GUIA BIOMOL - Dariel Isai Soria Cordova

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GUÍA BIOLOGÍA MOLECULAR
EXTRACCIÓN DE ADN
1. Lisis
· Para el rompimiento mecánico de las células se utiliza el nitrógeno congelado, ya que forma cristales debido al descenso de temperatura tan rápido y ayudan al rompimiento de la célula.
· Se utilizan cambios de temperatura drásticos para desestabilizar la membrana de los lípidos.
· Se usan solventes y detergentes para la lisis química, se rompe la interacción lípido-lípido y lípido-proteína. Se pueden usar distintos tipos de detergentes ya que en la membrana hay distintos tipos de lípidos y proteínas. Se hacen micelas lipídicas para hacer poros. Los solventes orgánicos como el fenol, el cloroformo, crisol, para romper los enlaces con moléculas orgánicas. Con la centrifugación y el fenol-cloroformo los compuestos orgánicos precipitan en la fase fenólica/orgánica, mientras que los ácidos nucleicos se quedan en la fase acuosa. Siempre va a haber gran cantidad de proteínas gracias al grado de compactación del ADN en las histonas.
· Como método físico se utiliza la sonicación, que son longitudes de onda de sonido de alta frecuencia, se hace con la muestra en frío (para no activar a las enzimas y no degradar la muestras con altas temperaturas) y con inhibidores de RNAsas y proteasas
2. Precipitación 	
Se adiciona etanol o una solución con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato del ADN, lo que va a permitir que se reduzcan las fuerzas repulsivas entre las cadenas haciendo que el ADN se pliegue sobre sí mismo y precipite.
Salting out: ocurre en soluciones acuosas de alta fuerza iónica que reducen la solubilidad de la molécula causando que ciertas proteínas se precipiten, debido al aumento de las interacciones hidrofóbicas entre ellos
3. Lavados
Se utiliza etanol al 70%, ya que el 30% de agua se usa para disolver las sales del pellet y disminuir la concentración y aumentar la pureza de los ácidos nucleicos.
4. Pureza
Se van a analizar los ácidos nucleicos mediante el espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm, ya que a esa longitud de onda se detectan las bases nitrogenadas. Si se absorbe a una longitud de onda de 280 nm significa que hay contaminación por proteínas, las cuales se eliminan con cloroformo. Y a 230 nm vamos a observar si la muestra está contaminada por compuestos orgánicos. Si hay una relación cercana a 2 quiere decir que el material genético es más puro.
5. Integridad
Para evaluar la integridad del material genético se lleva a cabo una electroforesis, donde hay un carril de estándares con tamaños diferenciales de pares de bases.
a. Geles
Los geles se utilizan como tamices o coladores, separan los fragmentos de ADN o ARN por longitud de pares de bases, y debido a la carga negativa de la molécula, se va a correr desde el ánodo al cátodo. El gel se tiene que disolver bien en los buffers que tengan iones libres para que siga corriendo el gel, además de que la concentración de sales y el pH ayudan a que funcione el tránsito de corriente entre las cargas.
· Buffer de corrida: Tris base, sales de boratos o acetatos y EDTA (agente quelante) TAE y TBE
· Gel de carga: glicerol y colorante (SYBR green, Gel Red, bromuro de etidio, plata) 
· El bromuro de etidio es un agente intercalante de DNA de cadena doble 	
	Agarosa
	Poliacrilamida
	· Es en una cámara horizontal
· Es una fase acuosa inmersa en un líquido 				
· Se basa en densidades diferenciales para separar ácidos nucleicos de gran tamaño	
· El buffer utilizado para mezclar la muestra es el buffer de carga
 Se le agrega glicerol a la muestra para que su peso aumente y caiga en el pozo, además de un colorante para poder visualizar la banda
· Se puede preparar una solución 0.4% al 3% de gel y se tiene que disolver en el mismo buffer para mantener las mismas características electroquímicas iónicas.
