Práctica 2 Aislamiento e identificación de m o -2 - José Alejandro Del Campo Vázquez

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Dra. Rocío Aurora Sandoval Chávez 
 
 
PRACTICA 2. AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y OBTENCIÓN DE 
CULTIVOS PUROS/AXÉNICOS DE BACTERIAS. 
CARACTERIZACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA (TINCIÓN DE GRAM) 
 
 
OBJETIVOS: 
Aislar e identificar bacterias en una muestra problema por medio del empleo de 
técnicas de aislamiento (utilizando la técnica de siembras continuas por estriación en 
superficie), purificar a un cultivo axénico, caracterizar macroscópicamente y 
microscópicamente: identificar forma y tipo de agrupación de las bacterias por medio de la 
tinción de Gram. 
 
Introducción: 
En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas 
(cultivos mixtos) de una gran variedad de tipos diferentes. Sin embargo, para su estudio es 
necesario aislarlos e identificarlos en cultivos puros o axénicos, también denominados 
cepa (formados por un solo tipo celular). Un cultivo de microorganismos se refiere a la 
diseminación y reproducción de los mismos en sustratos de nutrientes o medios de cultivo 
(líquidos o caldos y sólidos o agares) que favorecen su desarrollo junto con una serie de 
factores físicos (temperatura, pH, presión osmótica, disponibilidad de oxígeno y agua). 
 
El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, 
una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o líquido, esterilizado 
previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se 
multiplicará o clonará en condiciones favorables. 
 
Un clon está constituido por una población de células descendientes de un solo 
microorganismo. Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler 
contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad 
pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa, será más que suficiente para efectuar una 
transferencia exitosa. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible 
sobre la superficie de un medio sólido. Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por 
cierto tiempo en el mismo tubo o matraz o placa, debe ser transferido o resembrado a un 
medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden 
continuar. 
 
La identificación de los microorganismos se lleva a cabo por una serie de técnicas asépticas 
de laboratorio (técnicas en las cuales todo el material, medios de cultivo y área de trabajo 
deben estar esterilizadas o libres de microorganismos). El procedimiento incluye las 
siguientes etapas: 
 
1. Muestra o espécimen 
 
2. Inoculación en medios de cultivo 
 
3. Aislamiento 
Dra. Rocío Aurora Sandoval Chávez 
 
 
4. Caracterización macroscópica de las colonias 
 
5. Identificación microscópica, bioquímica, serológica y genética 
 
 
1. Muestra o espécimen. 
Fuente u origen de los microorganismos generalmente en poblaciones mixtas 
dependiendo de su origen (naturales, alimentos, fluidos biológicos). A partir de esta 
muestra se toma una pequeña porción o inoculo, con ayuda de un asa de cultivo, 
previamente esterilizada 
 
 Preparación de las muestras para su análisis: 
La operación de preparación de muestras para el análisis microbiológico exige reglas 
de manipulación aséptica muy estrictas, así como la utilización de material y diluyentes 
estériles, para evitar la contaminación del alimento. 
 
 Toma de muestra para su análisis: 
❖ La fracción de muestra para el análisis microbiológico debe ser representativa de la 
totalidad de la muestra. En general la muestra analítica será de 200 g. Para las 
distintas determinaciones se utilizan 100 g; el resto se guarda en refrigeración por si 
es necesario repetir el análisis. 
❖ Si el alimento está integrado de diferentes componentes, se tomarán fracciones 
representativas de cada uno de ellos en superficie y profundidad. 
❖ La toma de muestra se hará en condiciones asépticas y con material estéril, siempre 
en las proximidades del mechero o utilizando de ser posible una cámara de flujo 
laminar. 
 
