Predicción de Función de nsSNPs en Gen NAT2 y su Rol en Tuberculosis

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PREDICCIÓN DE LA FUNCION DE LOS 
nsSNPs DEL GEN NAT2 Y SU ROL EN 
TUBERCULOSIS 
Nicol Flores-Mancilla 
Abstract—La tuberculosis es una de las enfermedades infecciosas con mayor tasa de mortalidad a nivel mundial debido a su gran 
expansión geográfica y a la aparición de cepas Multidrogo Resistentes (MDR) y Extremodrogo Resistentes (EDR) y que presenta 
complicaciones considerables en su tratamiento; representando un serio problema de salud social. Los fármacos utilizados para el 
tratamiento de la tuberculosis son la Isoniazida (INH), rifampicina (RIF), etambutol (EMB) y la Pirazinamida (PZA); de la cual INH es 
la droga de primera línea que se utiliza en la primera etapa del tratamiento y que ha sido asociada a una alta actividad hepatotoxica. Los 
polimorfismos de nucleótido simple no-sinónimos (snSNPs) son alteraciones en la secuencia de nucleótidos de un gen, modificando en 
varios casos el aminoácido que codifiquen (en caso de los no sinónimos) o codificar el mismo aminoácido (en caso de los sinónimos), de 
acuerdo a ello tienen la capacidad de alterar la estabilidad y funcionalidad de la proteína codificada. Debido a esto se identificó y predijo 
las alteraciones propias de estos en el gen humano NAT2, responsable de la codificación de la proteína que metaboliza INH, mediante 
servidores y software de bioinformática, destacando el nsSNP R197Q como posible fenotipo lento de acetilador que conlleva a una 
metabolización lenta de la INH y a lesiones hepáticas futuras 
Index Terms— Polimorfismo, tuberculosis, hepatotoxicidad, gen, biología computacional 
—————————— ◆ —————————— 
1 INTRODUCTION
os polimorfismos genéticos son diferentes tipos de mu-
taciones en el genoma de los seres vivos [1]. Los poli-
morfismos de nucleótido único (single nucleotide poly-
morphism (SNP)) se dan cuando se sustituye un solo nu-
cleótido por otro, lo que genera diferentes cambios depen-
diendo la región donde se dio la sustitución, como en exo-
nes o región promotora del gen [2]. Considerando la varia-
bilidad de los cambios de nucleótidos, se puede observar 
la sinonimia, en la que el cambio no altera la traducción y 
sigue siendo el mismo residuo, y no sinónimo o SNP fun-
cional, el cual genera un cambio de residuo en la proteína 
y con ello altera las funciones de la misma [3]. El trabajo 
con los polimorfismos de suma utilidad pues permite el 
desarrollo en diferentes campos como en la medicina fo-
rense [4,5], la detección y el tratamiento de enfermedades 
[6,7] como el ébola y el zika [8]. 
En el tratamiento de la tuberculosis (TB) los fármacos de 
primera línea son responsables de la ocurrencia de varias 
reacciones adversas severas, siendo generalmente la hepa-
totoxicidad la más seria [9]. La isoniazida (INH) sigue 
siendo el agente quimioterapéutico más utilizado en el tra-
tamiento de esta enfermedad [10]. La primera etapa en el 
metabolismo de INH es la acetilación, catalizada por la en-
zima N-acetiltransferasa (NAT2), dando como resultado la 
formación de acetil INH. La NAT2 muestra diversos poli-
morfismos genéticos, y su actividad se expresa en niveles 
muy variables [11]. 
La enzima arilamina N-acetiltransferasa (NAT) perte-
nece a un grupo de enzimas de fase II que metabolizan va-
rias aminas aromáticas y heterocíclicas, hidroxilaminas, 
arilaminas y arilhidrazidas. Estas enzimas se encuentran 
tanto en eucariotas como en procariotas [12]. En los seres 
humanos se encuentran dos tipos NAT1 y NAT2 (de 33 
kDa y 31 kDa), codificadas en genes polimórficos. La re-
gión codificante del gen de NAT1 y NAT2 presenta un 87 
% de identidad de nucleótidos y un 81 % de identidad en 
aminoácidos. Estas enzimas catalizan tanto la N-acetila-
ción dependiente de acetil-CoA de aminas aromáticas pri-
marias e hidrazinas (usualmente la desactivación) o la O-
acetilación de metabolitos hidroxilados (usualmente acti-
vación)[13]; por lo cual se convierte en una de las enzimas 
clave en el metabolismo de fármacos.[14] Algunos SNPs en 
el gen que codifica esta proteína, modulan la actividad de 
la enzima de forma rápida, intermedia o lenta; siendo el 
fenotipo de lenta acetilación el más susceptible a reaccio-
nes adversas, de acuerdo a ello se incrementa el riesgo de 
efectos hepatotóxicos del fármaco INH [15-18]. 
Varios estudios han demostrado que los seres humanos 
muestran un amplio grado de variación en su capacidad 
para acetilar INH a acetil-INH a pesar de recibir dosis de 
INH prescritas similares [19]. Los individuos pueden dis-
tinguirse fenotípicamente como acetiladores lentos o rápi-
dos (la concentración de la enzima es mayor en los acetila-
dores rápidos) [19]. Las técnicas moleculares disponibles 
permiten identificar tres genotipos: rápidos, intermedios y 
lentos. Se sabe que los acetiladores lentos tienen un mayor 
riesgo de inducción a la toxicidad por fármacos, mientras 
que los acetiladores rápidos experimentan probablemente 
una eficacia terapéutica disminuida. Se ha sugerido que el 
genotipado NAT2 antes de la terapia podría ser útil para 
predecir reacciones adversas y hacer ajustes de dosis, si es 
———————————————— 
• NFM es estudiante de pregrado de Ingeniería Biotecnológica (nicol.flo-
res@ucsm.edu.pe) 
 
