Ensayo biotecnología - Diana Becerril

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Evaluación de la expresión de la proteína G del virus de la rabia 
en maíz como inmunógeno oral. 
Introducción 
El virus de la rabia pertenece a la familia Rhabdoviridae del género Lyssavirus. Tiene forma de bala, 
con una nucleocápside helicoidal y una envoltura lipídica de donde sobresalen glicoproteínas con 
forma de espícula. (Instituto Nacional de Seguridad e Higiene, 2014). 
 
Figura 1. Estructura del virus de la rabia. 
Por otro lado, el género de los Lyssavirus consiste en una colección de virus genéticamente 
relacionados que se han adaptado para replicar en el SN de mamíferos; además, existen seis tipos 
de genotipos pertenecientes a este género. El virus tiene cuatro proteínas estructurales y una ARN 
polimerasa. Dentro de la nucleocápside se encuentran tres proteínas: nucleoproteína (N), 
fosfoproteína (P) y ARN polimerasa o ARN dependiente (L). (Ross, 2007). 
La glicoproteína G es la principal responsable de la patogenicidad viral, además es el antígeno 
responsable de la inducción de anticuerpos neutralizantes; también participa en la invasión, 
transporte y diseminación viral en el tejido infectado. Esta proteína es del tipo I trans.mebrana N-
glicosilada, que forma trímeros de proyecciones en la superficie viral. Está compuesta 
aproximadamente de 505 aminoácidos y posee de dos a cuatro sitios potenciales de N-glicosilación, 
pero solo uno o dos son dependientes de la cepa viral e importantes en el correcto plegamiento de 
la proteína. Es responsable de la invasión al SN mediante la adhesión del virus rábico a receptores 
celulares como el nicotínico de acetilcolina, moléculas de adhesión celular neuronales y el receptor 
de neurotrofinas p. U no de los principales mecanismos de lesión celular mediado por la proteína G 
es la apoptosis celular. (Ross, 2007). 
Por otro lado, la transformación de plantas es la modificación genética de una planta, en donde se 
utilizan técnicas biotecnológicas (Universitat de Lleida, 2019). Los sistemas de transferencia pueden 
dividirse en dos grupos: 
Sistemas basados en vectores biológicos: 
 Transferencia mediada por Agrobacterium. 
 Transferencia basada en virus. 
Sistemas de transferencia directa de ADN (estos son sistemas basados en transferencia física): 
 Biobalística. 
 Electroporación. 
 Microinyección. 
 Transferencia con whiskers de carburo de calcio. (Gómez, 2002). 
 
Finalmente, en este ensayo se hablará de los procesos de upstream y downstream que componen 
el proceso de la expresión de la proteína G del virus de la rabia en maíz. Sin embargo, antes es 
importante conocer lo que son los procesos de upstream y downstream. En el upstream se llevan a 
cabo todos los procesos de elección de los microorganismos u organismos a utilizar, la preparación 
del medio, esterilización necesaria y la preparación del inoculo (Ortiz, 2011). En cambio, en el 
downstream se lleva a cabo la recuperación del producto por medio de operaciones unitarias ya sean 
del tipo físicas o químicas, el acondicionamiento, estabilización y formulación del producto (Huerta, 
2012). 
 
Construcción de vectores de expresión vegetal 
Para llevar a cabo el proceso de la transformación de los callos embriogénicos del maíz con la 
proteína G se utilizó un vector que fue nombrado pGHNC5 (figura 1). 
 
Figura 2. Vector de expresión para el maíz. 
Posteriormente, para poder escoger los callos embriogénicos transformados se cotransformaron con 
uno de los vectores de expresión para plantas, el cual contiene el gen bar que brinda resistencias al 
herbicida glufosinato de amonio; el vector es denominado pCAMBIA-3301 (Figura 2); el cual, además 
de ser utilizado para la transformación, se utilizó como control positivo. 
 
Figura 3. Vector de selección. 
 
