Practica 10 - Determinación de C perfringens-VIRTUAL - José Alejandro Del Campo Vázquez

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA (BT1007) 
 
PRACTICA 10. DETERMINACIÓN DE Clostridium perfringens. 
 
OBJETIVO: 
Conocer el procedimiento para determinar la presencia de un microorganismo 
anaerobio; patógeno para los animales (enterotoxemias) y para el hombre (toxiinfecciones 
alimentarias: Clostridium perfringens tipo A). 
 
INTRODUCCIÓN: 
El género Clostridium está formado por un grupo heterogéneo de bacilos Gram-
positivos anaerobios estrictos esporulados. Está ampliamente distribuido en la naturaleza, 
principalmente en el suelo y en el tracto intestinal de muchas especies animales incluido el 
hombre, y puede causar infecciones de origen exógeno y de origen endógeno. En la 
actualidad se han descrito más de 150 especies, aunque sólo alrededor de 30 han sido 
asociadas con infección humana, siendo Clostridium perfringens la especie más frecuente. 
Para que sea causa de toxiinfección alimentaria, debe estar presente en el alimento en cifras 
elevadas, superiores a 106 Cl. perfringens por gramo. 
 
Muchas especies del género Clostridium tienen capacidad de producir potentes 
exotoxinas que son las responsables de ocasionar graves cuadros tóxicos. Clostridium 
perfringens puede elaborar una gran variedad de ellas (11 histotoxinas y 1 enterotoxina) y, 
dependiendo de la producción de las cuatro toxinas principales, la especie se divide en cinco 
tipos (tabla 1). 
 
 
 
La alfa-toxina (fosfolipasa C, lecitinasa) juega un papel primordial en la patogenia de 
la gangrena gaseosa, la beta-toxina de C. perfringens tipo C está implicada en la enteritis 
necrótica y la enterotoxina de C. perfringens tipo A en las intoxicaciones alimentarias. Estos 
cuadros tóxicos, en general bien caracterizados, son principalmente infecciones exógenas. 
Actualmente y en nuestro medio, son mucho más frecuentes las infecciones por especies del 
género Clostridium de origen endógeno, generalmente menos específicas, en las cuales la 
acción patógena no suele ser debida a las toxinas sino a otros factores de virulencia. Pueden 
afectar a cualquier órgano o sistema, pero sobre todo a aquellos cercanos a las superficies 
mucosas, donde son parte abundante de la biota comensal. Asimismo, se trata 
frecuentemente de infecciones mixtas en donde estos microorganismos se encuentran junto 
a otras bacterias anaerobias o facultativas. Su gravedad es, en general, la misma que la de 
otras infecciones polimicrobianas, pero puede variar dependiendo de una serie de factores, 
desde cuadros en donde su presencia es de dudosa significación a gravísimos cuadros de 
mionecrosis y de bacteriemias con shock. 
 
C. perfringens es un microorganismo telúrico ampliamente distribuido en la 
naturaleza (suelo, polvo, sedimento marino, moscas, etc.) que se encuentra en el intestino 
de hombres sanos así como en ganado porcino y bovino, también sanos. Sin embargo, puede 
causar enfermedades tanto a humanos como animales. 
 
 
 
METODOLOGÍA: 
 
PRE-ENRIQUECIMIENTO: 
1. Inocular 10g del alimento en 100ml de caldo tioglicolato. 
2. Incubar a 46°C en baño maría por 4 a 6 horas. 
3. Observar turbidez y producción de gas en el medio inoculado 
4. Hacer diluciones a partir de la muestra inoculada de 10-1 hasta 10-5. 
 
 
AISLAMIENTO Y RECUENTO EN MEDIO SELECTIVO: 
1. Colocar 0.1ml de cada dilución en las superficies de placas con agar TSN (Triptona Sulfito 
Neomicina) y distribuir con varilla de vidrio hasta que seque completamente. 
2. Adicionar una sobrecapa de 5ml de medio TSN. 
3. Incubar placas hacia arriba (no invertidas) en condiciones de anaerobiosis por 18 a 24hrs 
a 37°C. 
4. Seleccionar cajas que contengan entre 30 y 300 colonias y efectuar recuento de colonias 
con morfología típica: negras de 2-3mm de diámetro. 
 
