resultado de protocolos basados en EP.
La aplicación de un campo eléctrico sobre un tejido genera frentes de pH con valores extremos
que emergen de los electrodos y se transportan por procesos difusivos y migratorios. Estos frentes
pueden provocar daño en zonas no deseadas del tejido y alterar aśı la eficiencia de tratamientos
médicos basados en EP. En la búsqueda de contrarrestar este efecto se modela un fenómeno no teni-
do en cuenta hasta ahora: la neutralización del pH por parte del principal sistema buffer del tejido.
Para dilucidar la incógnita sobre cómo y en qué medida este buffer atenúa el daño que producen
los frentes de pH, se formula un modelo matemático-computacional que describe el transporte ióni-
co por medio de la ecuación de Nernst-Planck sujeta a la condición de electroneutralidad y a las
ecuaciones de Butler-Volmer en los bordes del dominio. El modelo computacional, que resuelve un
sistema de ecuaciones en derivadas parciales altamente no lineal, utiliza el método de diferencias
finitas con un esquema fuertemente impĺıcito y métodos de relajación estándar en una malla no
equiespaciada. El modelo es validado con experimentos in vivo y permite, además, la descripción
de fenómenos teóricos subyacentes a la EP de dif́ıcil medición.
En esta tesis, también se introduce OpenEP, un simulador de protocolos de electroporación
espećıfico para tratamientos basados en EP que se distribuye bajo una licencia de software libre.
OpenEP tiene como objetivo proporcionar a la comunidad académica una implementación flexible
para predecir la evolución y optimización de varios protocolos basados en EP, caracterizándolos
por su número de pulsos junto con su frecuencia, ancho y amplitud. También permite modificar el
material y la forma del electrodo: dimensiones de las placas o agujas, número de agujas, distancia
ánodo-cátodo, entre otros. Además, OpenEP describe magnitudes f́ısicas clave involucradas en la
electroporación o tratamientos de campo eléctrico pulsado: potencial eléctrico, campo eléctrico,
conductividad eléctrica, densidad de corriente, corriente eléctrica, carga eléctrica, área electropo-
rada y temperatura. En particular, el conocimiento de la intensidad del campo eléctrico, que se
correlaciona con el tejido electroporado, ayuda a desarrollar estrategias para planificar y optimizar
un tratamiento dado. La implementación tridimensional altamente eficiente se obtiene mediante el
uso de C++ y OpenMP en un entorno GNU / Linux.
En la búsqueda de un método de optimización para protocolos basados en EP en términos
del número de pulsos, considerando el daño, se debe analizar la variación del tejido electroporado
en el tiempo. La optimización se basa en hallar la relación dosis-respuesta óptima, es decir, el
pulso cŕıtico (dosis) en el cual se maximiza el tejido electroporado y se minimiza el tejido dañado
(respuestas). El método que se propone para encontrar este óptimo consiste en acoplar dos modelos
matemático-computacionales. Para el cálculo del tejido dañado en el tiempo se utiliza el modelo
iónico de pH. Para el cálculo de la evolución del tejido electroporado se introduce un nuevo modelo
i
extendido de EP basado en la ecuación no lineal de Laplace y la ecuación de biocalor de Pennes,
que además incluye una función de umbrales de electroporación que decae exponencialmente en el
tiempo.
Se espera que los resultados de esta tesis permitan optimizar las terapias basadas en electropo-
ración de manera tal de generar planes de tratamiento más eficaces y con menores efectos adversos
y costos económicos. Se desea, en última instancia, que este trabajo contribuya a mejorar la calidad
de vida de los pacientes.
Palabras claves: simulación numérica, electroporación, modelado matemático, modelado compu-
tacional, electrotransferencia génica, electroporación irreversible, electroquimioterapia.
Esta tesis está basada en los siguientes trabajos:
“pH fronts and tissue natural buffer interaction in gene electrotransfer protocols”,
M. Marino, N. Olaiz, E. Signori, F. Maglietti, C. Suárez, S. Michinski, G. Marshall,
Electrochimica Acta 255 (Supplement C) (2017) 463–471.
“Towards an optimal dose-response relationship in gene electrotransfer protocols”, E.
Luján, M. Marino, N. Olaiz, G. Marshall, Electrochimica Acta 319 (2019) 1002–1011
“Tissue damage in vaccination protocols based on electroporation: pH fronts and
tissue natural buffering”, M. Marino, N. Olaiz, E. Signori, F. Maglietti, C. Suárez,
L. Colombo, P. Turjanski, S. Michinski, G. Marshall, 14th International Conference
on Progress In Vaccination against Cancer PIVAC-14
“Towards an optimal dose-response relationship in electroporation-based tumor treat-
ments”, E. Luján, M. Marino, N. Olaiz, G. Marshall. 2nd World Congress on Electro-
poration and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental
Technologies
“The role of damage in reversible electroporation optimization: theory and experi-
ments in a vegetable model”, M. Marino, N. Olaiz, F. Maglietti, S. Michinski, P.
Giunta, et al., 3rd World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in
Biology, Medicine, and Food & Environmental Technologies.
“OpenEP: an open-source Simulator for Electroporation-based Tumor Treatments”,
M. Marino, E. Luján, E. Mocskos, G. Marshall, aceptado para su publicación en
Scientific Reports, Nature.
ABSTRACT:
Computational models for electroporation-based
oncological treatments
One of the great scientific challenges in the fight against cancer is the search for cheaper
solutions with fewer adverse side effects. In this context, a group of alternative therapies based on
electroporation (EP) arise. The EP is a physical phenomenon in which the application of electrical
pulses through two or more electrodes on a cell causes an increase in the permeability of the
membrane that covers it. In this way, molecules are enabled to enter the cell. There are numerous EP-
based applications in various areas of science and technology such as medicine, biotechnology, food
processing and, the environment. In medicine, the most widely used are Electrochemotherapy (ECT),
Gene Electrotransfer (GET) and Irreversible Electroporation (IRE). In this context, mathematical
and computational modeling has become a powerful tool to study andpredict the outcome of
EP-based protocols.
The application of an electric field on a tissue generates extreme values pH fronts that emerge
from the electrodes which in turn are transported by diffusive and migratory processes. These
fronts may cause undesired damage to the tissue and thus alter the efficiency of EP-based medical
treatments. In the search to counteract this effect, a phenomenon not taken into account until
now is modeled: the neutralization of the pH by the main tissue buffer system. To elucidate
the unknown as to how and to what extent this buffer attenuates the damage produced by pH
fronts, a mathematical-computational model that describes ionic transport by means of the Nernst-
Planck equation subject to the electroneutrality condition and the Butler-Volmer equations at
the domain boundaries is formulated. The computational model, which solves a highly nonlinear
system of partial derivative equations, uses finite difference method with a strongly implicit scheme
and standard relaxation methods on a non-uniform mesh. The model is validated with in vivo
experiments and it also allows the description of theoretical phenomena underlying EP that are
difficult to measure.
In this thesis, OpenEP, a specific electroporation protocol simulator for EP-based treatments,
is introduced. OpenEP, distributed under a free software license, aims at providing the academic
community with a flexible implementation to predict the evolution and optimization of various EP-
based protocols, characterizing them by their number of pulses along with their frequency, width
and amplitude. It also allows modifying the material and shape of the electrode: dimensions of the
plates or needles, number of needles, anode-cathode distance, among others. In addition, OpenEP
describes key physical quantities involved in electroporation or pulsed electric field treatments:
electric potential, electric field, electric conductivity, current density, electric current, electric char-
ge, electroporated area and, temperature. In particular, knowledge of the intensity of the electric
field, which is correlated with the electroporated tissue, helps to develop improved strategies for
planning and optimizing a given treatment. The highly efficient three-dimensional implementation
is achieved by using C ++ and OpenMP in a GNU / Linux environment.
In the search for an optimization method for EP-based protocols in terms of the number of
pulses, considering the damage, the variation of the electroporated tissue over time should be
analyzed. Optimization is based on finding the optimal dose-response relationship, that is, the
critical pulse (dose) in which electroporated tissue is maximized and damaged tissue (responses)
is minimized. The method proposed to find this optimum consists of coupling two mathematical-
computational models. The ionic pH model is used to calculate the tissue damaged over time. To
calculate the evolution of electroporated tissue, a new extended EP model is introduced based on
Laplace’s nonlinear equation and the Pennes’ bioheat equation. Also, an exponential time decay
function for the threshold is included.
iv
The results of this thesis are expected to allow the optimization of electroporation-based the-
rapies to generate more effective treatment plans with fewer adverse effects and lower economic
costs. The ultimate purpose of this work is to contribute to improving patients’ quality of life.
Palabras claves: numerical simulation, electroporation, mathematical modeling, compu-
tational modeling, gene electrotransfer, irreversible electroporation, electrochemoterapy.
This thesis is based on the following works:
“pH fronts and tissue natural buffer interaction in gene electrotransfer protocols”,
M. Marino, N. Olaiz, E. Signori, F. Maglietti, C. Suárez, S. Michinski, G. Marshall,
Electrochimica Acta 255 (Supplement C) (2017) 463–471.
“Towards an optimal dose-response relationship in gene electrotransfer protocols”, E.
Luján, M. Marino, N. Olaiz, G. Marshall, Electrochimica Acta 319 (2019) 1002–1011
“Tissue damage in vaccination protocols based on electroporation: pH fronts and
tissue natural buffering”, M. Marino, N. Olaiz, E. Signori, F. Maglietti, C. Suárez,
L. Colombo, P. Turjanski, S. Michinski, G. Marshall, 14th International Conference
on Progress In Vaccination against Cancer PIVAC-14
“Towards an optimal dose-response relationship in electroporation-based tumor treat-
ments”, E. Luján, M. Marino, N. Olaiz, G. Marshall. 2nd World Congress on Electro-
poration and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental
Technologies
“The role of damage in reversible electroporation optimization: theory and experi-
ments in a vegetable model”, M. Marino, N. Olaiz, F. Maglietti, S. Michinski, P.
