1 AISLAMIENTO SIEMBRA Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS

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AISLAMIENTO, SIEMBRA Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS
AISLAMIENTO, SIEMBRA Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS
Gian Carlos Naranjo, Michael Andres Velásquez
 
 Programa: Quimica Facultad: Ciencias Básicas y Tecnologías. Universidad del Quindío 
gcnaranjor_1@uqvirtual.edu.co, mavelasquezl_2@uqvirtual.edu.co,
Enviado: 22/mayo/2019
Universidad del Quindío. Armenia Quindío, Colombia
Correo electrónico: cmmejia@uniquindio.co
RESUMEN
El objetivo de los diferentes procesos llevados a cabo en el presente informe es la comprensión del principio, su aplicación y su correcta reproducción. Después de realizar la correcta siembra de un microorganismo se realizó un conteo simple utilizando la visión como única herramienta, en el proceso de la observación bacteriana se utilizó un microscopio, sin embargo, el fin no era determinar la cantidad de estas sino su morfología; las pruebas realizadas para la determinación de coliformes en la muestra fueron positivas y se calculó un valor aproximado para su cantidad, por otro lado, el conteo de mesofilos aerobios fue imposible de realizar ya que cada muestra tenía más de 300 unidades. La pulcritud de los procesos fue parte esencial para la obtención de resultados convencionales, que permitan correcta reproducción y confirmación de las hipótesis; la contaminación del agua de grifo fue evidenciada, debido a que fue utilizada como solvente y altero los resultados presentando una cantidad mucho mayor de coliformes de lo esperada, determinando que los procesos llevados a cabo con agua destilada o hervida son más útiles para realizar el conteo. Los tiempos de incubación son de vital importancia para controlar la reproducción tanto del microorganismo deseado como de contaminantes que puedan darse.
Palabras claves: 
Mesofilos, coliformes, microorganismos aerobios, autoclave, medios de cultivo, inoculación, incubación, tinción.
INTRODUCCIÓN 
1.1. Que es un microscopio
Un microscopio es un dispositivo diseñado para observar elementos que escapan a la visión humana[footnoteRef:1]. Esta herramienta es extremadamente útil en el ámbito científico, el microscopio más reconocido y comúnmente utilizado es el microscopio óptico; este microscopio nos permite observar las diferentes características morfológicas de las células y los tejidos, se basa en el uso de lentes para aumentar os rayos de luz que atraviesa la muestra, el mayor avance en cuanto a perfección y calidad se ha producido en su principal elemento, las lentes, las cuales aumentan la imagen de las secciones de muestra y permiten hacer visible al ojo humano detalles nítidos que son imposibles de observar a simple vista. El aumento total que permite un microscopio óptico se calcula multiplicando la magnificación que produce el objetivo por la que produce el ocular. Por ejemplo, si estamos usando un objetivo de 40x (aumenta 40 veces) y un ocular de 10x (aumenta 10 veces), el resultado final será de 400x, es decir, vemos la muestra aumentada 400 veces. Usando microscopios ópticos avanzados se consiguen unos 1000-1500 aumentos (objetivo de 100x junto con oculares de 10x o 15x). Cuando se usan objetivos de 100 aumentos (100x) es necesario emplear un líquido denominado aceite de inmersión, que se añade entre el objetivo y la muestra. Esto es debido a que la refracción de la luz es alta en el aire y provoca alteraciones en la imagen que se manifiestan cuando se usan objetivos con esta capacidad de aumento. El aceite de inmersión reduce en gran medida esta refracción permitiendo imágenes mucho más nítidas.[footnoteRef:2] [1: https://definicion.mx/microscopio/] [2: https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/6-optico.php] 
Imagen 1. Partes de un microscopio óptico
1.1.1 Usos del microscopio 
Una de las aplicaciones de este instrumento es el conteo de microorganismos, este proceso es conocido como “recuento de cámara de Petroff-Hauser”, el cual consiste en tomar un volumen conocido de muestra, es decir de microorganismos y depositarlo en un portaobjetos excavado y cuadriculado que facilite el recuento por unidad de superficie y de volumen; una de las ventajas que tiene este proceso es la exactitud, debido a que la dimensión facilita el conteo por cuadrante, otra es que se realiza rápido y fácil, sin embargo no es posible diferenciar entre organismos vivos de organismos muertos. Otro proceso de conteo que se lleva a cabo con el uso del microscopio es el “método de Breed”, no obstante, para realizar ambos procedimientos se debe realizar un tratamiento a la muestra.
1.2 Preparación del medio de cultivo 
Un medio de cultivo es una técnica de laboratorio que consta de un gel o una solución que provee los nutrientes necesarios, condiciones favorables de pH y temperatura, que permiten el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Los medios de cultivo que se utilizan en el laboratorio dependen del microorganismo que se pretende cultivar y de la finalidad de su cultivo;
1.2.1 Clasificación de los medios de cultivo
Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos que se basan en:
a) Su consistencia
b) Su utilización
c) Su composición
a) Según su consistencia: 
· Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración. 
· Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante, generalmente se usa Agar. Este agente solidificante tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo. Se utiliza cuando se pretende hacer estudios microbiológicos en caja de Petri.
· Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias.
b) Según su utilización:
· Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo.
· Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos que aportan dichos factores.
· Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica.
Existen otros medios según su utilización:
· Medios inhibidores
· Medios diferenciales
· Medios de identificación
· Medios de multiplicación
· Medios de conservación
c) Según las sustancias que entren a formar parte en su composición los medios de cultivo pueden ser clasificados en:
· Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se preparan a partir de tejidos animales, y más raramente de vegetales
· Medios sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composición perfectamente definida. 