	· Es en una cámara vertical
Acrilamida: polímeros verticales
 Bisacrilamida: redes de interacción. Las proporciones de estos compuestos hablan de la estabilidad del enlace del polímero formado. 29:1			
· Concentración; 4%-15%
Gran capacidad resolutiva diferencial de hasta un par de bases. 0.75 mm – 1mm de grosor
· TEMED y persulfato de amonio: inducen a la polimerización, agentes facilitadores y catalizadores de la polimerización.
· Se usa plata para revelar la banda, serán cafés y el gel amarillento
 
TÉCNICAS DE TRANSFERENCIA
Son técnicas de hibridación para identificar una secuencia por complementariedad
1. Southern Blot: 
Técnica molecular para identificar la presencia de un fragmento de ADN, si es que está inserto.
a. Extracción del DNA:
b. Digestión del DNA con una endonucleasa de restricción que corta el DNA, se llama 5´GGCC3´ HAE III, estas reconocen el palíndromo. 
c. Se hace una electroforesis y Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa.
d. Para la deshibridación y ruptura de puentes de hidrógeno se utiliza sosa. 
e. El fragmento de ADN que se quiere transferir se transfiere a una membrana de nylon o de nitrocelulosa. Se utiliza la membrana de nylon gracias a las NH2 libres que harán enlaces con las bases nitrogenadas libres, se utiliza papel absorbente.
f. También se utiliza esperma de salmón para que bloquee lo que hay en la membrana al momento de lanzar la sonda esta sea específica
g. Para que el DNA se quede pegado a la membrana se va a usar UV-crosslinking, para fijar los enlaces que se hacen por electronegatividad, y el UV va a propiciar que los enlaces sean covalentes.
h. Buffer de pre hibridación: Para la prehibridación se utiliza una sonda denhards, la cual es una sonda de DNA de cadena sencilla con un fragmento marcado con fósforo 32 o fluorocromo
Posteriormente se hacen muchos lavados con buffers. Una vez lavada la membrana, se coloca junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aisle de la luz, la película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva
2. Northern Blot: 
Aunque para ver si un gen se está expresando o no se evalúa la presencia de RNA. Se utiliza un buffer con formaldehído, formamida o urea para mantener las estructuras primarias del RNA.
Tipos de sonda:
· Radiactiva: fósforo 32	
· Peroxidasa de rábano (ABTS)
· Biotina
3. Dot blot:
Detecta concentraciones y si está presente. Es un tamizaje previo.
a. Muestra etiquetada con biotina, que va a reaccionar establemente con la estructura de la estreptabidina para marcar 
b. varias disoluciones cada vez menos concentración
c. Preparar membrana, pequeñas alícuotas de la muestra en la membrana 
d. Incubar en solución de bloqueo 30 min
e. Lavar con ABTS
f. Agregar sustrato apropiado para el desarrollo del color
Técnicas de amplificación
· PCR tiempo final 
PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
Sirve para amplificar masivamente una fragmento de ADN
a. Termociclador: elevar la temperatura a 94-99°C para romper los puentes de hidrógeno y deshibridar la doble hélice del ADN, por 30-40s.
b. Bajar la temperatura a 55°C Para que los primers se unan al fragmento de ADN específico. Hibridan de 5´-3´ hasta donde la polimerasa amplifique. El tamaño de los primers es de 15-20 pb (entre más largo más específico). termina en CG, y el 50% de sus bases nitrogenadas tienen que ser GC. Temperatura de hibridación: 45-60°C, ya que a menor temperatura estos harían dímeros.
c. Elevar a 72° para permitir la acción de la Taq polimerasa, 1 min por cada mil pb)
No hay PCR de RNA, porque se usa una DNA polimerasa aunque se haga una retrotranscripción ya no será igual al DNA del que se sintetizó, ya que harán falta los intrones.
· RT-PCR
Utiliza RNAm, se utiliza para saber el nivel de expresión. Solo los RNAm tienen polyAAA, y se utiliza TTT OLrdt. Se utiliza un anzuelo de PolyAAA. 
· PCR multiplex
Amplificar varios genes para diferenciarlos en una misma región. Son necesarios diferentes sets de primers (forward and reverse), aunque tiene la desventaja de que puede haber competitividad, deber ser muy específicos, hibridar a la misma temperatura, ya que pueden amplificarproductos inespecíficos.
