Teórico 47A Metabolismo de Ácidos nucleicos Replicación 2021 - Marianela Bella

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REPLICACIÓN DEL ADN
Docente: Paula Casati
La replicación del ADN 
es el proceso mediante el cual 
se producen copias (réplicas) exactas del 
ADN cromosómico para su posterior 
segregación 
en las células hijas
Involucra 3 etapas: inicio, 
elongación o síntesis y terminación
Características de la replicación
1. Semiconservativa
2. Bidireccional
3. Dirección 5´a 3´ y semidiscontinua
1. Semiconservativa
Se originan dos moléculas de ADN formadas por 
una hebra parental y 
una hebra recientemente sintetizada
1. Semiconservativa: Experimento de Meselson y Stahl
El isótopo 15N no es 
radioactivo, sólo más 
pesado que el isótopo 
más abundante, 14N
El ADN se posiciona en 
una banda estrecha 
donde su densidad 
iguala la densidad de la 
solución salinaA velocidades 
elevadas, se establece 
un gradiente lineal de 
la sal
1957
Bacterias 
crecidas en 
15N por 
muchas 
generaciones
Bacterias 
transferidas 
14N y crecidas 
hasta una 
duplicación 
celular
Bacterias 
crecidas 
durante una 
segunda 
generación en 
14N 
1. Semiconservativa
2. Bidireccional
La replicación es bidireccional 
para la mayoría de los 
organismos, es decir, 
procede mediante 
dos horquillas de replicación 
independientes
E. coli crecida con [3H]timidina 
Extracción del ADN 
Autoradiografía
Evidencia experimental
2. Bidireccional
ADN lineal - Virus
Algunos plásmidos bacterianos
Otra variantes
Información adicional 
3. Dirección 5´a 3´ y discontinua
El ADN se sintetiza en dirección 5´a 3´debido a la 
polaridad de la ADN polimerasa
Una de las hebras se sintetiza de
manera continua (hebra adelantada) y
su hebra complementaria antiparalela
se sintetiza de manera discontinua
(hebra rezagada)
1. ¿Cómo comienza, progresa a lo largo del
cromosoma y termina la replicación?
2. ¿Cómo se sintetizan ambas hebras de
manera coordinada?
3. ¿Qué mecanismo asegura que ocurra 1
sóla vez antes de la división celular?
Preguntas sobre la Replicación
Etapas en la replicación del ADN 
en E. coli
1. Inicio
2. Elongación
3. Terminación
En un sitio específico: oriC en E. coli
con secuencias altamente conservadas
enriquecido en secuencias d(GATC) 
secuencias ricas en A:T
1. Inicio
También requiere HU 
(prot tipo histona)
2 horquillas
1. Inicio
Cada origen de 
replicación
inicia la 
formación 
de horquillas 
bidireccionales
Apertura local de la hélice de ADN
Horquilla 1 Horquilla 2
1. Inicio
El inicio de la replicación es 
la única etapa regulada
Ocurre 1 sola vez/ciclo celular 
Mecanismo de regulación aún en estudio. Se postula que 
participan:
- el estado de metilación del ADN e interacciones con la 
membrana plasmática. El ADN recién sintetizado está 
hemimetilado y queda secuestrado por la membrana. 
Cuando el ADN se libera, se debe metilar antes de una 
nueva replicación
- lenta hidrólisis del ATP por DnaA que cicla entre un estado 
activo (unida a ATP) e inactiva (unida a ADP) 
2. Elongación
1. Las dos hebras se separan por la ADN HELICASA 
mediante la hidrólisis del ATP
E. coli posee varias helicasas, DnaB es la principal (Desplazamiento 5´a 3´; 
Hexámero). 
Otras: 3´a 5´, Monómeros u oligómeros
Se genera superenrollamiento delante 
de la horquilla.