 Diluyente: 
La característica principal de un buen diluyente es que no produzca modificaciones 
cualitativas ni cuantitativas en la flora de los alimentos que van a ser analizados, es 
decir, que mantenga fielmente la flora sin suprimir ni favorecer su desarrollo. 
En Microbiología de Alimentos se utilizan los siguientes diluyentes: 
o Agua peptonada 
o Agua de triptona con sal 
o Solución amortiguadora de fosfatos o tamponada 
o Solución de Ringer ¼ conc. (Salmonella y Listeria monocytogenes) 
 
 Triturado y homogenizado de la muestra: 
En el homogenizado o triturado de la muestra es importante evitar la destrucción de 
los microorganismos por rotura de su membrana o por un calentamiento excesivo. 
Además de una perfecta trituración de la muestra es importante obtener una mezcla 
homogénea para lograr una distribución equilibrada de los microorganismos y sus 
toxinas de estar presentes. 
Tipos de trituradores u homogenizadores: 
➢ Triturador de paletas (Stomacher), actúa golpeando rítmicamente la mezcla del 
alimento y diluyente que ha sido introducida previamente en una bolsa de plástico 
estéril. Los choques producidos por las paletas dislaceran el alimento y liberan las 
bacterias en suspensión. 
➢ Licuadora con vasos, aspas y tapa estériles. 
2. Inoculación en medios de cultivo 
Dra. Rocío Aurora Sandoval Chávez 
 
Diseminación del inoculo en los medios de cultivo por técnicas de inoculación 
específicas dependiendo del objetivo de la identificación o estudio 
 
 
 
 
 
http://www.liceopas.com.ar/Areas/Exactas_y_natur/Laboratorio/Bactereologia/Tecnica
s_microbiologicas.htm 
3. Aislamiento. 
Consiste en la incubación a temperatura controlada de los cultivos de microorganismos 
para favorecer su crecimiento y desarrollo bajo condiciones óptimas de crecimiento, con 
el objetivo de obtener cultivos puros, para lo cual se pueden realizar resiembras de los 
cultivos problema o mixto 
Resembrar, se refiere a traspasar a un nuevo medio de cultivo un tipo de 
microorganismos en particular a partir de un cultivo mixto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. Caracterización o Inspección macroscópica. 
http://www.liceopas.com.ar/Areas/Exactas_y_natur/Laboratorio/Bactereologia/Tecnicas_microbiologicas.htm
http://www.liceopas.com.ar/Areas/Exactas_y_natur/Laboratorio/Bactereologia/Tecnicas_microbiologicas.htm
Dra. Rocío Aurora Sandoval Chávez 
 
Se determinan las características morfológicas o macroscópicas de crecimiento de las 
colonias de microorganismos en crecimiento en el medio de cultivo: 
1) Tamaño 
2) Forma 
3) Color 
4) Borde 
5) Aspecto 
 
 
Colonia (bacterias y levaduras) = conjunto de clones de células suficientemente 
numerosas para ser visibles a simple vista en un medio sólido 
 
 
 
5. Identificación microscópica, bioquímica, serológica, genética. 
IDENTIFICACIÓN MICROSCOPICA. 
La identificación microscópica de las bacterias se lleva a cabo por medio de métodos 
de tinción. La tinción de Gram, la más empleada en bacteriología, es una tinción diferencial. 
Por este método se pueden separar las bacterias en dos grupos: Gram positivas, se tiñen de 
color violeta, y Gram negativas, se tiñen de color rojo. El distinto comportamiento de las 
bacterias a está tinción se debe a diferencias en la composición química de la pared celular 
(Rodríguez, 2005). 
En la tinción de gran se utilizan cuatro soluciones: 
1) Colorante básico = cristal violeta (color morado). 
Los colorantes son generalmente sales, en las que uno de sus iones tiene color 
(grupo cromógeno), si el color está en el ion positivo es un colorante básico si está 
en el ión negativo es un colorante ácido. La célula bacteriana tiene una débil carga 
negativa en su superficie por lo que tiene afinidad o se tiñe por colorantes básicos. 
2) Mordiente = solución yodo yodurada o lugol. 
Sustancia que aumenta la afinidad o atracción entre célula y colorante. 
3) Agente decolorante = alcohol 
Agente quedecolora o retira el colorante primario o cristal violeta de la célula teñida. 
4) Colorante de contraste = safranina (color rosa). 
La función de esté colorante es dar a las células decoloradas un color diferente al 
de las células que no se han decolorado. Las células que no se decoloran conservan 
el color básico inicial (Gram positivas = morado) y las que se decoloran toman el 
color de contraste (Gram negativas = rosa). 
 