Giunta, et al., 3rd World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in
Biology, Medicine, and Food & Environmental Technologies.
“OpenEP: an open-source electrical-thermal simulator for electroporation-based treat-
ments”, M. Marino, E. Luján, E. Mocskos, G. Marshall, accepted for publication in
Scientific Reports journal, Nature.
AGRADECIMIENTOS
La presente tesis fue el fruto de un intenso trabajo que no hubiese sido posible sin la
ayuda y el apoyo de muchas personas e instituciones. Por este motivo, debo agradecer:
A Guillermo Marshall, por aceptar dirigirme la tesis y trabajar a la par en cada pro-
yecto.
A Esteban Mocskos, por aceptar ser mi Consejero de Estudios y por la ayuda que me
brindó cuando se la ped́ı.
Al Departamento de Computación, por aceptarme como doctorando y darme un lugar
de trabajo los primeros años. También por permitirme ejercer la docencia.
Al Instituto de F́ısica del Plasma (INFIP), por brindarme un lugar ameno de trabajo
en los últimos años.
Al CONICET, por otorgarme la beca que hizo posible la realización de este doctorado.
A Emmanuel Luján, porque siempre estuvo presente cuando lo consulté y por acceder
gentilmente a leer esta tesis (y realizar observaciones no menores).
A Nahuel Olaiz, por apuntalarme en la primera parte del doctorado y por solventar
las dudas que tuve en la escritura de este trabajo.
A los miembros del Laboratorio de Sistemas Complejos (LSC) quienes me brindaron
su conocimiento en los temas que no son de mi dominio.
A mi familia y a mis amigos, por el apoyo que me dieron en todo momento.
Por último, aunque más importante, a Marce por ayudarme, apoyarme y aconsejarme
a lo largo de todo el doctorado.
vii
A Marce
Índice general
1.. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1. Electroporación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1. Electroquimioterapia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.2. Electroporación Irreversible . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.3. Electrotransferencia Génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.4. Otras aplicaciones médicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.1.5. Aplicaciones no médicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2. Un tratamiento no basado en Electroporación (EP): Ablación Electroĺıtica . 6
1.3. Śıntesis de la aplicación de campos eléctricos en tejidos . . . . . . . . . . . . 7
1.4. Modelos matemáticos de electroporación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.4.1. Modelo eléctrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.4.2. Modelo iónico de daño por pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.4.3. Breve reseña de modelos matemáticos . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.5. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6. Estructura del trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.. Modelo de la interacción pH-buffer en protocolos de Electrotransferencia Génica 13
2.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 13
2.2. Modelo In vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.3. Modelos matemático y computacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.3.1. Modelo Matemático . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3.2. Modelo Computacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.4. Resultados y Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.5. Conclusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.. OpenEP : un simulador electrotérmico de código abierto para tratamientos basados
en electroporación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.2. OpenEP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.3. Modelo matemático . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3.1. Ecuaciones en el dominio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3.2. Condiciones iniciales y de contorno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.4. Arquitectura e implementación del software . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.5. Ejemplos ilustrativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.5.1. Ejemplo 1: Electrotransferencia Génica (GET) con dos electrodos
de aguja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.5.2. Ejemplo 2: Electroporación Irreversible (IRE) y Electroquimioterapia
(ECT) con seis electrodos de agujas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.5.3. Ejemplo 3: GET usando electrodos con geometŕıa de placas paralelas 43
3.6. Análisis de performance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.7. Discusión e impacto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.8. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
ix
4.. Modelo de dosis-respuesta óptimo aplicado a protocolos de Electrotransferencia
Génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.2. Modelos in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.3. Modelos matemáticos y computacionales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.4. Resultados y Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
4.5. Conclusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
5.. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
6.. Trabajos Futuros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Apéndice 68
A.. Material suplementario sobre OpenEP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
A.1. Organización del proyecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
A.2. Modelo numérico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
A.2.1. Condiciones de borde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
A.3. Opciones de compilación y ejecución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
A.4. Parámetros del modelo y numéricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
1. Introducción
Según la Organización Mundial de la Salud, se estima que 9.6 millones de personas
murieron a causa de cáncer en el año 2018, lo que representa uno de cada seis fallecimientos.
Este hecho convierte a la enfermedad en la segunda causa de muerte a nivel mundial [1].
En Argentina, por su parte, según estad́ısticas del Ministerio de Salud, en el año 2018
el cáncer fue la segunda causa de muerte, con una tasa de mortalidad del 19.4 %, y la
primera en la franja etaria que va desde los 35 a los 74 años de edad [2]. Según la Agencia
Internacional de Investigación sobre Cáncer, Argentina se posiciona dentro de los páıses
del mundo con incidencia de cáncer media-alta, ubicándose a su vez en el séptimo lugar
en Latinoamérica [3].
Entre los aspectos más desafiantes para lograr un tratamiento exitoso contra el cáncer
se encuentran el manejo de metástasis a distancia y la prevención a largo plazo de la
recurrencia tumoral. Además, los tratamientos requieren de un enfoque multidisciplinario
dado que las diferentes terapias existentes pueden ser aplicadas en combinación, de manera
simultánea o secuencialmente. Las tres modalidades de tratamiento más frecuentes son la
ciruǵıa, la radioterapia y la quimioterapia, cada una de ellas con efectos adversos no
menores.
Además de los daños f́ısicos y emocionales, el cáncer representa también un problema
económico. Los importantes avances en la prevención, detección y tratamiento, junto al
envejecimiento de la población, han provocado un incremento en los costos para las dis-
tintas partes intervinientes en el sistema de salud [4,5]. Lamentablemente, el eslabón más
vulnerable de la cadena suele ser el paciente, quien tiene que lidiar con los vaivenes del
estado y los costosos seguros de salud.
En este contexto y en la búsqueda de tratamientos más económicos y menos noci-
vos para el paciente, las terapias oncológicas basadas en electroporación surgen como un
complemento o alternativa a los tratamientos tradicionales.
1.1. Electroporación
La electroporación (EP) es un fenómeno biof́ısico en el cual la aplicación de pulsos
eléctricos sobre una célula causa un incremento en la permeabilidad de la membrana que
la recubre debido a la formación de defectos a nanoescala llamados “poros” [6]. De esta
manera, a través de los poros, pueden ingresar a la célula moléculas que en condiciones
normales no podŕıan hacerlo o lo haŕıan en bajas concentraciones. Existen varios reǵıme-
nes de electroporación, que dependen principalmente de la amplitud y la duración de la
aplicación del campo eléctrico. Si la magnitud del campo es demasiado pequeña, no hay
electroporación. Inmediatamente que se sobrepasa un cierto umbral cŕıtico, la membrana
se electropora reversiblemente si el campo eléctrico aplicado no es demasiado alto. Para
campos más intensos, la electroporación es irreversible, el daño a la célula es mayor y
eventualmente termina muriendo.
La caracteŕıstica más atractiva de la electroporación es que es un fenómeno universal:
se produce en cualquier tipo de célula y en cualquier disposición (en suspensión, adheridos
a una superficie, en clusters o en un tejido). Esta universalidad ha provocado que este
1
1. Introducción 2
fenómeno tenga numerosas aplicaciones en diversas áreas, como la medicina, la biotecno-
loǵıa, el procesamiento de alimentos y el medio ambiente, entre otras [7]. En este trabajo,
se hará hincapié en las terapias médicas más desarrolladas: Electroquiomioterapia (ECT),
Electroporación Irreversible (IRE) y Electrotransferencia Génica (GET). A continuación,
una breve reseña de cada una de ellas junto a otras aplicaciones médicas y no médicas.
1.1.1. Electroquimioterapia
La ECT es una terapia de ablación tumoral local que combina electroporación rever-
sible y drogas quimioterápicas. El procedimiento de aplicación consiste en dos pasos: en
primer lugar, se administran las drogas por v́ıa local o sistémica; luego, se aplican los
pulsos eléctricos a través de dos o más electrodos insertos en la zona del tumor (ver figura
1.1). De esta manera, la electroporación es utilizada para permeabilizar la membrana de
las células tumorales y facilitar el transporte hacia su interior de fármacos citotóxicos que
en condiciones normales seŕıan poco permeables. Por esta razón, la dosis de droga necesa-
ria para una buena respuesta antitumoral es baja, lo cual provoca que los efectos adversos
sean mı́nimos [8]. Además, como la “apertura” de los poros ocurre solamente en las célu-
las tumorales bajo el efecto del campo eléctrico (el tumory su margen de seguridad), la
viabilidad del resto de tejido sano no se ve afectada. Drogas de uso t́ıpico en esta terapia
son la bleomicina y el cisplatino. La primera es muy efectiva dado su alto efecto tóxico
sobre la célula. La segunda resulta una alternativa interesante en los casos en donde sea
necesario repetidas aplicaciones del tratamiento y se quiera reducir la concentración de
la bleomicina en sangre [9]. En su conjunto, la terapia se presenta como eficaz, simple,
ambulatoria, segura y económica.
Fig. 1.1: Esquema de aplicación de la electroquimioterapia [10]. En primer lugar, la droga
es inyectada por v́ıa local o sistémica. Luego de unos minutos, se aplica un tren de pulsos
eléctricos sobre la zona del tumor. De esta manera, se permeabiliza la membrana de las
células afectadas, lo cual facilita la entrada de la droga hacia su interior. Finalmente, la
membrana retorna a su situación original y el fármaco desarrolla su efecto tóxico dentro
de la célula.