L 
mailto:nicol.flores@ucsm.edu.pe
mailto:nicol.flores@ucsm.edu.pe
 
 
necesario [20, 21]. 
2 METODOLOGÍA 
2.1. Obtención de la secuencia 
2.2. Mapeo de los polimorfismos 
2.3. Predicción de daño basado en la homología de la 
secuencia usando SIFT 
2.4. Predicción de daño basado en la homología de la 
secuencia usando PROVEAN 
2.5. Predicción de daño basado en la homología de la 
estructura usando PolyPhen-2 
2.6. Identificación de residuos conservados y patrones 
de secuencias 
2.7. Análisis de los efectos de la sustitución de aminoá-
cidos en la estabilidad de la proteína usando ERIS 
2.8. Predicción de enfermedades relacionadas con los fe-
notipos y sustitución de aminoácidos utilizando MutPred 
y nsSNPAnalyzer 
2.9. Modelamiento estructural y superposición de la 
proteína nativa y de las proteínas mutadas 
2.10. Docking molecular 
 
3 SECTIONS 
Todos los polimorfismos reportados del gen NAT2 fueron 
encontrados en la base de datos NCBI. Se encontró un total 
de 12693 SNPs rsIDs que fueron mapeados en la secuencia 
del gen NAT2 en seres humanos. El número de diferentes 
SNP con diferentes clases funcionales está reportados en la 
Fig.1. En la base de datos de NCBI dbSNP, 162 (1.3 %) se 
encuentran asociados a la región codificante del gen. Tam-
bién se observó 891 (7.0%) en la región 3'utr del gen y 347 
(2.7%) asociadas a la región 5'utr, los ubicados en la región 
intrónica 10337 (81,4%), y SNP activos, 956 (7,5 %), fueron 
otros SNP activos. De los 162 polimorfismos en la región 
codificante del gen, se evaluaron aquellos ligados al rol de 
la NAT2 en la tuberculosis, considerando aquellos pro-
puestos por A. K. Hemanth Kumar en su investigación aso-
ciada a la tuberculosis [22] 
Con el objetivo de determinar las consecuencias de las 
variaciones estructurales y funcionales de los 3 SNP en la 
estructura de la proteína NAT2, utilizamos un enfoque 
multinivel de tres pasos. El paso 1 fue llevado a cabo en 
dos sub-pasos donde el gen de la proteína NAT2 fue so-
metido a la predicción de SNP basada en la homología de 
secuencias usando SIFT (Clasificación de Tolerante e Into-
lerante) y PROVEAN (Análisis del Efecto de la Variación 
de la Proteína); y luego la homología estructural basada en 
la predicción de SNP, utilizando Poly-Phen. El objetivo del 
paso 2 es de validar la alta confiabilidad de los SNP utili-
zando diferentes aproximaciones como la estabilidad in 
silico como el análisis de la estabilidad de las proteínas mu-
tantes utilizando ERIS, la identificación de la asociación 
con enfermedad utilizando MutPred y el nsSNPAnalyzer, 
la asociación de los SNP con estructuras altamente conser-
vadas y su exposición de los residuos de aminoácidos en la 
proteína NAT2 utilizando Clustal Omega, y la compara-
ción de la estructura terciariade los modelos de las proteí-
nas mutantes con la nativa, así como observar las posibles 