EL MICROSCOPIO ÓPTICO 
Dra. Rocío Aurora Sandoval Chávez 
 
El microscopio óptico simple es una herramienta básica utilizada de manera rutinaria 
en los laboratorios de enseñanza y/o investigación microbiológica. El microscopio de campo 
claro se compone de dos series de lentes (lentes del objetivo y lentes del ocular) que 
funcionan conjuntamente para producir la imagen. Con este tipo de microscopio las muestras 
se visualizan gracias a las diferencias de contraste entre ellas y el medio que las rodea. Las 
diferencias de contraste se producen porque las células absorben o dispersan la luz en 
diferentes grados. Para obtener la resolución más óptima cuando se ilumina por completo el 
campo visual, es indispensable ajustar el condensador, el diafragma de campo luminoso y el 
diafragma de apertura (Madigan, 2003). 
 
El microscopio óptico se conforma por un sistema óptico y uno mecánico, las partes 
fundamentales que los constituyen, son las siguientes (Figura 1): 
 
 
 
 
Figura 1. Partes del microscopio óptico. 
 
MATERIALES: REACTIVOS: 
• Mechero Bunsen * Solución de yodo 
• Cajas Petri * Agar soya tripticaseína 
• Tubos de ensayo * Diluyente de peptona 
• Asa metálica * Lugol 
• Pipetas de 1 ml y 10 ml estériles. * Safranina 
• Propipeta. * Alcohol-acetona 
• Microscopio óptico * Cristal violeta 
• Cubreobjetos * Agua destilada 
• Muestras 
• Piseta 
• Portaobjetos 
 
METODOLOGÍA PARA EL AISLAMIENTO DE BACTERIAS: 
1. Esterilizar el área de trabajo con una solución de yodoforo. 
2. Colocar el material, medios de cultivo dentro del área de esterilidad del mechero de 
Bunsen encendido. 
3. Se preparan cajas o placas de Petri con el medio de cultivo adecuado para el 
crecimiento bacterias, dependiendo del tipo de muestra problema conteniendo las 
bacterias (medios no selectivos, selectivos o diferencial). 
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4. Con un asa de cultivo o de siembra previamente esterilizada y enfriada, se toma 
una muestra (inoculo) del material problema que contiene una población mixta de 
bacterias. 
5. Se hacen estrías sobre la superficie del medio de cultivo sólido contenido en las 
cajas o placas de Petri de manera de diseminar el inoculo. 
6. Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa se va adelgazando la 
muestra y disminuyendo el número de células presente, lo cual favorece la 
obtención de colonias aisladas o individualizadas (cultivo puro). 
7. Se repite esta operación en tres planos sobre la superficie del medio de cultivo 
sólido. 
8. A continuación, se incuban las placas invertidas (para evitar que el agua de 
condensación del medio de cultivo se deposite sobre el cultivo) a una temperatura 
de 37°C por 48 h. 
9. Permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de 
divisiones para formar colonias visibles (clones de células). 
10. Los resultados se expresan de acuerdo a las características de cultivo: 
 Forma (puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa) 
 Color 
 Tamaño (~ > o < 1 mm de diámetro) 
 Borde (liso, ondulado, lobulado, irregular) 
 Aspecto (cremosas, elevadas, planas, rugosas, secas, brillantes) 
 
 
METODOLOGÍA PARA LA PREPARACIÓN Y FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS PARA LA 
TINCIÓN GRAM 
Antes de teñir las células bacterianas, se deben “fijar” o adherir a un portaobjetos 
sobre el cual se van a teñir. La fijación de las células al portaobjetos se lleva a cabo por medio 
del calor (flameando el portaobjetos con la preparación o película hacia arriba). Esto con el 
fin que durante los pasos de la tinción no se desprenda la preparación o película que contiene 
las células bacterianas. 
 