Si no se alivia, se incrementa la tensión y 
se bloquea la replicación
Interconversión de los
isómeros topológicos del ADN
2. La torsión local debe ser liberada por las TOPOISOMERASAS
Mecanismo de acción de las topoisomerasas 
involucra 3 etapas:
1. Escisión de 1 o 2 hebras del ADN
2. Liberación de la tensión local del superenrollamiento
3. Reparación de la escisión 
Tipo I: Escinden una de las hebras del ADN (Topoisomerasas I y III)
Tipo II: Escinden ambas hebras del ADN a expensas de la hidrólisis
del ATP (Topoisomerasas II y IV)
 Forman intermediarios covalentes con el 
ADN
Topoisomerasas
Tipo I
Mecanismo de acción de la Topoisomerasa Tipo I
Formación de un intermediario 
covalente ADN-enzima
y ruptura de un enlace fosfodiéster 
en 1 de las hebras
Topoisomerasas
Tipo II
Knotting
Drogas que inhiben la ADN Topoisomerasa I
Se usa en tratamientos de cánceres colorectales, ováricos y de pulmón
N
N
O
O
O
CH3CH2
OH
C-10 C-9
Camptothecin
Topotecan
H H
OH (CH3)2NHCH2
9
10
Estabilización del intermediario Topo I/ADN, 
evitando la re-ligación del ADN
 Las Topoisomerasas son blancos
de drogas farmaceúticas
Información adicional 
Antibióticos que inhiben la Topoisomerasa II 
(ADN girasa) bacteriana
N NH3C
O
COOH
Et
NN
O
COOHF
NH
Nalidixic acid
Ciprofloxacin
Interferencia con la escisión y unión del ADN
O
H3CO
O OH
O NH2
CH3
CH3
O
O
CH3
OH
N
H
CH3
CH3
O
O OH
Novobiocin
Inhibición de la unión de ATP
Información adicional 
• Previene la formación de la 
estructura secundaria del ADN
• Promueve el desenrollamiento de 
la doble hélice por la DnaB 
helicasa
• El ADNss queda protegido del re-
apareamiento y de la degradación 
por endonucleasas
• Se une al esqueleto de azúcar-
fosfato y mantiene las bases 
expuestas a la ADN polimerasa
• La unión SSB-ADNss es altamente 
cooperativa
3. Unión de SSB 
(Single Strand Binding protein= proteínas de unión a simple hebra)
4. Se sintetiza un cebador de ARN por la ADN PRIMASA
(DnaG) para iniciar la síntesis de ADN
¿Por qué un cebador de ARN?
• La ADN polimerasa no puede iniciar la síntesis de las
hebras de novo. REQUIERE DE UN CEBADOR (sólo
agrega nucléotidos a una hebra preexistente (3´OH libre)). 
• La ADN polimerasa comprueba que el par de bases 
precedente sean correctos antes de incorporar uno nuevo, 
entonces no podría comprobar el primer nucleótido
agregado.
• El cebador presenta baja fidelidad y está constituido por
ribonucléotidos que lo “marcan” para su posterior reemplazo
por desoxirribonucleótidos de alta fidelidad.
1. Molde de ADN (simple hebra o doble hebra con una escisión) 
2. Un cebador con un 3´OH libre 
3. Desoxirribonucléotidos 5´-trifosfatos 
(dATP, dGTP, dTTP y dCTP)
4. Mg2+ para activar a los dNTPs
Reacción general
2Pi
(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi
Requisitos de las ADN polimerasas
5. Síntesis simultánea de ambas hebras antiparalelas en 
dirección 5´ a 3´ por la ADN polimerasa III
Pulgar Dedos
Palma
ADN
Sintetiza el ADN incorporando 
nuevos dNTPs según los 
apareamientos de Watson y Crick
Mg2+
- Une dNTP y 3´OH
- Une dNTP y estabiliza carga PPi
fosfoanhídrido
fosfodiéster
ADN polimerasa III de E. coli
• Responsable de la mayor parte de la síntesis del 
ADN
• Enzima compleja de gran tamaño (800 kDa) formada 
por 10 subunidades
• Altamente procesiva (la enzima se disocia luego de 
haber agregado ≥ 500.000 nt)
• Velocidad de polimerización elevada (hasta 1000 
nt/seg)
• Alta fidelidad (incorpora 1 error/109-1010 nt)
Dímero asimétrico
Cargador 
de la 
abrazadera
ADN polimerasa III 
de E. coli
α: Polimerasa
ε: 3'-5' exonucleasa
Abrazadera deslizante
Polimerasa
núcleo
Información adicional 
 Mantiene a la ADN pol III sobre el ADN
 Permite que se repliquen largos segmentos de
ADN antes de disociarse
 aumenta la procesividad de la ADN pol III