Actualmente, la ECT está siendo utilizado para el tratamiento de metástasis y tumores
1. Introducción 3
primarios en más de 130 centros oncológicos en Europa y ha sido aceptado en ĺınea con
otros tratamientos tumorales locales [11]. Además, también se utiliza en oncoloǵıa veteri-
naria, para el tratamiento de metástasis y tumores primarios [12–16]. La tasa de éxito de
ECT en esa etapa del tumor también proporciona buena evidencia para su traducción en
tratamientos de tumores menos avanzados. En Argentina, actualmente, todav́ıa no ha lle-
gado a probarse en humanos, pero existen ya varias veterinarias que aplican el tratamiento
con resultados altamente efectivos [17,18].
1.1.2. Electroporación Irreversible
La IRE es una terapia de ablación tumoral no térmica que se basa en la aplicación de
pulsos eléctricos de alta intensidad (mayores que en la ECT) en donde se supera el umbral
de electroporación reversible y se provoca un daño irreversible en las células tratadas.
Los mejores resultados fueron obtenidos utilizando electrodos de platino, 80 pulsos de 100
µs a 0.3 Hz con un campo eléctrico de 2500 V/cm. Aśı, una sesión de ablación puede
tomar unos pocos minutos. Además, al no necesitar de drogas ni de altas temperaturas,
la terapia resulta más económica. Al mismo tiempo, la IRE tiene la ventaja de lograr
una mejor preservación de estructuras vitales dentro de la zona de ablación, como vasos o
conductos biliares [19].
El primer trabajo sobre la IRE fue publicado por Davalos et al. [20] en 2005. Utilizan-
do modelos matemáticos, los autores predijeron que la IRE resultaŕıa en la ablación no
térmica de volúmenes cĺınicamente relevantes de tejido. Este trabajo teórico fue confirma-
do posteriormente por estudios experimentales in vitro utilizando cultivos celulares [21],
modelos de animales pequeños [22] y modelos de animales grandes [23] y recientemente
por los primeros estudios en humanos [24,25]. Los mecanismos exactos de la muerte celular
provocada por la IRE aún se desconocen.
Los estudios cĺınicos más recientes han investigado la seguridad y la eficacia del tra-
tamiento con IRE de carcinoma de células renales [26, 27], tumores malignos pulmona-
res [27, 28] y tumores malignos hepáticos [27, 29, 30]. Un inconveniente de la IRE es que
los fuertes campos eléctricos inducen contracciones musculares, por lo que se requiere de
anestesia especial [31].
La eficacia del procedimiento vaŕıa entre los estudios y los órganos tratados. En el
cáncer de próstata, los estudios han reportado un éxito del 100 % en la ablación tumoral
[24,25,32]. Sin embargo, hasta la fecha no se han extirpado con éxito tumores pulmonares
tratados [27, 28]. En el h́ıgado, la respuesta varió de 50 % a 98.1 % de ablación exitosa de
lesiones tumorales en diferentes estudios [27, 29, 30]. Además de los estudios en humanos,
la IRE también se ha utilizado con éxito para la ablación tumoral en medicina veterinaria
[33–35].
1.1.3. Electrotransferencia Génica
Tanto la ECT como la IRE son terapias muy efectivas a nivel local pero deficientes
a la hora de provocar efectos antitumorales a distancia, ya sea en tumores alejados o en
metástasis. La GET, otra aplicación biomédica de la electroporación, se presenta como
una alternativa para atacar esa deficiencia. El procedimiento de la GET es similar a la
ECT. La diferencia radica en el agente terapéutico: la ECT, como se dijo previamente,
emplea drogas quimioterápicas mientras que la GET utiliza moléculas de ADN (t́ıpica-
mente plásmidos). La terapia génica resultante depende del ADN inyectado: puede tener
1. Introducción 4
como objetivo inducir la muerte celular (si los pulsos se aplicaran en la zona afectada), es-
timular al sistema inmune para que actúe contra el tumor y su metástasis o bien activar la
respuesta inmune e inducir un efecto preventivo mediante la administración de ant́ıgenos
tumorales. Esta última terapia es denominada vacuna de ADN y del mismo modo puede
ser utilizada para proteger al organismo de diversas enfermedades infecciosas. Por otra
parte, la GET tiene una importante ventaja: elimina la necesidad de utilizar un vector
viral 1, que es más costoso y más dif́ıcil de preparar y guardar. Los plásmidos, en cambio,
resultan ser fáciles de manipular y producir a gran escala [36].
En la actualidad, más de 80 ensayos cĺınicos han utilizado la electroporación como
método de administración de plásmidos, en donde siete de ellos ya han alcanzado la fase
II [37].
1.1.4. Otras aplicaciones médicas
Administración transdérmica de fármacos
La piel funciona como una barrera protectora frente a entornos variables y hostiles.
Es decir, nos protege de amenazas ambientales de naturaleza qúımica, f́ısica o biológica.
La piel también sufre una regeneración y reparación continuas y está compuesta de varias
capas: el estrato córneo, la epidermis viable, la dermis y el tejido subcutáneo (hipodermis).
Debido a su tamaño y accesibilidad, la piel se presenta como una v́ıa de entrada conve-
niente para las drogas. En particular, la administración transdérmica tiene el beneficio de
introducir medicamentos que no son adecuados para la administración intravenosa u oral,
y puede superar muchas de las desventajas de otras v́ıas de suministro. Sin embargo, la
administración transdérmica a menudo ofrece un flujo limitado debido principalmente a
la capa más externa de la piel: el estrato córneo. La superación de esta barrera se pue-
de lograr mediante diferentes métodos de mejora, tanto pasivos como activos [38], siendo
uno de ellos la electroporación [39,40]. Se ha demostrado que la electroporación crea v́ıas
acuosas a través del estrato córneo y por lo tanto mejora la administración transdérmica
del fármaco.
En general, aumentar la amplitud, la duración y el número de pulsos da como resultado
una mayor permeabilidad del estrato córneo, lo que permite un mejor transporte del
fármaco [41]. En consecuencia, el flujo molecular se mejora hasta alcanzar un valor máximo
más allá del cual el aumento de los parámetros del pulso tiene un efecto insignificante sobre
el flujo [42]. La electroporación se ha utilizado con éxito para mejorar la permeabilidad
de la piel para moléculas con diferente tamaño (moléculas pequeñas, protéınas, péptidos y
oligonucleótidos), incluidas drogas como el fentanilo, la insulina y el metotrexato [39,43,44].
Ablación por medio de Nanopulsos
El uso de campos eléctricos pulsantes de alta intensidad y durante peŕıodos del orden
de los nanosegundos (nsPEF) es otro tipo de electroporación tisular que ha ganado im-
pulso en los últimos años. La aplicación de nanopulsos no solo permeabiliza la membrana
celular (con poros más pequeños que los generados por la GET, la ECT o la IRE) sino
también estructuras intracelulares. Una de sus consecuencia es la liberación masiva de
calcio al citoplasma, lo que desencadena mecanismos de muerte celular [45]. La terapia se
1 Transportea través de un virus.
1. Introducción 5
encuentra actualmente en fase pre-cĺınica y ha sido utilizado exitosamente para eliminar
principalmente tumores subcutáneos en ratones [46].
1.1.5. Aplicaciones no médicas
En el campo de la conservación de alimentos, los métodos utilizados actualmente en
la industria se basan en la inactivación microbiana. Esta técnica permite inhibir la ac-
tividad (incluyendo su división, crecimiento y śıntesis) de sustancias tóxicas que pueden
representar una amenaza seria para la salud. Hoy en d́ıa, el método más difundido in-
cluye en su proceso la utilización de altas temperaturas, por lo cual generalmente se ven
afectados tanto los nutrientes como el sabor, disminuyendo de esta manera la calidad de
los alimentos [47]. En la inactivación microbiana por electroporación, en cambio, solo se
produce un calentamiento suave, de manera que el sabor y/o el valor de los nutrientes
no se ven afectados [48]. También, la electroporación irreversible es adecuada para la des-
contaminación bacteriana de aguas residuales hospitalarias, en donde también erradica
las cepas resistentes a los antibióticos, evitando aśı la propagación de bacterias al medio
ambiente. [49]
En cuanto a la extracción de biomoléculas (denominado electroextracción), la EP puede
resultar una alternativa a los procesos actuales de extracción por v́ıas f́ısicas o qúımicas,
en los cuales puede verse afectada la estructura o integridad de las biomoléculas extráıdas.
Por ejemplo, la extracción de azúcar de la remolacha azucarera [50, 51] es una aplicación
de este procedimiento.
La electroporación también ha demostrado ser un método de secado energéticamente
eficiente para la biomasa verde, que sirve como fuente de material para los biocombustibles.
El ahorro de enerǵıa comparado al procedimiento de prensado convencional es más del
50 % [47].
Por último, la transformación genética (también denominada electrotransformación)
es un proceso similar a la GET pero con diferentes objetivos: la inyección de ADN en un
microorganismo puede convertir a este en una fábrica de biomoléculas transgénicas o bien
puede ser de utilidad para adaptarlo a un nuevo ambiente [49].
A modo de resumen esquemático, la figura 1.2 sintetiza diferentes aplicaciones de la
electroporación.