· PCR anidada
Donde el producto de una amplificación es utilizado como molde para una segunda amplificación. Es muy específica y sensible. Son necesarios 2 pares de primers, unos para la primer amplificación, y los otros para la segunda amplificación con mayor cantidad de ciclos 
· PCR tiempo real
Se utiliza para ver la concentración de ADN y ver variaciones en los alelos, además de la detección y estudio cuantitativo de expresión de genes. Tiempo real: en cada ciclo se detecta la amplificación de los productos. Es muy sensible, específico y eficaz.
Mientras se lleva a cabo la reacción se puede saber la cantidad de ADN que se ha amplificado. Los nucleótidos interaccionan con un colorante que dará fluorescencia. Entre más fluorescencia más concentración de amplicón.
Método específico: Transferencia de energía de resonancia fluorescente, hay un donante: da energía al receptor, la fluorescencia de emisión excita al otro fluorocromo; el receptor, contiene una parte que expresa fluorescencia, lo desencadena la energía dada por el donante. Estos van a hibridar sobre el producto de amplificación, si se separan más de 5 bases ya no funcionan. 
Sondas Taqman: es un fragmento complementario a la cadena amplificada que contiene un fluoróforo que emite fluorescencia a lo largo de la reacción.
Molécula quencher: con un espectro de absorción igual al espectro de emisión del fluoróforo por lo que le robará electrones impidiendo que dé alguna señal. Habrá una polimerasa que sea capaz de hidrolizar a la sonda y al separarse el quencher y el fluoróforo, este emitirá fluorescencia. Su temperatura tiene que ser igual a la de los primers. 
Habrá una curva de amplificación, en el eje de las x el número de ciclos, y en el eje de las y la fluorescencia emitida para obtener la fluorescencia dada en cada ciclo. Se utiliza la segunda derivada. Al graficar la eficiencia de la reacción con , si este valor es =2 significa que cada 2 ciclos se amplifica, ciclos x log de concentración
Cuantificación absoluta 
Para conocer el número exacto de copias, la concentración de ácidos nucleicos
Cuantificación relativa
Comparar qué tanto se sobreexpresa un gen respecto a un gen housekeeping (que siempre se expresa). Se usa cuando no necesitas saber el número de moléculas 
 
Técnicas de secuenciación 
Secuenciar: para conocer la secuencia concreta de los nucleótidos que componen los ácidos nucleicos. 
· Secuenciación de Sanger 
La secuenciación de Sanger se basa en la polimerización del ADN y el uso de dideoxinuleotidos que sirven como terminadores de la reacción. 
Los dideoxinucleotidos (ddNTP) sirven como terminadores de la reaccion ya que en el carbono 3´ no tienen el grupo hidroxilo OH y sin este no pueden continuar la elongación por no poder formar enlaces fosfodiestes con el siguiente deoxinucleótidos (dNTP) que la polimerasa agrega en la síntesis y por ello se interrumpe con este ddNTP. 
1. se aísla y se clona el ADN que se desea secuenciar; este ADN se desnaturaliza y se emplea una sola hebra en la secuenciación.
2. Se utiliza un iniciador o primer marcado radiactivamente, el cual usualmente es un fragmento de restricción, que suministra el extremo 3’ OH que necesita la ADN polimerasa para continuar la adición de nucleótidos.
3. Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el ADN molde de hebra sencilla que se desea secuenciar, la ADN polimerasa, el iniciador marcado radiactivamente y los cuatro dNTP. 
4. A cada tubo se le añade uno de los ddNTP en exceso.
5. En cada uno de estos tubos se producirán cadenas de ADN de distintas longitudes, terminando todas en el lugar en el que se incorporó el ddNTP. En el segundo tubo, habrá una mezcla de fragmentos secuenciados interrumpidos por otro ddNTP (por ejemplo, ddGTP), en el tercero por otro (ddCTP) y en el cuarto por el último (ddTTP). A continuación, el contenido de cada uno de los tubos se corre en carreras diferentes de un gel (cada mezcla de reacción en un carril) por electroforesis vertical en gel de poliacrilamida-urea en condiciones desnaturalizantes (acrilamida 12% con urea 8 M), con resolución de un solo nucleótido.