Establecimiento de cultivos vegetales. 
Para obtener los embriones inmaduros utilizaron semillas de maíz, a partir de las cuales se separaron 
los embriones inmaduros inoculando frascos con medio nutritivo N6 –inducción para su posterior 
mantenimiento en incubación en ambiente controlado y en condiciones de oscuridad. Este proceso 
se llevó a cabo por un mes, pasado este tiempo se subcultivaron a un medio N6- proliferación. 
Finalmente, para obtener las plántulas se mantuvo el callo a 25°C en periodos de 16 horas de luz 
por 8 horas de oscuridad. 
Transformación de callos embriogénicos de maíz por biobalística con pistola de baja 
presión. 
El primer paso fue la preparación de las micropartículas, se utilizaron partículas de tungsteno con un 
diámetro de 4 µm, fueron sonicadas y se pusieron en hielo con ácido nítrico. Posteriormente se 
eliminó el sobrenadante y se le adicionó agua estéril. Las partículas fueron sonicadas nuevamente 
y centrifugadas, se volvió a eliminar el sobrenadante y se sonicaron por tercera ocasión pero ahora 
utilizando etanol absoluto. Finalmente se repitió la centrifugación y la sonicación con agua estéril 
para preparar alícuotas de 200 µl, agregar agua estéril y almacenarlas a -20 °C. 
Para realizar el bombardeo se tomaron 50 µl de la suspensión de micropartículas de tungsteno se le 
agregó 1 µg/µl del vector pCambia3301 y de alguno de los vectores pUCpSSrabG o pGHNC5 en 
relación 1:9. Se adicionó cloruro de calcio 2.5M y espermidina 0.1M. Finalmente se centrifugó para 
eliminar 100µl del sobrenadante y suspender las partículas en el líquido remanente. 
Un día previo al bombardeo se colocó 1g de callo embriogénico en una caja Petri con 15mL de medio 
N6P. 
Se colocaron 5 µl de las partículas en el centro del filtro de la pistola, se colocó la caja Petri en el 
centro de la platina y se cubrió con una malla de plástico estéril para reducir la velocidad del disparo. 
El disparo se llevó a cabo a una presión de helio de 120 psi, a 13 cm de distancia entre el tejido y la 
pistola. 
Se dividieron las cajas Petri en tres grupos, el primero bombardeadas por pCAMBIA3301-bar y 
pGHNC5; el segundo grupo de cajas se bombardeó únicamente con pCAMBIA3301 para usarse 
como control positivo y el tercer grupo de cajas fue bombardeado con partículas sin ADN para control 
negativo. 
Al terminar el bombardeo se mantuvieron en las condiciones señaladas en el establecimiento de 
cultivos vegetales. 
Selección y proliferación de callos embriogénicos 
Los callos embriogénicos transformados se subcultivaron por una semana en medios MS, para 
favorecer la recuperación del callo no se agregó ningún agente de selección, al finalizar la semana 
los callos se subcultivaron en medio N6-p enriquecido con Basta. 
Pasados tres meses de selección la concentración de herbicida y hormonas vegetales se redujeron 
a la mitad para permitir el desarrollo de los embriones somáticos. 
Regeneración de plántulas 
Las reducciones de herbicida y hormonas originaron brotes que fueron separados del callo 
embriogénico. Los callos restantes fueron retirados cuando las plántulas alcanzaron un tamaño entre 
4-6 cm. 
Cuando las plantas alcanzaron una altura de entre 10-12 cm se redujo la cantidad del agente 
selectivo Basta en una tercera parte. Posteriormente se traspasaron las plantas a frascos 
individuales para el desarrollo de raíces y un mejor intercambio gaseoso. 
Las plantas se cambiaron de recipiente a frascos con contenido agrolita estéril con medio N6-p, ácido 
indol acético y benzoamino purina para fortalecer sus tallos y raíces. 
Finalmente las plantas que sobrevivieron el proceso fueron transplantadas a tierra previamente 
preparada de la siguiente manera: tierra negra con hojarasca en una relación de 2:1, la mezcla se 
añadió a sustrato nutritivo Peat moss en relación 1:1, a esta nueva mezcla se le agregó agrolita en 
relación 2:1. 
Las plantas se mantuvieron en una cámara de aclimatación en la mezcla húmeda previamente 
preparada con sus raíces aproximadamente a 10 cm de profundidad y siendo rociadas con agua por 
cuatro meses. 
Al término de los cuatro meses te transfirieron a macetas hasta que llegara su etapareproductiva. 
 