interferencias y sus consecuencias estructurales de los 
nsSNP en la proteína NAT2. 
Tabla 2. SNP seleccionados, de Tipo no sinónimo, y de 
la sustitución de aminoácidos en cada una de las po-
siciones introducidas 
 
dbSNP ID Codones SNP Tipo Sustitución 
rs1801280 ATT-AcT No Sinónimo I114T 
rs1799930 CGA-CaA No Sinónimo R197Q 
rs1799931 GGA-GaA No Sinónimo G286E 
El análisis de los polimorfismos utilizando SIFT puede 
predecir hasta el 90 % de los SNP dañinos. La predicción 
de los 3 SNP seleccionados fue determinada por el algo-
ritmo de SIFT, en la que se observa su daño y la tolerancia 
de las sustituciones basada en la homología y las propie-
dades físicas de las secuencias presentadas. 
 
Los tres SNP seleccionados fueron no sinónimos, se in-
cluirán en el análisis posterior, tomando un especial interés 
en el SNP rs1801280 y rs1799930 al observarse una predic-
ción perjudicial en el cambio de aminoácidos en la secuen-
cia proteica. 
4 DISCUSIÓN 
Existe un creciente interés y mayor cantidad de estudios sobre 
los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs), debido a que 
son una de las alteraciones más comunes en el genoma que re-
sultan de cambios o alteraciones en un único nucleótido. Estas 
variaciones en las secuencias de ADN tienen una alta implican-
cia sobre la función y/o estructura de las proteínas expresadas, 
lo que puede conllevar a una respuesta errónea por parte del 
portador ante el metabolismo de fármacos, la expresión de en-
fermedades, etc. 
Un objetivo de este tipo de investigaciones es el poder identifi-
car uno de estos polimorfismos de nucleótido simple en la re-
gión codificante de un gen que esté relacionado con algún pa-
decimiento o enfermedad, afinidad por alguna diana farmaco-
lógica o ser un determinante en la forma de metabolizar algún 
fármaco; así poder revelar información para prevenir algún 
efecto indeseado y lograr un objetivo más eficiente. 
Dentro de los SNPs, existen aquellos que modifican la secuen-
cia de aminoácidos codificados al substituir un único aminoá-
cido teniendo que estar localizados dentro de una secuencia co-
dificante y son llamados no-sinónimos, y dependiendo de sus 
atributos se clasifican en neutrales y los implicados en una en-
fermedad. 
En base al estudio realizado a 4 polimorfismos de nucleótidos 
simples no-sinónimos (snSNP, rs1801280, rs1799930, rs1208 y 
rs1799931) de la enzima N-acetiltransferasa 2 (NAT2), se pre-
dijo que a partir de la información obtenida, el efecto de estos 
polimorfismos en la estructura y función de la NAT2 con res-
pecto a su capacidad de acetilación sobre la INH (fármaco de 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=snp&cmd=search&term=+rs1801280
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=snp&cmd=search&term=+rs1799930
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=snp&cmd=search&term=+rs1799931
AUTHOR ET AL.: TITLE 3 
 