ACTIVIDADES: 
 
1) De manera individual realiza un diagrama donde especifiques todos los pasos 
detallados para llevar a cabo el procedimiento de la práctica. 
2) En equipo leer y procesar los siguientes resultados e incluirlos en su reporte: 
 
Resultados 
Pre-enriquecimiento 
Tras el pre-enriquecimiento realizado en caldo tioglicolato, se pudo apreciar que la 
coloración de este medio líquido adquirió una gran turbidez, sin embargo, no se 
observó producción de gas. 
 
Imagen 1. Pre-enriquecimiento de las bacterias contenidas en 10 g de una pieza de 
pollo en 100 mL de caldo tioglicolato 
 
Aislamiento y recuento en medio selectivo 
Después periodo de incubación a 37°C de los cultivos realizados en el medio de agar 
Triptona Sulfito Neomicina, se pudo observar el crecimiento de colonias de bacterias 
de entre 1 mm y 3 mm de diámetro repartidas en toda la superficie, de colores negro 
y amarillo crema, con formas ovaladas y circulares, bordes enteros, sin elevación y 
con textura cremosa. Las colonias negras únicamente se presentaron en los medios 
inoculados con las diluciones 10−1 y 10−2 y las amarillas en todos los cultivos. 
Adicionalmente, se detectó el crecimiento de colonias de hongos en las placas que 
contenían las diluciones 10−3, 10−4 y 10−5; las características de estas colonias eran: 
forma y borde filamentoso, elevación acuminada, textura algodonosa y superficie 
seca. Tras realizar el recuento se obtuvieron los siguientes datos: 
Dilución Imagen Recuento de colonias 
10−1 
 
Clostridium 
perfringens: 64 
 
Otras bacterias 
anaerobias: >250 
 
Hongos: 0 
 
Total: >250 
10−2 
 
Clostridium 
perfringens: 1 
 
Otras bacterias 
anaerobias: >250 
 
Hongos: 0 
 
Total: >250 
10−3 
 
Clostridium 
perfringens: 0 
 
Otras bacterias 
anaerobias: 676 
(169 en un cuadrante) 
 
Hongos: 4 
 
Total: >250 
10−4 
 
Clostridium 
perfringens: 0 
 
Otras bacterias 
anaerobias: 152 
 
Hongos: 12 
 
Total: 164 
10−5 
 
Clostridium 
perfringens: 0 
 
Otras bacterias 
anaerobias: 3 
 
Hongos: 27 
 
Total: 30 
Tabla 1. Resultados obtenidos del recuento de colonias en los medios de cultivo 
Carga microbiana total 
Dilución 10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 
Número de 
colonias 
>250 >250 >250 164 30 
UFC/g (164)(104) + (30)(105)
2
= 2 320 000 
≈ 2 300 000 𝑈𝐹𝐶/𝑔 
Tabla 2. Cálculo de los valores de la carga microbiana total en la muestra de pollo 
Carga de Clostridium perfringens 
Dilución 10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 
Número de 
colonias 
64 1 0 0 0 
UFC/g (64)(101) + (1)(102)
2
= 370 
≈ 370 𝑈𝐹𝐶/𝑔 
Tabla 3. Cálculo de los valores de la carga de Clostridium perfringens en la muestra 
de pollo 
Carga de bacterias anaerobias 
Dilución 10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 
Número de 
colonias 
>250 >250 >250 152 3 
UFC/g (152)(104) + (3)(105)
2
= 910 000 
≈ 910 000 𝑈𝐹𝐶/𝑔 
Tabla 4. Cálculo de los valores de la carga de otras bacterias anaerobias en la 
muestra de pollo 
Carga de hongos 
Dilución 10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 
Número de 
colonias 
0 0 4 12 27 
UFC/g (4)(103) + (12)(104) + (27)(105)
3
= 941 333 
≈ 940 000 𝑈𝐹𝐶/𝑔 
Tabla 5. Cálculo de los valores de la carga de hongos en la muestra de pollo 
 
 
3) CUESTIONARIO: 
 
1. Explique la acción patógena de C. perfringens para el hombre y sus repercusiones 
médicas. 
 
2. Explique detalladamente las características de las enterotoxinas que produce. 
 
3. Mencione que pruebas bioquímicas pueden identificar a C. perfringens y sus resultados