Muerte
Celular
Ablación
Pasteurización
Electroquimioterapia
Biotecnología
Vacunas de ADN
Terapias génicas
Introducción de
moléculas
pequeñas
Extracción de
moléculas
Introducción de
moléculas
grandes
Exposición a un
campo eléctrico
irreversible
reversible
Fig. 1.2: Esquema de diferentes aplicaciones de la electroporación
1. Introducción 6
1.2. Un tratamiento no basado en EP: Ablación Electroĺıtica
La Ablación Electroĺıtica (EA) de tumores, también llamada tratamiento electroqúımi-
co de tumores (EChT), es un método de ablación no térmico que consiste en la aplicación
de un campo eléctrico constante de baja intensidad a través de dos o más electrodos in-
sertos en la zona del tumor. A diferencia de los tratamientos basados en EP mencionados
anteriormente, en la EA no hay pulsos eléctricos sino que la fuente de corriente es constan-
te. Se aplican dosis de carga (10 C - 50 C) a intensidad fija (1-200 mA) y baja tensión. De
esta manera, las células tumorales no se electroporan y el mecanismo terapéutico se explica
por los frentes de pH extremo que se generan a ráız de las reacciones electroqúımicas que
ocurren en los electrodos [52–54]. En efecto, la aplicación del campo eléctrico produce una
acidificación anódica y una basificación catódica, hechos que desencadenan que frentes de
pH se transporten desde los electrodos a través del tumor. Además, al utilizarse corrientes
y voltajes muy bajos, la instrumentación que se requiere es menos costosa y más sencilla
que la necesaria para las terapias basadas en EP. Otra ventaja significativa es que no
se produce resistencia ante aplicaciones reiteradas del tratamiento, como śı puede ocurrir
con las drogas quimioterápicas [55]. De este modo, la EA se presenta entonces como una
terapia mı́nimamente invasiva, segura, eficaz y económica. Puede ser utilizada junto con
quimioterapia o radioterapia o bien previo a una intervención quirúrgica para reducir el
tamaño del tumor. Un esquema de su funcionamiento se presenta en la figura 1.3.
+ -
Fig. 1.3: Esquema de funcionamiento de EA sobre un tumor. El ánodo (izquierda) genera
un frente ácido (ćırculo amarillo) mientras que el cátodo genera un frente básico (ćırculo
violeta). Ambos frentes avanzan y necrosan todo el tejido a su paso.
Entre las desventajas de la EA se encuentra la falta de selectividad con respecto a
terapias como la ECT o la IRE. Efectivamente, la EA afecta tejido sano dado que la
difusión de los frentes de pH no es homogénea en una superficie de por śı irregular como
es un tumor. Además, el pH extremo genera inflamación y dolor en la zona afectada.
En los últimos años, la terapia ha sido objeto de activa investigación en páıses como
China [56–59], Alemania [60,61], Gran Bretaña [62–64], EEUU [65], Corea [66], Brasil [67] y
Cuba [68–71]. En particular, China es el páıs que más casos cĺınicos ha efectuado (alrededor
de 15 mil) obteniendo una tasa de respuesta positiva al tratamiento del 78 % [72–74].
1. Introducción 7
Recientemente se ha mostrado que una combinación de EP y EA muestra significativas
ventajas en comparación con la aplicación en forma separada de EA o EP [75]. De esta
manera, hay posibilidades de generar una importante sinergia entre ambas terapias y su
estudio conjunto puede dar luz al desarrollo de innovadores tratamientos.
1.3. Śıntesis de la aplicación de campos eléctricos en tejidos
En consonancia a lo ya descripto, la figura 1.4 muestra una representación esquemática
de los principales efectos que surgen de la combinación de amplitud y duración de campo
eléctrico (sin escala). Aśı, si la magnitud del campo eléctrico o la duración del pulso es
demasiado pequeña, no habrá efectos. Tan pronto como se sobrepasa un cierto voltaje
local o umbral, las membranas celulares se permeabilizan de manera tal que si este voltaje
no es demasiado alto la permeabilización es reversible. Para voltajes más altos, en cambio,
la permeabilización es irreversible, es decir, las células se dañan de manera permanente
y, finalmente, mueren. Si los parámetros del pulso son demasiado intensos (en términos
de tiempos prolongados y voltajes altos), el efecto Joule inducido por el campo eléctrico
conduce a la destrucción de las células debido a efectos térmicos. En cambio, para volta-
jes bajos, si la longitud del pulso es muy larga, se produce un daño sustancial debido al
fenómeno de electrólisis subyacente (EA).
T
E
100 s
1 kV/cm
20 ms
200 V/cm
1 V/cm
20 min
2.5 kV/cm
A
Duración del pulso
C
a
m
p
o
 e
lé
c
tr
ic
o
20 ns
15 kV/cm
Fig. 1.4: Relación esquemática entre la intensidad del campo eléctrico y la longitud del
pulso para los distintos tratamientos y modos de electroporación (no representada en
escala).
1. Introducción 8
1.4. Modelos matemáticos de electroporación
En el contexto de la EP, como veremos a continuación, los modelos matemáticos descri-
ben diversos fenómenos acoplados en sistemas biológicos como células, tejidos y órganos.
Estos sistemas generalmente se basan en geometŕıas bastante complejas con propiedades
de tejido no homogéneas y condiciones de borde avanzadas que impiden una resolución
anaĺıtica. Por lo tanto, en lugar del enfoque anaĺıtico, la solución aproximada de las ecua-
ciones que componen modelos matemáticos complejos es obtenida mediante el modelado
numérico. En esta tesis, nos referiremos a un término más amplio, como es el modelo
computacional. Éste abarca tanto al modelo numérico como a la implementación y opti-
mización. De esta manera, lo definimos como al conjunto de métodos, algoritmos y optimi-
zaciones necesarias parapoder implementar un modelo matemático en una computadora.
Un buen modelo matemático y computacional validado con resultados experimentales es
una herramienta sólida para el estudio y la predicción de los fenómenos observados.
1.4.1. Modelo eléctrico
Los resultados experimentales y los modelos f́ısicos, matemáticos y computacionales de
electroporación que se encuentran en la bibliograf́ıa demuestran que una de las condiciones
más importantes para el éxito de las aplicaciones de electroporación como la GET, la ECT
o la IRE, es que haya una cobertura precisa del tejido a tratar con un campo eléctrico
suficientemente intenso. La electroporación celular ocurre cuando el campo eléctrico apli-
cado externamente está por encima de un valor de campo eléctrico umbral. La célula se
expone al campo eléctrico a través de la aplicación de pulsos eléctricos que establecen una
diferencia de potencial inducida en la membrana celular, es decir, el voltaje transmem-
branal. La membrana celular se vuelve permeable cuando el voltaje transmembranal, la
suma de la diferencia de potencial inducida y el potencial de membrana en reposo, excede
cierto valor cŕıtico. El modelo estándar de EP, o modelo de formación de poros, describe
el fenómeno de electroporación como una formación de poros acuosos debido al voltaje
transmembranal inducido por el campo eléctrico aplicado. Los poros acuosos se establecen
luego de la transición del estado hidrofóbico al hidrof́ılico y permanecen estables por un
tiempo determinado. Este estado es reversible siempre que el voltaje aplicado permanezca
debajo de un valor cŕıtico; superado este valor, se produce un estado irreversible de la
membrana. La relación entre el campo eléctrico aplicado E y la diferencia de potencial
transmembranal ∆V en el caso simple de una celda esférica se puede describir en forma
anaĺıtica por la ecuación de Schwan [76].
∆V =
3
2
Er cos(ψ)
donde r es el radio de la celda y ψ es el ángulo polar medido desde el centro de la celda
con respecto a la dirección del campo. Esta ecuación muestra que el voltaje transmembra-
nal inducido es proporcional al campo eléctrico y al radio de la celda. Para células de forma
irregular, aśı como para células cercanas entre śı, el voltaje transmembranal inducido no
puede ser derivado anaĺıticamente, por lo que se deben utilizar métodos numéricos.
La electroporación no está determinada únicamente por la intensidad de campo eléctri-
co o la amplitud del pulso, sino también por la duración de la exposición al campo (texp):
texp = Tp Np
1. Introducción 9
donde Tp es la duración de un solo pulso eléctrico y Np es la cantidad de pulsos. Cada
aplicación espećıfica de electroporación requiere diferentes configuraciones de parámetros
de pulsos, pero la amplitud de pulso E, la longitud de pulso Tp y el número de pulsos son los
parámetros que poseen el mayor impacto en el resultado de la electroporación. Además,
estos parámetros deben ajustarse para el tipo de célula, densidad celular y geometŕıa
de electrodos. Los valores óptimos de los parámetros del pulso eléctrico dependen de la
sensibilidad a los pulsos de las células o el tejido. Es por este motivo que en la literatura
se presentan valores distintos de umbral de campo eléctrico, ya sea para la electroporación
reversible como para la irreversible.
Los umbrales reversibles e irreversibles se determinan principalmente mediante la su-
perposición de la distribución del campo eléctrico obtenida por modelos matemáticos con
observaciones experimentales. No hay muchos resultados experimentales sobre el umbral
reversible in vivo para diferentes tejidos. Una de las estimaciones más conocidas del um-
bral reversible (460 V/cm) se realizó en un h́ıgado de conejo expuesto a pulsos eléctricos
con (texp) de 8 × 100 µ s [77, 78]. La estimación se obtuvo superponiendo los resultados
histológicos con la distribución del campo eléctrico obtenida por el modelo numérico de
tejido que incorporaba la conductividad eléctrica dependiente del campo eléctrico. Hay
más observaciones reportadas disponibles para umbrales irreversibles que vaŕıan de 500 a
1300 V/cm. Del mismo modo que en los estudios in vitro, es importante reconocer que
estos valores dependen de texp, es decir, del número y la duración de los pulsos aplicados.