Regeneración, identificación y detección de proteína G del virus de la rabia y 
evaluación de respuesta inmune en animales. 
Una vez obtenidas las plantas genómicas del maíz que fueron mantenidos a diferentes condiciones 
como el in vitro, se procedió a realizar una extracción del ADN genómico de dicha planta. Este 
procedimiento se realizó mediante la adición de diferentes solventes orgánicos a una muestra de la 
planta previamente acondicionada; dicha muestra también fue sometida a diferentes técnicas de 
laboratorio haciendo énfasis en la centrifugación constante para finalmente mediante el uso de 
amortiguadores limpieza de solventes obtener finalmente el material genético deseado. 
 
Como se deseaba saber si la planta del maíz había logrado integrar de forma satisfactoria el gen de 
interés a su genoma, se optó por realizar una reacción en cadena de polimerasa de punto final, a 
condiciones específicas. Una vez probada la presencia de este gen, también se necesitaba conocer 
cuál era su nivel de transcripción del transgen. Para esto se decidió realizar una extracción de ADN 
de una nueva muestra vegetal. 
 
Para este procedimiento, se optó por usar la técnica RT-PCR, la cual se metió a la muestra a 
diferentes procesos de impregnación de compuestos orgánicos, centrifugaciones, extracciones, 
incubaciones a temperaturas bajo cero y finalmente limpiezas mediante las cuales se pudo obtener 
una pastilla en la cual se consideraba que estaba la presencia del material genético de interés; para 
confirmar la presencia de dicho material genético y ver la calidad del mismo se observan geles de 
agarosa teñidos los cuales confirmaron su presencia. 
 
Una vez confirmada la presencia del ARN dentro de la planta del maíz, se buscó detectar el ADNm 
del gen G, esto con el fin de saber si las células vegetales procedentes de la planta del maíz lograron 
transcribir dicho gen. Esto se confirmó mediante la realización de una retrotranscripcion del ARN que 
dio un resultado positivo. Debido a esta prueba se obtuvo muestra de ADNc la cual, se almaceno a 
temperaturas bajo cero para la realización de una futura PCR. 
 
Después de haber obtenido los resultados mencionados anteriormente, el nuevo objetivo de interés 
fue el detectar a la proteína G del virus dentro de las plantas que estuviesen transformadas. Los 
primeros procedimientos a realizar fue el inicio de la purificación de la proteína, se empleó la técnica 
western blot con un control positivo, esto con el objetivo de obtener un resultado de referencia. Para 
poder contestar de forma óptima la proteína que se encontraba dentro de la muestra vegetal, se tuvo 
que obtener y adaptar anticuerpos rábicos que fueron obtenidos a través de conejeras. 
 
Para este procedimiento se seleccionaron dos conejos machos a los cuales se les empezó a 
administrar de forma frecuente (cada 3 semanas por 2 meses y una semana) la proteína g del virus 
de la rabia esto con el fin de generarles una inmunización de la cual se podrían obtener los 
anticuerpos. Pasado el período establecido se tuvo que sacrificar a los conejos para obtener un suero 
en el cual vinieran dichos antígenos que mediante diferentes técnicas de centrifugación y adición de 
solventes, podrían separarse de este y por consecuente poder obtener el producto final qué son las 
inmunoglobulinas purificadas. 
 
Una vez obtenidas las inmunoglobulinas puras, se procedió finalmente realizar el Western blot en 
una muestra de célula vegetal transformada. Para lograr conocer si la proteína G del virus se 
encontraba en la planta del maíz, se optó por tomar muestra de los granos del mismo y estos fueron 
sometidos al procedimiento que conlleva la prueba Western blot. Tras la centrifugación es finales y 
la obtención de un precipitado proteico, se liofilizó dicho producto y después fue colocado en placas 
de nitrocelulosa para fijarlas. 
 
Una vez fijada la muestra a la placa de nitrocelulosa se adicionó como primer muestra de anticuerpos, 
a las inmunoglobulinas de conejo las cuáles fueron fijadas a la placa e incubadas con el fin de poder 
obtener un resultado, una vez pasada dicho proceso se secaron las placas y de fotografiaron como 
muestra de evidencia documental. Una vez terminado este proceso, se tomó una muestra del 
complejo proteico generado y se realizó una curva que permitió observar a la proteína G y su 
concentración con respecto a diferentes geles. 
 
