SOUTHERN BLOT - Dariel Isai Soria Cordova

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA
DE QUERÉTARO
Facultad de química
 
Ingenieria en Biotecnología
Temas: Souther Blot, Northern Blot y Dot Blot
 
Presentado por: Luis Ángel Cruz Hernández
SOUTHERN BLOT
 
Método de biología molecular que
permite detectar la presencia de una
secuencia de DNA concreta en una
mezcla compleja de este ácido nucleico.
¿Qué es?
Fue inventado por un biólogo inglés
llamado Edwin Southern.
Primer método en detectar
secuencias específicas de DNA.
Emplea la técnica de electroforesis
en gel de agarosa.
https://es.wikipedia.org/wiki/Bi%C3%B3logo
https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Edwin_Southern&action=edit&redlink=1
https://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en_gel
https://es.wikipedia.org/wiki/Agarosa
1. Extracción del DNA
PASOS
2. Digestión del DNA con una
endonucleasa de restricción
El DNA extraído de la muestra se trata
con una endonucleasa de restricción, la
más usada es es HaeIII, que corta el
ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.
5´
5´3´
3´
5´
3´
5´
3´
Endonucleasa Hae III
Tras la digestión del ADN, los
fragmentos de ADN
resultantes se separan según
su tamaño mediante
electroforesis en geles de
agarosa.
3. Electroforesis en gel de agarosa
Bromuro de etidio
4. Desnaturalizar la muestra
NaOH ------------ 0.5N
NaCl -------------- 1.5 M
5. Preparación de un ensayo de Southern
El DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana
de nailon, realizando así una copia o "calco" 
A este proceso de desnaturalización y transferencia se le conoce como Southern
Placa de vidrio
Papel filtro tipo
Whatman
Gel
NYLON
Papel absorbente
6. UV Crosslinking
 
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18265088/
7. Buffer de Pre-Hibridación
Solución Denhards
Sonda Radioactiva
(comunmente Fosfáto 32)
8. Resultados después de Radiografía.
Resultados mostrados en el
artículo científico.
NORTHERN BLOT
 
Es una técnica de laboratorio que se
utiliza para detectar una secuencia de
ARN específica en un muestra de
sangre o de tejido.
¿Qué es?
Su nombre deriva de un juego de
palabras basadas en la técnica de
Southern Blot.
1. Extracción y preparación.
PASOS
Extraer ARN es más
complicado, por lo
tanto la dificultad
de esta practica
aumenta.
Formamida
Formaldeído
2. Separación por electroforesis
Bromuro de etidio
Pipetear en el gel lo más rápido posible para
evitar que el RNA se degrade.
3. Transferencia a una membrana
Placa de vidrio
Papel filtro tipo
Whatman
Gel
NYLON
Papel absorbente
con FORMAMIDA
 Crosslinking
 
Esta
Mousekeherrami
enta nos servirá
más tarde.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18265088/
4. Hibridación del RNA
Buffer de Pre-hibridación
 Formamida +
Solución Denhards
Buffer de hibridación
Tipos de Sonda
Radioactiva (Fósforo 32)
Peroxidasa de rábano (ABTS)
Biotina
 
5. Visualización de las bandas
Resultados mostrados en el
artículo científico.
EXTRAEXTRA
¡El DNA denota más¡El DNA denota más
interés que sólo suinterés que sólo su
presencia y ausencia!presencia y ausencia!
Diferentes Células bajo
diferentes condiciones o
tratamientos pueden
expresar densidades
distintas de RNA
(+placebo) (+droga)
de partida para
experimentos de
expresión génica
DOT BLOT
Es una técnica de biología molecular
para detectar biomoleculas como
proteínas o ácidos nucleicos.
¿Qué es?
La técnica ofrece importantes
ahorros en tiempo. Sin embargo, no
ofrece información sobre el tamaño
de la biomolécula blanco. 
Por lo tanto el dot blot sólo puede
confirmar la presencia o ausencia de
una biomolécula o biomoléculas
https://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADa_molecular
MONITOREO DE LA EFICACIA
DEL ETIQUEDATO
Ejemplo
PASO 1 MUESTRA ETIQUETADA CON
BIOTINA
10 uL muestra biotina
90 uL
PASO 2
PASO 3
Solución de bloqueo(Solución
Denhards) ABTS
Incubar 30 min. 15 min de lavado.
Disolución de bloqueo
Incubar 30 min. 15 min de lavado.
ABTS
Sustrato apropiado para el
desarrollo de color.
Y por último, coparamos con
una referencia estándar.
GRACIAS POR SU ATENCIÓN
<3
REFERENCIAS
Southern Blot | NHGRI. (s. f.). Genome.gov. Recuperado 9 de marzo de 2022, de
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Southern-Blot
Northern blot | NHGRI. (s. f.). Genome.gov. Recuperado 9 de marzo de 2022, de
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Northern-blot
 A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M.; Losick, R. (2004). Molecular Biology of the Gene
(Fifth edition edición). San Francisco: Benjamin Cummings. ISBN 0-321-22368-3.
 Streit, S; Michalski, C; Erkan, M; Kleef, J; Friess, H (2009). «Northern blot analysis for
detection of RNA in pancreatic cancer cells and tissues». Nature Protocols 4 (1).
Griffiths, J .F. A. et al. (2002). Genética. McGraw-Hill Interamericana. ISBN 84-486-0368-
0.
 Southern, E.M. (1975): "Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis", J Mol Biol., 98:503-517. PMID 1195397
Dot Blot Tutorial. (2020, 22 diciembre). [Vídeo]. YouTube.
https://www.youtube.com/watch?v=wO6dWx0bczQ
1.
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4.
5.
6.
7.
https://es.wikipedia.org/wiki/Especial:FuentesDeLibros/0321223683
https://archive.org/details/lccn_2001059225
https://es.wikipedia.org/wiki/Especial:FuentesDeLibros/8448603680
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1195397?dopt=Abstract