TINCION DE GRAM: 
1. Coloca una gota de agua en el centro del portaobjeto limpio con el asa de cultivo y 
añade una asada de cultivo, distribuye homogéneamente hasta formar una película 
uniforme. 
2. Dejar secar cerca del mechero y fijar al calor, pasando el portaobjetos sobre la llama 
del mechero por tres veces con la preparación o película de bacterias hacia arriba. 
3. Deja enfriar, cubrir la preparación con cristal violeta por 1 minuto. 
4. Enjuagar con agua con la ayuda de una piseta. 
5. Aplicar solución de lugol por 1 minuto. 
6. Enjuagar con agua con la ayuda de una piseta. 
7. Decolorar con alcohol-acetona 
8. Enjuagar con agua con la ayuda de una piseta. 
9. Contrastar con safranina por 30 segundos 
10. Enjuagar con agua con la ayuda de una piseta. 
11. Dejar secar. 
12. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión, colocando una gota de aceite 
de inmersión sobre la preparación. 
13. Identificar reacción al Gram y características morfológicas de las células: 
✓ Forma (cocacea o bacilar) 
✓ Tipo de agrupación. 
✓ Reacción de Gram 
 
Dra. Rocío Aurora Sandoval Chávez 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Bacilos Gram positivos Bacilos Gram negativos 
 (cultivo puro) (cultivo puro) 
 
✓ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cultivo mixto de Bacilos Gram positivos y negativos 
 
Actividades colaborativas en sesión: 
 
1. Revisar uno de los siguientes vídeos (el otro lo deberás revisar fuera de sesión): 
 Técnicas básicas de siembra (https://youtu.be/-TnHCd4sY24) 
O https://www.jove.com/science-education/10509/pure-cultures-streak-plating-isolation-
single-bacterial-colonies-from 
 
2. Entrar al Simulador y realizar el aislamiento correspondiente: 
http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/streakplate/streak_plate/streak_plate.html 
 
https://youtu.be/-TnHCd4sY24
https://www.jove.com/science-education/10509/pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from
https://www.jove.com/science-education/10509/pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from
https://www.jove.com/science-education/10509/pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from
http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/streakplate/streak_plate/streak_plate.html
http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/streakplate/streak_plate/streak_plate.html
http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/streakplate/streak_plate/streak_plate.html
http://microbitos.files.wordpress.com/2011/09/bacilo-gram-positivo.jpg
http://microbitos.files.wordpress.com/2011/09/bacilo-gram-negativo.jpg
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Registro de Resultados: 
A. ¿Cuál es el objetivo de la técnica de estriado en placa? 
B. Explica por medio de un dibujo o imagen la secuencia para realizar las estrías 
C. Menciona el resultado que se espera obtener al aplicar esta técnica 
 
 
Actividades individuales fuera de sesión 
1. Revisar la introducción y procedimientos de la práctica provista por el profesor. 
2. Realizar un diagrama paso a paso del procedimiento para aislar e identificar la 
morfología de algún tipo de microorganismo siguiendo los lineamientos mencionados 
el primer día de clase. 
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Cuestionario (Resolver de manera colaborativa) incluir en su reporte de 
práctica 
1. Define los siguientes tipos de poblaciones microbianas: Cultivo mixto, cultivo puro o 
axénico. 
2. Menciona las técnicas de aislamiento microbiano. 
3. Explica el objetivo de la técnica de estriación en superficie o siembra por estría en placa, 
en el aislamiento de microorganismos. 
4. Esquematiza los diferentes tipos de estriado de bacterias 
5. Indica las características a observar en el aislamiento de bacterias por la técnica de 
estriación en superficie. 
6. Explicaque es una colonia de bacterias. 
7. Explica cómo se forman las colonias de bacterias en un medio de cultivo. 
8. Describe los diferentes tipos de identificación de los microorganismos; microscópica, 
bioquímica, serológica y genéticamente. 
9. Indica el fundamento de la Tinción de Gram y esquematízalo. 
10. ¿Cuáles son las funciones de los reactivos utilizados en la tinción de Gram? 
 
 
 
Literatura Consultada: 
Chávez-Castillo, A., Arreguín-Espinosa, R., Cifuentes-Blanco, J. & Rodríguez-Bustamante, E. 
(2017) ¿Cómo funcionan los microbios? Ciencia, 68(2): 26-35. 
Herrera, T. & Ulloa, M. (2004) El Reino de los Hongos. Micología Básica y Aplicada. México: 
Universidad Nacional Autónoma de México / Fondo de Cultura Económica. 552 pp.