La distribución del campo eléctrico en el tejido biológico se establece cuando la corriente
eléctrica pasa a través del tejido. En electroporación convencional, la corriente eléctrica
se establece mediante la aplicación de pulsos eléctricos a través de electrodos en contacto
con el tejido. Esto se puede realizar a través de electrodos de placas planas paralelas
no invasivos, que abarcan el tejido, o con electrodos de aguja invasivos, insertos en el
tejido. En ambos casos, la corriente eléctrica que pasa a través del tejido se distribuye
tomando el camino más corto y fácil, entre los puntos de mayor diferencia de potencial.
En general, la distribución de la corriente eléctrica está representada por la cantidad de
corriente eléctrica por unidad de área, también conocida como densidad de corriente. En
términos de propiedades eléctricas de tejido, las áreas con mayor densidad de corriente
también son áreas con mayor conductividad eléctrica. Los tejidos como los músculos,
tienen una conductividad más alta, mientras que los tejidos adiposos o los huesos tienen
una conductividad menor.
Además de la distribución de densidad de corriente, la distribución de campo eléctrico
también queda definida por la conductividad eléctrica, pero de manera opuesta; el campo
eléctrico es mayor en áreas de baja conductividad y viceversa. Otra caracteŕıstica que
también define la distribución de campo eléctrico es la geometŕıa del electrodo. Por lo tanto,
para una predicción válida de la intensidad y distribución del campo eléctrico, es necesario
introducir modelos matemáticos y computacionales. Estos modelos han devenido cruciales
para determinar la distribución del campo eléctrico en los tejidos cuya conductividad
eléctrica aumenta debido a la aplicación de pulsos eléctricos.
El modelo matemático más sencillo que describe la distribución del campo eléctrico
estacionario en una célula o tejido se reduce a considerar la ecuación de Laplace del estado
estacionario del campo eléctrico:
∇ (σ ∇V ) = 0
donde σ es la conductividad eléctrica del tejido (tema que se discute más adelante)
1. Introducción 10
y V es el potencial electrostático. La distribución del campo eléctrico E es entonces el
gradiente del potencial electrostático:
E = −∇V
Los métodos numéricos t́ıpicos utilizados para resolver el modelo matemático anterior
son los métodos de diferencias finitas y de elementos finitos. En este trabajo, se utiliza el
método de las diferencias finitas que consiste en reemplazar un cociente diferencial por un
cociente en diferencias pequeñas.
Por último, para una simulación realista de modelos de electroporación es importante
incluir el comportamiento no lineal de los tejidos biológicos, en particular, la no linealidad
de la conductividad eléctrica del tejido. Efectivamente, el campo eléctrico local en los
tejidos se ve afectado por los pulsos aplicados, que dependen de la conductividad eléctrica
local, y viceversa, la electroporación aumenta la conductividad y, en consecuencia, altera
la distribución de campo eléctrico. Además, el campo eléctrico aplicado debe alcanzar
umbrales de electroporación reversible (Erev) para inducir un aumento de la conductividad.
Durante la aplicación del pulso, este aumento es permanente y la conductividad eléctrica
no puede disminuir a su valor basal, incluso en el caso en que el campo eléctrico caiga por
debajo de Erev. Esto hace que sea dif́ıcil caracterizar adecuadamente el modelo numérico
del tejido tratado, e implica que la predicción de la cobertura del tejido tratado con un
campo eléctricopreciso es una tarea muy compleja, ya que se basa principalmente en la
precisión de la conductividad eléctrica del tejido tratado utilizado en el modelo numérico.
Dado que hay una carencia de datos experimentales de propiedades de tejidos espećıficos
para utilizar en modelos numéricos capaces de predecir una distribución eléctrica precisa,
es de gran importancia tener un método de monitoreo directo que permita la medición
sobre la muestra de la intensidad del campo eléctrico aplicado. El modelo vegetal como la
papa (entre otros) es ideal para este fin ya que la misma se oscurece luego de varias horas
de tratada dejando una perfecta impronta de la magnitud y extensión del campo eléctrico
aplicado.
1.4.2. Modelo iónico de daño por pH
Como se analizará en los caṕıtulos siguientes, todo protocolo de electroporación lleva
impĺıcito un daño no deseado producido por efectos de electroporación irreversible, de
temperatura, de cambios de pH debidos a los productos de la reacción de la electrólisis
subyacente y de especies reactivas del ox́ıgeno (ROS). Aqúı mencionamos brevemente los
daños producidos por la presencia de pH con valores extremos en el contexto de protocolos
de EA y su extensión con el daño por pH existente en protocolos basados en EP.
En la aplicación de los protocolos de EA, la teoŕıa y las mediciones experimentales
demuestran que una condición inicial con pH casi neutro entre electrodos evoluciona hacia
frentes extremos alcalinos en el cátodo y ácidos en el ánodo que se mueven uno hacia el otro,
mediando una región de pH biológico entre ellos. El modelo fenomenológico estándar de EA
atribuye el daño en el tejido principalmente a estos frentes de pH extremo. La extensión de
dicho daño en un momento dado se define como la región del tejido sometida a frentes de
pH por encima de un umbral de pH básico y por debajo de un umbral de pH ácido, donde
estos valores provienen de mediciones experimentales. Íntimamente relacionado, el modelo
estándar matemático de EA es el resultado de varias simplificaciones, principalmente, que
el tejido es visto como un conductor iónico y la ablación electroĺıtica como un proceso
1. Introducción 11
de transporte iónico (de las especies qúımicas existentes o generadas por la electrólisis)
dependiente del tiempo bajo la condición de electroneutralidad. Con estas simplificaciones,
el transporte iónico se describe mediante la ecuación de Nernst-Planck:
∂CB
∂t
= DB ∇2 CB︸ ︷︷ ︸
Difusión
+
zB
|zB|
uB∇ (CB ∇φ)︸ ︷︷ ︸
Migración
+ RB︸︷︷︸
Producción
donde CB es la concentración de la especie B, φ es el potencial electrostático, DB, zB
y uB son el coeficiente de difusión, el número de carga (con su signo) y la movilidad de
la especie B, respectivamente. RB representa la producción de la especie B proveniente
de las reacciones qúımicas del electrolito. Más detalle sobre este modelo se brindará en el
siguiente caṕıtulo.
De la misma manera que en la EA, en los protocolos basados en EP se ha demostrado
mediante teoŕıa y experimentos la aparición inmediata y significativa de frentes de pH que
emergen de ambos electrodos, dando lugar a regiones de tejido dañado por cambios de pH.
Se da cuenta de este fenómeno en las referencias presentadas en la siguiente subsección.
1.4.3. Breve reseña de modelos matemáticos
A continuación, se presenta una breve reseña de la modelación matemática y compu-
tacional de los protocolos basados en la EP. Los métodos más utilizados para el modelado
son diferencias finitas y elementos finitos, haciendo uso de programas ad hoc o de paquetes
de software como COMSOL o Matlab.
En cuanto a los modelos que calculan variables eléctricas, inicialmente se considera-
ba la conductividad constante basada en las caracteŕısticas del tejido, pero la evidencia
del cambio significativo de la conductividad durante la electroporación llevó a incluir una
conductividad no lineal que primero depend́ıa del campo eléctrico [34,78–80]. Un trabajo
pionero, [81], presenta un modelo en elementos finitos para determinar el voltaje trans-
membranal en células de forma irregular basadas en imágenes microscópicas. En [82], se
estudia, también mediante el método de elementos finitos, los efectos de la temperatura en
protocolos IRE en función del número de pulsos. Alĺı, a la ecuación de Laplace expuesta
en la subsección 1.4.1 se le suma la ecuación de biocalor de Pennes para el cálculo de la
distribución de temperatura (modelo que se desarrollará en el caṕıtulo 4). En [83] se utiliza
una extensión del modelo estándar de EP en donde la conductividad eléctrica es función,
entre otras variables, del número de pulsos. Por último, mencionaremos el trabajo [84]
dado que alĺı se introduce una extensión del modelo estándar que considera significativos
fenómenos asociados a la EP: la capacidad eléctrica del tejido, la electroporación de la
membrana celular y la relajación y el cierre de los poros entre los pulsos.
Los modelos de daño por pH en el contexto de EP se basan en la analoǵıa eléctrica
existente entre la EA y los protocolos basados en EP y se rigen por las mismas ecuaciones
de transporte iónico descriptas precedentemente. Aśı, en [85] se introduce el primer modelo
que analiza el rol de pH en protocolos de ECT. Mediciones experimentales de los frentes de
pH se exponen en [86]. Por ultimo, en [87] se analiza, a través de modelos computacionales,
la eficiencia de GET asociada al área de tejido dañado inducida por los frentes de pH.
1. Introducción 12
1.5. Objetivos
El objetivo principal de esta tesis es el estudio y optimización de protocolos basados en
la electroporación a través de modelos matemático-computacionales validados con medi-
ciones experimentales. Para ello, se busca profundizar el conocimiento de los mecanismos
bioelectroqúımicos que subyacen a la EP. Más espećıficamente, investigar el rol del pH en
protocolos de electrotransferencia génica y estudiar y describir el comportamiento de va-
riables electrotérmicas. A partir de dichos análisis, se propone desarrollar una plataforma
y una metodoloǵıa para optimizar protocolos de electroporación en función del número de
pulsos, que considere tanto el daño por pH como la extensión de tejido electroporado.
1.6. Estructura del trabajo
En el caṕıtulo 2, se presenta un modelo matemático y computacional con el objetivo de
estudiar los efectos del pH en protocolos de GET con un buffer bicarbonato. En el caṕıtulo
3, se desarrolla un modelo computacional tridimensional a partir del modelo matemático
estándar de EP. En el caṕıtulo 4, se combinan los modelos de los dos caṕıtulos previos
con el objetivo de analizar la evolución del tejido electroporado y del tejido dañado por
pH con el correr de los pulsos. Se propone también una metodoloǵıa para encontrar la
relación dosis-respuesta óptima en donde se minimice el daño por pH y se maximice el
tejido electroporado.