· Secuenciación en capilar
Secuenciacion Sanger en electroforesis capilar
Actualmente la reacción de secuenciación se basa en una modificación de la PCR con didesoxinucleótidos (ddNTP´s) marcados con fluorocromos y se resuelve mediante electroforesis capilar.
El método se apoya en 2 conceptos fundamentales: la síntesis a cargo de un ADN polimerasa y el uso de nucleótidos terminadores.
Los fragemtnos se mueven por el gel. Y se ordenan de los más prequeños a los más grandes de abajo hacia arriba.. Después, por medio de un laser se excitan los fluorofors y el lector de onda lee a que longitud de onda esta el floroforo. Todos los fluoroforso emiten a distintas longitudes de ondas, la cual es captada por la camara lector de ondas.
Técnica actual
Utilizan didesoxinucleótidos marcados con fluorocromos, para la identificación de los fragmentos (fluorocromos como alternativa a los isótopos radioactivos).
1. Dado que se emplea una ADN polimerasa para sintetizar hebras complementarias a la que se quiere secuenciar ,una primera característica del método es la necesidad de un cebador, un oligonucleótido diseñado para que se hibride con el extremo 3' de la región que se quiere secuenciar.
2. La segunda y principal característica de este método de secuenciación es el uso de didesoxinucleótidos, análogos estructurales de los desoxinucleotidos pero que provocan la detención de la reacción de síntesis de DNA. 
3. La posibilidad de usar un fluorocromo distinto en cada una de las 4 reacciones de síntesis permite automatizar el método, de forma que se ‘‘lean’’ simultáneamente las hebras marcadas componentes de las 4 mezclas. Además, esta lectura de la fluorescencia se puede hacer en continuo, con lo que la electroforesis sigue transcurriendo, las moléculas de menor tamaño, ya detectadas, salen por el extremo inferior del gel (avanzan por el gel a traves de un tubo capilar), y se sigue consiguiendo la separación de moléculas mayores en el gel, de modo que se amplía el número de nucleótidos que es posible secuenciar en un solo experimento.
4. el fragmento de ADN fluorescente pasa por el punto de tensión del secuenciador automático, y estas señales se envían a una computadora con un programa especial. Así, un golpe de láser excita la tinción fluorescente, la señal de fluorescencia emitida se digitaliza y es captada por detectores que una computadora analiza y descifra, y pueden observarse los resultados obtenidos en tiempo real. Cada muestra secuenciada se crean curvas de cuatro colores, uno por cada nucleótido, y debajo de cada pico de la secuencia se identifica la secuencia de nucleótidos correspondientes al fragmento analizado.
· Secuenciación masiva
La indicación ‘‘masiva’’, si bien no aporta información precisa, transmite la idea de que una de las principales características es la capacidad de procesar cada vez mayor número de muestras en paralelo, en un tiempo cada vez menor.
· Pirosecuenciación 
La pirosecuenciación es un sistema basado en el método enzimático, que aprovecha la liberación de pirofosfato cuando un nucleótido se incorpora en la hebra de ADN en crecimiento, mediante bioluminiscencia; es un sistema útil para analizar tanto secuencias cortas de ADN como polimorfismos de nucleótido simple (SNP) y genotipificación.
· Ion Torrent 
· Fish
Técnica denominada hibridación in situ con fluorescencia (FISH, fluorescence in situ hybridization).
La especifi cidad de la hibridación in situ se basa en la unión de una sonda con una secuencia complementaria de ADN o ARN.
No se requiere la extracción de ácidos nucleicos (como en Southern y Northern Blot), ya que la detección e hibridación se realizan en el mismo tejido mediante la aplicación de cadenas complementarias que tienen unidas moléculas informadoras (sondas).
1. Preparación de sondas
2. Desnaturalización de sondas y especimenes 
3. Hibridacion 
4. Detección (lavado y visualización)