primera línea en el tratamiento antituberculosis) con el uso de 
herramientas bioinformáticas. 
SIFT y PROVEAN son algoritmos que predicen el efecto da-
ñino o no dañino de la función de la proteína, basados en la va-
riación de la secuencia de aminoácidos. Para los polimorfismos 
estudiados cuyos rsIDs son: rs1801280 (I114T), rs1799930 
(R197Q), rs1208 (R268K) y rs1799931 (G286E), como se reporta 
en la Tabla 3, los SNPs I114T y R197Q son los únicos con posible 
efecto perjudicial. 
 PolyPhen 2, herramienta web que predice consecuencias fun-
cionales de una sustitución de aminoácidos mediante una regla 
empírica específica, proporcionó en la Tabla 4 los resultados de 
la sustituciones, presentando en el SNP R197Q un probable 
efecto dañino con el mayor score y especificidad; posterior-
mente este nsSNP fue analizado mediante el servidor ERIS 
cuyo cálculo del efecto mutacional sobre la estabilidad de la 
proteína confirmo un efecto desestabilizante de la NAT2, sin 
embargo, como se reporta en la Tabla 5, los SNPs I114T y 
G286E también presentan una mutación desestabilizante ba-
sada en ΔΔG. 
En tanto, la herramienta SNPAnalizer predice el efecto fenotí-
pico de la mutación (asociado a una enfermedad vs. Neutral) 
en la Tabla 6, siendo solo dos las mutaciones que conllevan a 
una enfermedad, la R1974Q y G286E, mientras que en la Tabla 
7, los efectos son propios solo de la I114T según MutPred. 
Es así que, tomando en cuenta las predicciones y cálculos de los 
efectos de los snNSP, se optó por un análisis por acoplamiento 
usando el software AutoDock 4.0 entre la proteína NAT2 y el 
ligando INH, los resultados de estos acoplamientos se mues-
tran en la Tabla 8, donde vemos que la NAT2 no mutada pre-
senta un ΔG de -5.43 Kcal/mol y la presencia de 1 puente de 
hidrógeno, mientras que los snSNPs presentan diferentes resul-
tados de los que podemos asumir lo siguiente: I114T presenta 
la formación de dos puentes de hidrógeno, G286E presenta la 
formación de un solo puente de hidrógeno, mientras que 
R197Q no presenta ningún enlace de este tipo; podemos a par-
tir de estos resultados asumir que cada mutación perfila un fe-
notipo de acetilador diferente, siendo los snNPSs acelerado, in-
termedio y lento respectivamente; el rs1799930 (R197Q) tiene 
un efecto perjudicial en la estructura y función de la proteína 
NAT2, cuyo fenotipo de acetilador lento es un indicador de una 
alteración en la metabolización de INH que puede repercutir 
en efectos colaterales como lo sería la hepatotoxicidad. 
5 CONCLUSIONES 
El presente trabajo concluye que es importante considerar 
la variación estructural de los polimorfismos ya que tienen 
una gran implicancia en la funcionalidad de la proteína 
como observamos en nuestros resultados. De lo cual obser-
vamos que el polimorfismo relacionado con el cambio de 
aminoácidos en la posición 197, entre el aminoácido Argi-
ninina (R) a Glutamina (Q), representa una seria dificultad 
para la enzima al momento de acetilar la INH, retardando 
su efecto catalítico y aumentando el riesgo hepatotoxico. 
 
ACKNOWLEDGMENT 
Al Centro de Investigación de la Universidad Católica de 
Santa María, Arequipa, Perú 
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