2. Modelo de la interacción pH-buffer en
protocolos de Electrotransferencia Génica
2.1. Introducción
Al someter un tejido a una diferencia de potencial eléctrico, la enerǵıa eléctrica es
transformada en enerǵıa qúımica a través de reacciones electroqúımicas que ocurren en
los electrodos. Mediante ellas, se consumen sustancias disueltas en el tejido a la vez que
se producen otras nuevas. Las especies iónicas generadas en el ánodo y en el cátodo son
transportadas principalmente por difusión, debido a los gradientes de concentración, y por
migración, debido a los gradientes de potencial. La corriente circulante (en este caso, iones)
se moviliza principalmente a través del ĺıquido intersticial, lo cual puede comprobarse dado
el efecto electroosmótico observado durante la aplicación del campo eléctrico. Esto implica
que el agua se mueve desde el lado positivo hacia el negativo. De esta manera, la zona del
ánodo tiende a deshidratarse a la vez que se acumula agua en las cercańıas del cátodo[88].
Además, debido a las reacciones en los electrodos que se verán más adelante, se produce
una acidificación en la zona del ánodo y una alcalinización en la zona del cátodo.
La presencia de frentes de pH con valores extremos debido a la electrólisis que ocurre
durante la aplicación de la GET es un fenómeno ya conocido. Estos frentes producen daño
en las células y en los plásmidos, en donde el ADN puede ser seriamente afectado por el
pH. La desnaturalización de los plásmidos ocurre cuando se los expone a un medio alcalino
cuyo valor de pH está por encima de 8.4 o un medio ácido cuyo valor está por debajo de
4.5. De hecho, a un pH=12.5 los plásmidos son desnaturalizados de forma permanente en
menos de 1 segundo [89–91]. Por otro lado, la muerte celular sucede cuando se la expone a
un medio alcalino con pH ≥ 9 o a uno ácido con pH ≤ 5.5 [92]. En [86] se mostró que, pese
a la presencia de los sistemas buffer (mecanismo que neutraliza variaciones bruscas de pH),
cambios significativos de pH ocurren cuando se aplican protocolos GET. Por ejemplo, se
observó que inmediatamente después de la aplicación de dicho protocolo (usando electrodos
superficiales en un modelo ex vivo), los cambios de pH duraron varios minutos. En [87],
un análisis teórico junto con mediciones experimentales arrojaron resultados que afirman
que en un modelo in vivo (una ventana en el pliegue cutáneo dorsal de un ratón) existen
frentes de pH que emergen de ambos electrodos y que son significativos e inmediatos,
demostrando de esta manera la presencia de daño.
En cuanto a los resultados teóricos, los trabajos de Nilsson et al. [52, 93–95] fueron
pioneros en el estudio del daño por pH en protocolos de EA. En el primero de estos
modelos, el tejido fue tratado como una solución de cloruro de sodio. En el segundo y
el tercero, el sistema buffer fue tenido en cuenta y en un cuarto modelo se agregó el
transporte del cloruro y de especies cloradas. Posteriormente, en [85] estudió el mismo
fenómeno para protocolos de ECT. Sin embargo, pese a que estos trabajos modelaron los
efectos electroĺıticos en el daño tisular, la presencia del sistema buffer no fue estudiada
para protocolos de GET. De esta manera, queda abierta la incógnita sobre cómo y en qué
medida el buffer atenuaŕıa el daño debido a los frentes de pH.
El objetivo de este caṕıtulo es profundizar nuestra comprensión del rol del pH en el daño
tanto en el tejido como en los plásmidos, por lo tanto, en la eficiencia de los tratamientos
13
2. Modelo de la interacción pH-buffer en protocolos de Electrotransferencia Génica 14
de GET. Para ello, se presenta un modelo matemático-computacional y uno experimental
(in vivo). El primero consta de un análisis de la interacción del pH con el buffer usando
las ecuaciones de Nernst-Planck para el transporte iónico, asumiendo un tejido con un
sistema buffer de bicarbonato. El segundo describe el set-up experimental con el cual se
contrastan los resultados teóricos. Por último, se sugiere formas de minimizar el daño en
GET de manera de optimizar la eficiencia del tratamiento.
El presente caṕıtulo está basado en el art́ıculo “pH fronts and tissue natural buffer
interaction in gene electrotransfer protocols” [96]. Avances previos fueron mos-
trados en [97].
2.2. Modelo In vivo
La medición del pH fue hecha en un modelo in vivo introducido en [87]. Este modelo
consiste en una ventana transparente de plástico implantada en el pliegue cutáneo dorsal
de un ratón. Los experimentos consistieron en la aplicación de pulsos eléctricos con dos
electrodos de aguja insertados a través de la piel con una separación de 2 mm entre
ambos. Dos protocolos diferentes fueron utilizados: el primero consistió en 10 pulsos con
una duración de 20 ms cada uno a 1 Hz y con voltajes de 100, 200 y 300 V/cm; el segundo
constó de 10 pulsos con una duración de 10 ms cada uno a 10 Hz y voltajes de igual
intensidad. La figura 2.1, en la parte superior, muestra el setup experimental en donde se
puede observar la cámara, el espejo, los objetivos, el ratón con la ventana transparente y
el generador de pulsos cuadrados BTX ECM 830 (Harvard Apparatus, USA). En la parte
inferior, se presentan las coordenadas espacio-tiempo elegidas, la orientación del campo
eléctrico y las distintas etapas en el análisis de las imágenes.
El avance de los frentes de pH fue grabado con una cámara Casio ex-fh25 (30 fps,
abertura 33 ms y resolución de 1280 x 720). El indicador de pH (rojo fenol, tanto para el
frente ácido como el básico) fue suministrado superficialmente previo a la grabación. Con la
aplicación de los pulsos eléctricos, el indicador vira y se produce un cambio de color que es
registrado por la cámara. El análisis de cada frame del video se esboza en la parte inferior
de la figura 2.1. Los pasos para el tratamiento de las imágenes se exhiben de izquierda a
derecha. El primer esquema es un corte longitudinal en dos dimensiones que se muestra
apilado de arriba hacia abajo en el tiempo. Alĺı se representa en amarillo y en violeta el
avance de los frentes ácido y básico, respectivamente. Luego, se trazó una ĺınea entre el
centro de los electrodos en donde se registró sobre ella la variación de color producida por
el indicador de pH. Posteriormente, las ĺıneas fueron apiladas obteniéndose la imagen en
el espacio-tiempo (RGB x-tiempo) la cual abarca, de arriba hacia abajo, la duración del
experimento. Dado que el color del indicador de pH contrastó mejor en el canal verde, éste
fue elegido como el único componente para el análisis. Usando la herramienta de detección
de bordes del ImageJ, se determinó la distancia al ánodo o al cátodo desde el punto donde
exist́ıa un cambio abrupto de color. Esta distancia definió la posición del frente de pH en
un momento determinado y permitió reconstruir su trayectoria. Las medidas se calibraron
con una ret́ıcula (Graticules Ltd. Tonbridge, Kent). Los animales fueron mantenidos de
acuerdo con las regulaciones y estándares actuales de la National Institutes of Health
(NIH). Se diseñaron los protocolos experimentales en concordancia con las regulaciones
del comité para el cuidado y uso de los animales de laboratorio (CICUAL).
2. Modelo de la interacción pH-buffer en protocolos de Electrotransferencia Génica 15
 
Fig. 2.1: Arriba: Set-up experimental mostrando la cámara, el espejo, los objetivos, el
ratón con la ventana transparente y el generador de pulsos cuadrados BTX ECM 830
(Harvard Apparatus, USA). Abajo: las coordenadas espacio-tiempo elegidas, la orientación
del campo eléctrico y las distintas etapas en el análisis de las imágenes: corte longitudinal
apilado verticalmente en el tiempo, x-tiempo RGB, x-tiempo en el canal verde y trayectoria
de los frentes de pH.
2.3. Modelos matemático y computacional
Como se mencionó en la sección 2.1, los iones producidos por las reacciones electro-
qúımicas en los electrodos son transportados principalmente por el espacio intersticial.
Por este motivo, Nilsson et al. [93], en su primera aproximación, modelaron el tejido como
una solución de cloruro de sodio (NaCl) a concentración fisiológica en agua (pH = 7).
Esta aproximación toma en consideración el hecho de que el NaCl es la sal de mayor
concentración en el ĺıquido extracelular, compuesto fundamentalmente por H2O. De esta
manera, el modelo analiza el transporte de cuatro especies iónicas: H+, OH−, Cl− y Na+.
Luego, en [53] se extendió el modelo considerando electrodos próximos (ánodo y cátodo
distanciados por un espacio pequeño) y analizaron el comportamiento de los frentes de pH
2. Modelo de la interacción pH-buffer en protocolos de Electrotransferencia Génica 16
anódicos y catódicos en protocolos de EA y ECT. A su vez, el avance de estos frentes se ve
limitado por la acción de los sistemas buffer. Estos son la primera ĺınea de defensa frente
a los cambios de pH de los ĺıquidos corporales, entre los que sedestacan el sistema fosfato,
el sistema de protéınas y el sistema bicarbonato, siendo este último quien predomina en el
plasma sangúıneo y en el ĺıquido intersticial [98]. Por esta razón, en dos trabajos sucesivos,
primero en el ánodo y luego en el cátodo, Nilsson et al. incorporaron a su modelo el sistema
buffer bicarbonato agregando tres nuevas especies qúımicas: HCO−3 , CO2 y CO
2−
3 .
