LECTURA DE PCR - Steffy Atencia

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Extracción de ARN viral mediante perlas magnéticas
Las perlas tienen un núcleo paramagnético, generalmente recubierto con sílice, para la unión del ácido nucleico. Las muestras se lisan en un buffer inhibidor de ARN y se incuban con perlas magnéticas para permitir que las partículas se unan a las moléculas de ARN, luego de esto se pueden recoger y colocar cerca de un campo magnético externo.
MATERIALES:
· Placa de 96 pozos
· Mangas para magnetos
· Reactivo Proteinsa K
PROCEDIMIENTO
1) Preparación de la muestra:
· Dentro de la campana de flujo laminar, abrir la placa de 96 pozos retirando la película de aluminio adherida.
· Identificar los pozos para colocar la muestra A1 – H1 y A7 – H7.
· Colocar 15 µL de Proteinsa K en los pozos.
· Colocar 20 µL de la muestra.
· Colocar las mangas protectoras tomándola con el dedo índice y el pulgar a través de las placas metálicas debajo de los magnetos. 
· Ubicar la placa y acomodarla hasta que la muesca quede en la esquina inferior izquierda.
· Tomar la placa e introducirla deslizándola por encima de unas pequeñas hendiduras color plateado localizadas en el suelo del equipo y presionar hacia abajo antes de cerrar la puerta del equipo.
· Programar en el equipo para que empiece a realizar la extracción.
LECTURA DE PCR
1. Una vez que el programa de amplificación se termine se deben verificar las curvas de amplificación, así como los valores Ct de las muestras, el control interno, control positivo y control negativo.
La máquina de qPCR mide los niveles de fluroescencia emitida y muestra un gráfico como el siguiente:
El gráfico muestra la intensidad de fluoresencia emitida por la muestra amplificada la cual es proporcional al número de copias frente al número de ciclos de PCR.
· Una muestra positiva dará una curva de fluoresencia por encima del límite de detección establecida.
Para el análisis se deben tomar en cuenta los siguientes parámetros:
a) CONTROL NEGATIVO: 
· No debe haber amplificación en ROX o el nivel de Ct es ≥ a 35.
· No debe haber amplificación en FAM ni en HEX o el nivel de Ct es ≥ 40.
b) CONTROL POSITIVO:
· Debe haber amplificación en FAM, HEX y ROX. 
· El Ct es < 35.
c) VALOR CUT- OFF:
· El FAM Ct debe ser < 40.
· El HEX Ct debe ser < 40.
· El ROX Ct debe ser < 35.
d) MUESTRA POSITIVA:
· Amplificación en ROX y amplificación en FAM y/o HEX.
e) MUESTRA NEGATIVA:
· Amplificación en ROX y NO hay amplificación ni en FAM ni en HEX.
f) MUESTRA INVÁLIDA:
· Si no hay amplificación en ROX se debe volver a procesar la muestra desde la extracción.
· Falsos Negativos
La prueba de PCR podría dar falsos negativos en las siguientes circunstancias: 
1. Mala praxis al momento de tomar la muestra incluyen el uso de hisopos inadecuados sin base de plástico con punta de rayón o dacrón.
2. Uso de algodón con poco material de muestra
3. Recolección tardía de la muestra o en etapas tempranas de la infección.
4. Pérdida de la cadena fría para el envío de la muestra
5. Mutaciones virales
6. Inhibición de la PCR
· CARGA VIRAL
La gráfica también arroja el nivel de carga viral que puede presenta el paciente.
· Mientras menos ciclos se necesiten al pasar el límite establecido de fluorescencia significa que se ha tenido más ADN de partida.
· A su vez significa que mientras mas ADN de partida se tenga mayor carga viral hay en el paciente.