Vector pFAST-BacMelGHis 
Para la expresión de la proteína G del virus en baculovirus se debe obtener el vector pFAST-Bac; 
por lo que se diseñaron oligonucleótidos para amplificar la secuencia que codifica para el dominio 
soluble de la glicoproteína de rabia. Para la amplificación del gen G se utilizó ADNc de una cepa 
mexicana del virus de la rabia empleando 20 ng; utilizando un kit Expand high fidelity PCR system. 
El producto de PCR fue visualizado en un gel de agarosa 1 % para purificarlo mediante una 
extracción fenol clorofórmico. El producto de la digestión fue purificado de un gel agarosa de bajo 
punto de fusión al 1 % utilizando el kit Pure Link conforme a las indicaciones del fabricante. 
Después se calculó la concentración de ADN del gen para clonarlo en el vector pFAST-Bac; para 
ello se hizo la ligación vector-inserto utilizando la ligasa T4. Con este material se transformaron 
células de E. coli 𝐷𝐻5𝛼 mediante electroporación. Las colonias obtenidas se crecieron en medio LB 
con ampicilina y se incubaron en agitación constante a 37 °C toda la noche. De las colonias que 
crecieron se realizó la extracción de ADN utilizando el kit: Charge switch-pro plasmid miniprep kit. El 
ADN plasmático obtenido fue digerido con las enzimas de restricción apropiadas para comprobar la 
inserción del gen G. Se eligió una colonia positiva a la digestión y fue secuenciada para evitar 
mutaciones. 
 
Figura 4. Construcción del plásmido a través del vector pFastBac para la expresión de Baculovirus. 
Construcción del Bacmido 
Se utilizó 1 ng/mL del ADN plasmídico de la clona secuenciada para transformar células bacterianas 
DH10 Bac competentes, las cuales contienen el bacmido y un plásmido operador que ayuda a que 
se lleva a cabo la transformación. Para ello la mezcla se mantuvo en hielo 30 min y posteriormente 
se pasó a un baño de 42 °C por 45 s, las células de transfirieron inmediatamente al hielo por 2 min 
y se adicionaron 900 µl de medio SOC. Las bacterias se dejaron incubar a 37 °C por 4 h en un 
agitador orbital a velocidad constante de 225 rpm. 
Al terminar la incubación, las bacterias se sembraron en las placas de LB con el antibiótico 
tetraciclina, kanamicina y gentamicina. Las placas se incubaron por 48 h a 37 °C para permitir en 
ese tiempo la selección por color de colonias azules y blancas. De las placas se seleccionaron cuatro 
colonias blancas y se sembraron por estría en nuevas placas de LB en las mismas condiciones que 
las mencionadas anteriormente. De las colonias blanca que crecieron, se seleccionó la colonia con 
mejores características morfológicas (tamaño, forma y completamente blanca); la cual fue aislada y 
crecida en 3 mL de medio LB líquido con los antibióticos todos a 10 mg/mL y fue incubada 8 h a 37ºC 
en agitación constante a 225 rpm. La mitad del inóculo fue transferido a un litro de medio LB con los 
antibióticos mencionados previamente. El cultivo fue incubado por 16 h a 37 ºC en agitación 
constante a 225 rpm. La extracción del ADN del Bacmido se realizó con el kit de extracción Pure link 
Filter Maxi Columns según instrucciones del fabricante. 
El ADN obtenido es el bacmido que contiene el gen G del virus de la rabia y se utilizó para transfectar 
células de insecto. 
 
Figura 5. Sistema de expresión de baculovirus 
 
Obtención del baculovirus BacMelGrabHis 
Se tuvo que transferir células Sf21 con el bacmido creado; estas células se crecieron en una botella 
de 75 cm2 durante 48 h para obteneruna monocapa confluente. Para verificar que la proteína G se 
estuviera expresando a través de los diferentes pases en las células de insecto, las monocapas de 
células de insecto de las botellas infectadas se desprendieron raspando la botella y fueron tratadas 
con un amortiguador de rompimiento. El extracto celular fue observado en un gel de poliacrilamida 
al 10 % y la identidad de la proteína expresada fue visualizada en Western blot. 
 