Los modelos que se presentan a continuación conjugan los trabajos mencionados con
el objetivo de describir el rol del pH en el daño provocado por un protocolo GET sobre el
set-up experimental descripto en la sección 2.2. Las variaciones de pH se obtienen a través
de la solución de las ecuaciones de Nernst-Planck las cuales describen el transporte iónico
entre ambos electrodos de las siete especies qúımicas consideradas: H+, OH−, Cl−, Na+,
HCO−3 , CO2 y CO
2−
3 . Aunque la distribución del campo eléctrico es un fenómeno en tres
dimensiones, para simular la ecuación de Nernst-Planck se usa una aproximación en una
dimensión en el cual el campo eléctrico vaŕıa sobre la distancia ánodo-cátodo (la ĺınea que
une el centro de ambos electrodos, ver la parte inferior de la figura 2.1).
2.3.1. Modelo Matemático
Como se mencionó, el tejido se trata como una solución de cloruro de sodio con un
sistema buffer bicarbonato. Las reacciones electroqúımicas que se consideran en el dominio
(el electrolito) se las caracteriza en tres grupos: aquellas que se encargan de neutralizar el
pH ácido, las que hacen lo propio con el pH básico y la reacción de protólisis del agua. El
primer grupo se encuentra representado por las siguientes reacciones:
H+ + HCO −3
k1,f−−−⇀↽−−
k1,b
H2CO3 (2.1)
H2CO3
k2,f−−−⇀↽−−
k2,b
CO2(aq) + H2O (2.2)
donde k1,f , k2,f y k1,b, k2,b representan las constantes de velocidad forward y backward,
respectivamente.
El sistema buffer de bicarbonato funciona de manera tal que cuando el tejido es some-
tido a una fuerte acidificación, el exceso de protones (H+) reacciona con el bicarbonato
(HCO−3 ), desplazando las reacciones 2.1, 2.2 hacia la derecha. El hecho de que las cons-
tantes k1,f y k1,b sean muy grandes (k1,f del orden de 5 · 1010 M−1s−1 y k1,b del orden
de 1 · 107 s−1) motiva la asunción de que la reacción 2.1 está cerca del equilibrio. De esta
manera, se puede reducir el esquema de reacciones presentado anteriormente a una sola
reacción:
H+ + HCO −3
k3,f−−−⇀↽−−
k3,b
CO2(aq) + H2O (2.3)
El segundo grupo, encargado de neutralizar el pH básico, se encuentra caracterizado
por las siguientes reacciones:
OH− + CO2(aq)
k4,f−−−⇀↽−−
k4,b
HCO −3 (2.4)
2. Modelo de la interacción pH-buffer en protocolos de Electrotransferencia Génica 17
OH− + HCO −3
k5,f−−−⇀↽−−
k5,b
CO 2−3 + H2O (2.5)
Cuando hay una cantidad excesiva de OH− en el tejido, su combinación con CO2 forma
HCO−3 y la reacción con HCO
−
3 genera H2O y CO
2−
3 , neutralizando aśı la alcalinidad en
el medio.
Además de las mencionadas, también se incluye la reacción de equilibrio de disociación
del agua:
H+ + OH−
k6,f−−−⇀↽−−
k6,b
H2O (2.6)
En cuanto a los electrodos (los bordes), las principales reacciones qúımicas que ocurren
en su superficie dependen fundamentalmente del material del cual estén compuestos. En
este caso, se selecciona el platino tanto para el modelado del ánodo como del cátodo,
dado que este material no reacciona con la solución y no genera electrodeposición ni
reabsorción (más detalles pueden encontrarse en [52]). Con esta configuración se consideran
las siguientes reacciones en el ánodo:
2H2O ⇀↽ O2 + 4H
+ + 4e− (2.7)
2Cl− ⇀↽ Cl2 + 2e
− (2.8)
Por otra parte, la principal reacción que se toma en cuenta en el cátodo es la siguiente:
2H2O + 2e
− ⇀↽ H2 + 2OH
− (2.9)
Con respecto al ánodo, cuando se aplica una diferencia de potencial, la reacción 2.7
se desplaza hacia la derecha, es decir, de dos moléculas de H2O se forman ox́ıgeno (no
modelado), cuatro átomos de hidrógeno que saltan al electrolito y cuatro electrones que se
van por el metal. De esta manera, por la presencia de H+se acidifica la zona del ánodo. Al
mismo tiempo, la reacción 2.8 procede principalmente hacia la derecha de manera tal que
el cloruro de la solución se consume formando aśı cloro gaseoso (Cl2, no modelado) y dos
electrones. En el cátodo, la reacción 2.9 procede hacia la derecha tal que de dos moléculas
de H2O y dos electrones se forma H2 (no modelado) y dos moléculas de OH
−, que saltan
hacia la solución. Por ello, se alcaliniza la zona del cátodo.
En suma, se tienen en cuenta las reacciones de evolución del ox́ıgeno (2.7) y del cloro
(2.8) para el ánodo y de evolución del hidrógeno (2.9) para el cátodo. Para el resto del
dominio, se consideran la protólisis del agua (2.6) y las reacciones 2.3, 2.4 y 2.5 del sistema
buffer bicarbonato.
Se considera que la corriente eléctrica en el electrolito es transportada por iones, los
cuales se trasladan por difusión y migración (se desprecia la convección por la alta visco-
sidad del medio). Asumiendo que las ecuaciones de transporte en soluciones diluidas son
aplicables, el balance de masa para la especie B ∈ {H+,OH−,Cl−,HCO−3 ,CO2,CO
2−
3 }
está dado por:
∂CB
∂t
= −∇ ·NB +RB (2.10)
2. Modelo de la interacción pH-buffer en protocolos de Electrotransferencia Génica 18
Tiempo ON Tiempo OFF
0
V
T
Fig. 2.2: Esquema de aplicación de pulsos. Tiempo ON: pulso aplicado, presencia de campo
eléctrico; Tiempo OFF: pulso no aplicado, no hay campo eléctrico; T: peŕıodo (ON +
OFF), V: amplitud.
donde NB es el flujo molar, RB es la producción de la especie B a través de las
reacciones qúımicas en el electrolito y t es el tiempo. Durante la aplicación del pulso
(figura 2.2) se define el flujo molar como:
NB = −DB∇CB −
zB
|zB|
uBCB∇Φ (2.11)
donde CB y Φ son la concentraciones de la especie B y el potencial eléctrico, respecti-
vamente. DB, zB y uB son el coeficiente de difusión, el número de carga (con signo) y la
movilidad de la especie B, respectivamente.
En cambio, durante el tiempo donde no se aplica el pulso eléctrico (diferencia de
potencial igual a cero, figura 2.2), el término migratorio desaparece y el flujo molar se
transforma solamente en un flujo difusivo:
NB = −DB∇CB (2.12)
El término RB de la ecuación 2.10 representa la producción de la especie B generada
por las reacciones 2.3, 2.4, 2.5 y 2.6.
RH+ = k6,b CH20 + k3,b CC02 CH20 − k6,f CH+ COH− − k3,f CH+ CHCO−3
ROH− =− k4,f CC02 COH− + k4,b CHCO−3 − k5,f CHCO−3 COH− + k5,b CCO2−3
+ k6,b CH20 − k6,f CH+ COH−
RHCO−3
= k3,b CC02 CH20 − k3,f CH+ CHCO−3 + k4,f CC02 COH− − k4,b CHCO−3
− k5,f CHCO−3 COH− + k5,b CCO2−3
RCO2 =− k4,f CC02 COH− + k4,b CHCO−3 + k3,f CH+ CHCO−3 − k3,b CC02 CH20
R
CO2
−
3
= k5,f CHCO−3
COH− − k5,b CCO2−3
RCl− = RNa+ = 0
(2.13)
Los valores de las constantes de velocidad se presentan en la Tabla 2.1 y están expli-
cados en detalle en [93,94].
2. Modelo de la interacción pH-buffer en protocolos de Electrotransferencia Génica 19
La concentración de la séptima especie, Na+, se obtiene a través de la condición de
electroneutralidad: ∑
B
zB CB = 0 (2.14)
La densidad de corriente total jT está dada por:
jT = F
∑
B
zB NB (2.15)
donde F es la constante de Faraday.
La condición de conservación de carga queda determinada como:
∇ · jT = 0 (2.16)
Tomando en cuenta la expresión del flujo molar (2.11), las ecuaciones 2.15 y 2.16 y
que E = −∇Φ, el campo eléctrico se obtiene de la siguiente manera:∑
B
zBDB∇2CB +
∑
B
|zB|uB∇ · (CB∇Φ) = 0 (2.17)
La movilidad iónica y el coeficiente de difusión están relacionados a través de la ecua-
ción de Nernst-Einstein:
DB =
RT
|zB|F
uB (2.18)
donde T es la temperatura absoluta, R es la constante universal de los gases ideales y
F es la constante de Faraday.
El coeficiente de difusión en agua [99] fue adaptado para describir la difusión en el
tejido de la siguiente manera:
DB = d D
Water
B (2.19)
donde DB es el coeficiente de difusión efectivoque proviene de la asunción de ver al
tejido como un medio poroso [100], DWaterB es el coeficiente de difusión en el agua y d
(ajustado por el experimento) es un factor que reduce el coeficiente de difusión en un
medio poroso con respecto a su valor en agua y toma el valor de 0.2.
Condiciones de borde
Como se mencionó al comienzo de la sección, las reacciones que se consideran en los
bordes son las 2.7 (en adelante RO2), 2.8 (en adelante, RCl2) y 2.9.
El transporte de masa y la transferencia de carga de la especie B a través de la
superficie del ánodo ocurren a la misma velocidad para las especies que están incluidas en
las reacciones en los electrodos, es decir, H+ y Cl−.