Abrazadera deslizante β2
Complejo de carga de la abrazadera
“clamp loader”
 Posiciona la abrazadera deslizante β2 sobre el ADN
Fidelidad de la replicación
1. Complementariedad de bases
Formación de puentes H entre las bases complementarias
2. Selectividad del dNTP adicionado
Cambio conformacional en la ADN pol generado por la 
adición de un dNTP correctamente apareado
3. Interacciones en el surco menor
Formación de puentes H entre residuos de AA del sitio 
activo de la ADN pol y átomos de las bases del surco 
menor
4. Corrección de errores
Actividad exonucleasa 3´a 5´ de la ADN pol
Probabilidad de errores en la polimerización 
10-7 (1 in 10.000.000 nt)
1. Complementariedad de bases
La geometría es diferente para los 
pares de bases incorrectamente apareados2. Selectividad del dNTP adicionado
pulgar
dedos
dNTP correcto induce un cambio conformacional en la 
ADN pol
(rotación de dominios forman un bolsillo rígido)
3. Interacciones en el surco menor
Residuos de Arg y Gln de la ADN pol forman puentes H 
con el nuevo par de bases formado
4. Corrección de errores
Energéticamente costoso
elimina 1 nt correcto
cada 20 nt incorporados
Esencial
aumenta la fidelidad 1000 veces
Si la polimerasa incorpora un nt incorrecto
la translocación de la enzima a la posición 
donde el siguiente nt debe ser incorporado 
es inhibida
3’
5’
(1000 – 2000 nt)
¿Cómo se asegura la síntesis coordinada de ambas hebras?
Replicación de la hebra rezagada
El molde de la hebra rezagada 
forma un bucle para que ambas 
hebras se sinteticen en 
la misma dirección
A medida que la helicasa 
desenrolla el molde, la 
primasa se une a DnaB,
sintetiza un nuevo cebador 
y posteriormente se disocia
Síntesis coordinada entre 
las hebras guía y rezagada 
por la ADN pol III
5´
3´
3´
5´
(αεθ) 3´
5´
Cuando la pol encuentra el fragmento de Okazaki 
anterior, libera el ADN y la abrazadera β
Una nueva abrazadera β se 
posiciona sobre el nuevo cebador.
Al mismo tiempo, 
se completa la síntesis del 
fragmento de Okazaki
La pol se une a otra abrazadera β
y otro cebador recientemente 
sintetizado y comienza la síntesis 
de un nuevo fragmento de Okazaki 
escisión
ARN
Replicación de la hebra rezagada:
 Los cebadores de ARN son removidos y reemplazados por la ADN pol I 
 Las escisiones son selladas por la ADN ligasa
 extiende el fragmento de Okazaki, 
al mismo tiempo que remueve el 
cebador de ARN gracias (actividad 
exonucleasa 5´a 3´)
 se disocia luego de extender el 
fragmento de Okazaki en 10-12 nt
Este proceso origina el 
corrimiento de la escisión sobre 
la hebra rezagada (“nick 
translation”)
ADN pol I
Cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el 3´OH y 5´fosfato 
sellando la escisión y creando una hebra rezagada continua.
El mecanismo de acción involucra la activación del 5’fosfato para el ataque 
nucleofílico mediante una transesterificación con AMP activado
ADN ligasa
Mecanismo de acción
ADN ligasa
(Virus o eucaroiotas)
(Bacterias)
-ADN pol II: en la reparación
-ADN pol IV y V: en la reparación
https://youtu.be/bee6PWUgPo8
Síntesis coordinada entre las hebras guía y 
rezagada por la ADN pol III
3. Terminación
 Participa en la 
terminación de la 
replicación,
separando de los 
cromosomas catenados
Topoisomerasa IV (tipo II)
E. coli Humanos
Tiempo 42 min 8 horas
Tamaño del 
genoma
4.639.221 bp 6 x 109 bp
Long cromosomal 1.4 mm 2 m
Velocidad 1000 
bp/seg/horquilla
100 
bp/seg/horquilla
Comparando….
Información adicional 
Replicación en células eucariotas
1. El ADN se replica durante la fase S del ciclo
cellular: Las ciclinas y proteínas quinasas 
dependientes de ciclinas (CDK) regulan el inicio de 
la replicación por distintos mecanismos
2. Múltiples orígenes de replicación
3. Cromosoma lineal
4. Síntesis de telómeros por telomerasas
5. ADN polimerasas