Titulación del Baculovirus 
De la monocapa raspada se contaron para ajustar a una suspensión 1x106 cel/mL. En una placa de 
cultivo de 6 pozos se sembraron 2x106 células por pozo y se dejaron reposar durante 1 h para que se 
adhirieran a la placa. Por otra parte se prepararon diluciones del baculovirus desde 10-3 hasta 10-7, 
se agregaron 0.5 mL a cada pozo. A un pozo sólo se le agrego medio para usarlo como testigo 
negativo. La infección se dejó incubando 1 h a 28 ºC. 
Mientras la infección se está incubando, se disolvió en microondas agarosa de bajo punto de fusión 
diluyendo a 1 % con medio BD Baculo Gold y se agregó anfotericina B a 0.0025 mg/mL. 
Al concluir el tiempo de infección, se agregaron 2 mL de la mezcla agarosa-medio a cada pozo por 
la pared. Al gelificar la agarosa se adicionaron 2 mL de medio BD. 
La placa se protegió de la luz y se incubó a 28 ºC durante 7 días. Al terminar la incubación se 
agregaron 1.5 mL de rojo neutro al 0.03 %, durante 3 h, después de las cuales se eliminó y se 
contaron las placas formadas. 
Para determinar el título del baculovirus se aplicó la siguiente formula: 
 
𝑝𝑓𝑢
𝑚𝐿
= (#𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎𝑠)(𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛) (
1
𝑚𝐿 𝑖𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜
) 
Ecuación 1. Fórmula para determinar el título del baculovirus. 
Evaluación de la respuesta inmune de animales vacunados con zanahoria y maíz 
transformados con el gen G del virus de la rabia. 
El material biológico que se utilizó fueron ratones, maíz y zanahorias. 
Para los ratones, se utilizaron 84 hembras de la cepa CD1 obtenidos del Bioterio México, de los 
cuales fueron mantenidos en condiciones controladas de alimentación. 
En cuanto al maíz, las mazorcas de las plantas que expresan la proteína G del virus de la rabia 
fueron desgranados y posteriormente pulverizados en nitrógeno líquido para obtener una harina, la 
cual fue mezclada con PBS para formar pastillas. El resultado de la cuantificación de la proteína 
expresada en plantas fue de 50 µg de proteína G por gramo de tejido vegetal, por lo que se formaron 
pastillas con 2 g de la harina de maíz conteniendo 100 µg. 
En las zanahorias que expresan la proteína G del virus de la rabia fueron cortadas en trozos de 
aproximadamente d 5 mm para facilitar la ingestión por los ratones. En esta especie la especie la 
proteína expresó 25 µg de proteína G por gramo de tejido vegetal. 
 
Inmunización 
Se formaron 7 grupos de 12 hembras cepa CD-1 de 11 semanas que fueron divididas de acuerdo a 
la Tabla 1. La noche anterior a la inmunización, los animales fueron restringidos en el alimento y 
separados individualmente para tener la certeza de que consumieran la pastilla de maíz o los trozos 
de zanahoria completo; además de que se les administró una solución bicarbonato de sodio al 4% 
en agua destilada para disminuir la acción de enzimas digestivas, y permitir así la llegada integra de 
la proteína G recombinante al intestino. 
Después de que los animales consumieran por completo su dosis de vacuna, se mantuvieron durante 
60 días post vacunación con su alimento tradicional. Estos ensayos de inmunidad se realizaron por 
duplicado. 
 