−DH+(∇CH+ · ň)−
zH+
|zH+ |
uH+CH+(∇Φ · ň) =
νi,RO2 jRO2 · ň
nRO2 F
(2.20)
2. Modelo de la interacción pH-buffer en protocolos de Electrotransferencia Génica 20
Parámetro Valor Ref Parámetro Valor Ref
DH+ 12.5 · 10−9 m2 s−1 [99] DOH− 7.05 · 10−9 m2 s−1 [99]
DNa+ 1.78 · 10−9 m2 s−1 [99] DCl− 2.72 · 10−9 m2 s−1 [99]
DHCO−3
1.49 · 10−9 m2 s−1 [99] D
CO2
−
3
2.46 · 10−9 m2 s−1 [101]
DCO2 2.71 · 10−9 m2 s−1 [102]
C0H+ 10
−4.4 mol m−3 [103] C0OH− 10
−3.2 mol m−3 [103]
C0Na+ 160 mol m
−3 [103] C0Cl− 132.912 mol m
−3 [103]
C0
HCO−3
27 mol m−3 [103] C0
CO2−3
4.4 · 10−2 mol m−3 [94]
C0CO2 1.3 mol m
−3 [94] C0H2O 55500 mol m
−3
k3,f 310 m
3 mol−1 s−1 [104] k3,b 4.62 · 10−6 s−1 [93]
k4,f 20 m
3 mol−1 s−1 [94] k4,b 6.08 · 10−4 s−1 [94]
k5,f 1.5 · 108 m3 mol−1 s−1 [94] k5,b 58076755.57 s−1 [94]
k6,f 1.5 · 108 m3 mol−1 s−1 [104] k6,b 6.79 · 10−5 s−1 [93]
T 310 K R 8.31 kg m2 K−1 mol−1 s−2
F 96485.3415 A s mol−1
Tab. 2.1: Parámetros del modelo.
−DCl−(∇CCl− · ň)−
zCl−
|zCl− |
uCl−CCl−(∇Φ · ň) =
νi,RCl2 jRCl2 · ň
nRCl2 F
(2.21)
donde ň es el vector normal a la superficie, nRO2 y nRCl2 son la cantidad de elec-
trones transferidos en la reacción electroqúımica RO2 y RCl2 . νH+,RO2
y νCl2,RCl2 son
los coeficientes estequiométricos de las especies H+ y Cl2 en las reacciones RO2 y RCl2 .
jRO2 · ň y jRCl2 · ň representan la densidad de corriente eléctrica parcial contribuida por
las reacciones electroqúımicas RO2 y RCl2 normales a la superficie del ánodo.
Para las especies que no reaccionan en el electrodo el transporte de masa es nulo. De
esta manera, para B ∈ {OH−, Na+, HCO−3 , CO2, CO
2−
3 }:
−DB(∇CB · ň)−
zB
|zB|
uBCB(∇Φ · ň) = 0 (2.22)
La densidad de corriente eléctrica parcial (jRO2 · ň) expresada en la reacción elec-
troqúımica RO2 (evolución del ox́ıgeno) se puede calcular a través de las ecuaciones de
Butler-Volmer de la siguiente manera:
jRO2 · ň = j
eq
RO2
{
exp
[
−
F (Φ + EeqRO2
)
2RT
]
−
(
PO2
P eqO2
) 1
4 (CH+
C0
H+
)
exp
[
F (Φ + EeqRO2
)
2RT
]}
(2.23)
Análogamente, la densidad de corriente eléctrica parcial (jRCl2 · ň) expresada en la
reacción electroqúımica RCl2 (evolución del cloro) está dada por:
2. Modelo de la interacción pH-buffer en protocolos de Electrotransferencia Génica 21
jRCl2 · ň = j
eq
RCl2
{(
CCl−
C0
Cl−
)
exp
[
−
F (Φ + EeqRCl2
)
2RT
]
−
(
PCl2
P eqCl2
) 1
2
exp
[
F (Φ + EeqRCl2
)
2RT
]}
(2.24)
jeqRO2
y jeqRCl2
representan el intercambio de densidad de corriente eléctrica en las reac-
ciones RO2 y RCl2 en el equilibrio. E
eq
RO2
y EeqRCl2
son la diferencia de potencial entre las
fases sólidas y ĺıquidas en condiciones de equilibrio y relativas al potencial estándar del
electrodo de las reacciones RO2 y RCl2 .
P eqO2 , P
eq
Cl2
, P eqH2 son las presiones parciales de las especies O2, Cl2 y H2 en el equilibrio.
C0H+ , C
0
OH− , C
0
Cl− son las concentraciones iniciales de las especies H
+, OH− y Cl−.
La proporción de una presión y su presión de equilibrio se asume igual a 1:
PO2
P eqO2
=
PCl2
P eqCl2
=
PH2
P eqH2
= 1 (2.25)
La densidad de corriente total perpendicular a la superficie de ánodo (jT ·ň) es la suma
de las densidades de corrientes parciales correspondientes a las reacciones electroqúımicas
RO2 y RCl2 :
jT · ň = jRO2 · ň + jRCl2 · ň (2.26)
Con las ecuaciones 2.20, 2.21, 2.22 y 2.26 se resuelven las concentraciones de todas las
especies involucradas junto al potencial electrostático en el ánodo.
Por otra parte, en el cátodo, se considera la reacción 2.9. Al igual que en el ánodo, el
transporte de masa y la transferencia de carga de la especie OH− a través de la superficie
del cátodo ocurren a la misma velocidad.
−DOH−(∇COH− · ň)−
zOH−
|zOH− |
uOH−COH−(∇Φ · ň) =
νOH−,RO2
jRO2 · ň
nRO2 F
(2.27)
Para las especies que no reaccionan en el electrodo el transporte de masa es nulo. De
esta manera, para B ∈ {H+, Cl−, Na+, HCO−3 , CO2, CO
2−
3 }:
−DB(∇CB · ň)−
zB
|zB|
uBCB(∇Φ · ň) = 0 (2.28)
La densidad de corriente parcial (jR
H2,2OH
− · ň) basada en la reacción la evolución del
hidrógeno y producción de hidróxido (RH2,2OH−), y la densidad de corriente total (jT · ň),
todas normales a la superficie del cátodo, son las mismas:
jT · ň = jR
H2,2OH
− · ň (2.29)
En el tiempo OFF, al no haber presencia de campo eléctrico, el término migratorio
de las ecuaciones 2.20, 2.21 , 2.22, 2.27 y 2.28 se elimina y solo queda el término difusivo
igualado a 0. Aśı, para B ∈ {H+,OH−,Na+,Cl−,HCO−3 ,CO2,CO
2−
3 }:
−DB(∇CB · ň) = 0 (2.30)
2. Modelo de la interacción pH-buffer en protocolos de Electrotransferencia Génica 22
En resumen, las ecuaciones 2.10, 2.14 y 2.17 junto con las condiciones de borde son usadas
para resolver la concentración de las especies y el potencial eléctrico en el tiempo, en
un dominio definido por la geometŕıa de la figura 2.1. La ecuación de electroneutralidad
(2.14) es usada para resolver la concentración de Na+y la ecuación 2.10 para el resto de
las especies. La densidad de corriente en los bordes se aplica de manera escalonada en el
flanco de subida del tiempo ON hasta llegar al voltaje deseado.
Condiciones iniciales
En concordancia con [94], todos los parámetros son inicializados a una temperatura
de 37◦C. La concentración inicial del bicarbonato (HCO−3 ) es 27 mM. En tanto, la del
hidróxido (OH−) se calcula usando pKw = 13.6 [105]. El sodio (Na
+) se inicializa con
un valor de 0.16 M y el pH es igual a 7.4. Todas estas elecciones se justifican por el
hecho de que las concentraciones son similares a las encontradas en el plasma y el fluido
intersticial [98]. La concentración del dióxido de carbono (CO2) y del carbonato (CO
2−
3 )
provienen de las reacciones de equilibrio expresadas en 2.4 y 2.5. Por último, la condición
de electroneutralidad es usada para calcular el concentración inicial del cloruro (Cl−).
Estos parámetros se encuentran en la tabla 2.1 en donde están expresados en el sistema
MKS de unidades.
El potencial eléctrico inicial en la superficie del ánodo (Φ0a) se obtiene a través de
la ecuación 2.26. Por otro lado, el campo eléctrico en el dominio y en los electrodos se
calcula a partir de la ecuación 2.15 en la cual se elimina el término difusivo debido a
que inicialmente no hay gradientes de concentración. De esta manera, dicha ecuación se
transforma en:
1
F
(jT · ň) +
∑
B
|zB| uB CB (∇Φ · ň) = 0 (2.31)
en donde finalmente se despeja ∇Φ.
2.3.2. Modelo Computacional
El sistema de ecuaciones diferenciales de la sección anterior se aproxima con un esque-
ma de diferencias finitas no uniforme impĺıcito que se resuelve por un método de relajación
estándar. La malla resultante es más densa cerca de los electrodos como se muestra en la
figura 2.3a. La figura 2.3b muestra la transformación algebraica de nodos de una malla
uniforme x (eje de las abscisas) a una malla variable x′ (eje de las coordenadas). La fun-
ción de conversión es f(x) = 1
1+e−x escalada a 2 mm, que es la distancia entre electrodos
utilizada en las simulaciones
Discretización de la ecuación de transporte (Nernst-Planck)
Combinando 2.10 y 2.11, la ecuación resultante a discretizar en una dimensión es:
∂CB
∂t
= DB
∂2CB
∂x2
+
zB
|zB|
uB
∂
∂x
(CB
∂Φ
∂x
) +RB (2.32)
Para la aproximación