Tabla 1. Distribución de grupos inmunizados con diferentes biológicos. 
Grupo Biológico administrado Vía 
Dosis única 
(µg) 
G1 Maíz que expresa proteína G Oral 100 
G2 Maíz sin transformar Oral ––– 
G3 Zanahoria que expresa proteína G Oral 100 
G4 Zanahoria sin transformar Oral ––– 
G5 Proteína G purificada Oral 100 
G6 Proteína G purificada IM 100 
G7 Sin tratamiento ––– ––– 
 
Evaluación de la respuesta inmune humoral 
Para obtener el suero, los ratones fueron sangrados vía retrorbital, cada 15 días durante 2 meses 
post-vacunación, para evaluar la presencia de anticuerpos contra la proteína G. Los sueros fueron 
evaluados mediante la técnica de ELISA (placas de 96 pozos de fondo plano sensibilizadas con 75 
ng de la proteína G) usando como antígeno sobrenadante de células de insecto infectadas con un 
baculovirus que expresa la proteína G del virus de la rabia. 
Como testigo positivo se utilizó un pool de sueros de ratón vacunados con una vacuna antirrábica 
comercial. El testigo negativo fueron los sueros de ratones que no recibieron ningún tratamiento. 
 
Figura 6. Sangrado vía retrorbidal de un ratón. 
Evaluación de la respuesta inmune celular 
Sólo se llevó a cabo con el grupo de ratones inmunizados con maíz, y con los grupos testigo positivos 
y negativos. Para evaluar la respuesta inmune celular, 3 ratones de cada grupo fueron sacrificados 
humanitariamente y de inmediato se obtuvieron los bazos mediante disección, se hizo un pool de los 
bazos para la obtención de linfocitos, con los cuales se llevó a cabo la determinación de interleucina-
4 (IL-4) e interferón gamma (IFN-) mediante la prueba de ELISA. 
 
Figura 7. Disección de un ratón hembra; señalando el bazo y otros órganos. 
Cuantificación de IL-4 e IFN- por ELISA 
Se llevó a cabo por medio de un ensayo de ELISA de tipo sándwich, utilizando como muestra los 
sobrenadantes de los cultivos de linfocitos. Esto se llevó acabo utilizando los paquetes comerciales: 
Mouse IL-4 ELISA ready-SET-Go y mouse INF- ELISA ready-SET-Go (Marca eBioscience) 
siguiendo las instrucciones del fabricante. 
 
Figura 8. Ensayo de ELISA de tipo sándwich. 
Desafío de animales inmunizados 
Todos los animales inmunizados con la zanahoria o maíz transformado así como los grupos testigos 
positivo y negativo, fueron desafiados con una dosis letal del virus de la rabia de cepa vampiro con 
un título de 106.1/mL LD50. Los animales fueron observados durante 60 días, en los cuales se 
recolectaron los cerebros de aquellos que murieron con signos de la enfermedad. 
 
Conclusiones 
 El nivel biotecnológico de este tipo de trabajos resulta muy importante e enriquecedor. No 
sólo para el autor si no para las personas que terminan leyendo su trabajo. También resulta 
interesante conocer un proceso upstream y downstream en cuanto a la modificación de los 
organismos para la expresión genética, que no necesariamente abarque el área de industria, 
si no que se vaya más al área de investigación cómo le fue este tema. Se logra ver de forma 
más profunda el que pasa, como afecta a la planta de maíz la inserción del gen y cómo esta 
termina expresándolo como si fuese un gen común en su genoma. 
 
 El uso de la biotecnología vegetal resulta muy importante para nuestro país ya que contiene 
un 70% de la biodiversidad mundial gracias a la posición geográfica, variedad de climas y 
tipografía en el cual se encuentra nuestro país (ProMéxico, 2011). Sin embargo, México no 
explota dicha biodiversidad para el área de biotecnología, lo cual lo encontramos en un gran 
error para el desarrollo de investigaciones como en este caso de la tesis en la cual se 
fundamentó este trabajo. 
 
 Los procesos de upstream y downstream que fueron llevados a cabo fueron de gran 
importancia ya que se demostró en los resultados obtenidos de los ensayos de inmunidad 
que el maíz fue más efectivo para proveer mayor protección ante un desafío con el virus de 
la rabia cepa vampiro (50 g de tejido de maíz), el cual fue el principal transmisor del virus 
en nuestro país. El 11 de noviembre de 2019, en Washington, DC/Ginebra, México se 
convirtió en el primer país del mundo en recibir la validación por parte de la Organización 
Mundial de la Salud (OMS) por haber eliminado la rabia transmitida por el perro como 
problema de salud pública (OMS, 2019). 
 
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