· Medios semisintéticos: El gran número de factores de crecimiento exigidos para ciertos gérmenes hace que la fabricación de un medio sintético para estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo.[endnoteRef:1] [1: I Clasificación de los medios de cultivo. Beatriz Santiago, Estudiante Universitaria. Publicado el 14 de feb. de 2015. Esta información se puede encontrar en:<https://es.slideshare.net/beatriznedsantiago/clasificacion-de-los-medios-de-cultivo>] 
1.2.2 Almacenamiento de medios de cultivo
Se debe evitar en la medida de los posible, los cambios bruscos de temperatura y una vez abierto el bote, es necesario mantenerlo cerrado para mantenerlo protegido de la hidratación. El polvo de los medios de cultivo deshidratados debe ser homogéneo, libre de flóculos y deben tener el color inicial indicado para cada medio. Si hay algún cambio de la apariencia física, se debe descartar el medio. La mayoría de los medios deben ser almacenados a temperatura ambiental entre 2-25ºC. Para ciertos medios de cultivo, el almacenamiento debe ser en nevera en un rango de temperatura de 2-8ºC.II
1.3 Aislamiento, selección y recuento
Después de hacer la correcta preparación de un medio de cultivo óptimo para el microorganismo a cultivar se realiza el aislamiento, selección y recuento del mismo.
1.3.1 Aislamiento
Consiste en separar los microorganismos de interés de una comunidad microbiana, el aislamiento es importante porque se obtienen cultivos para estudios detallados y controlados de laboratorio; algunos procesos usados para separar microorganismos son:
· Método de siembra por estría en placa o por agotamiento
· Métodos de vertido en placa
· Extensión en placa
· Aislamiento por dilución de masa
1.3.2 Recuento
Además de las técnicas de recuento anteriormente mencionadas en las que se utiliza el microscopio, también existen muchas otras, una de ellas es el recuento en placa, el cual es uno de los métodos más utilizados para determinar cuál es el número de microorganismos viables en un medio líquido. Cuando la concentración es baja se procede a filtrar la muestra a través de una membrana que será pasada al medio de cultivo, en una placa de Petri. Los microorganismos retenidos en la membrana se desarrollarán formando colonias, permitiendo su cuantificación. Cuando la concentración es alta, se procede a la preparación de diluciones seriadas en una secuencia de 1:10; Pequeñas alícuotas de esas diluciones son sembradas en medio nutritivo en placa, donde las bacterias se desarrollan formando colonias. En las placas donde la concentración de la alícuota sembrada es muy alta, las bacterias formarán crecimiento masivo, pero si la concentración es muy baja, el número de UFC podrá ser muy bajo. Entre los dos extremos de las diluciones, alguna de las placas contendrá un número de colonias entre 30 y 300, permitiendo la cuantificación.
El método de recuento en placa se divide dos variables muy utilizadas que son:
· El recuento en placa por siembra en profundidad: consiste en añadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50ºC sobre placa de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Se tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se incuban las placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Es un método generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos.
· El recuento en placa por siembra en superficie: consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilución de la muestra sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este método todas las colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta técnica para el recuento de bacterias aerobiasII.
Este método es el utilizado para el recuento de mesófilos aerobios.
1.4 ¿que son mesófilos aerobios?
Son todas aquellas bacterias aerobias, mesofilas capaces de crecer en agar nutritivo. Se investigan por el método de recuento con placa con siembra en profundidad (anteriormente explicada). Según Vanderzant y Splittstoesser (1992), se agrupan en dos géneros importantes: Bacillus y Sporolactobacillus formadores de endoesporas. Las especies encontradas en los alimentos son generalmente extensas y no poseen un habitad definido y en general no provocan enfermedades en el ser humano. Son utilizados como indicadores de la calidad del procesamiento. Los mesófilos aerobios son usados como indicadores de higiene en el agua.
1.4.1 ¿Que son coliformes totales?
Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubación comprendida entre 30-37ºC.
1.4.2 ¿Qué son coliformes fecales?
Los coliformes fecales son coliformes totales que además fermentan la lactosa con producción de ácido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45ºC en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente Escherichia coli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella.
Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran índices de contaminación fecal. Pero el verdadero índice de contaminación fecal es Escherichia coli tipo I ya que su origen fecal es seguro.[endnoteRef:2] [2: II Recuento de coliformes totales. Laboratorio de Tecnología Educativa. Departamento de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca. Esta información se puede encontrar en <http://coli.usal.es/Web/demo_fundacua/demo2/FiltraMembColiT_auto.html>] 
1.4.3 Mesófilos aerobios y coliformes como indicadores de higiene en el agua. 
La evaluación de contaminación de origen fecal del agua de consumo es importante, porque a través de ella se pueden determinar microorganismos cuya presencia indica que la muestra estuvo expuesta a condiciones que pudieran determinar la llegada a la misma de microorganismos peligrosos, permitiendo la proliferación de especies patógenas. Estos grupos de microorganismos se denominan indicadores de calidad sanitaria. Se usan como microorganismos indicadores de calidad sanitaria los siguientes grupos: coliformes totales, coliformes fecales y mesófilos aerobios, entre otros.
Desde el punto de vista microbiológico, el examen de la calidad sanitaria del agua tiene por objeto determinar la presencia de ciertos grupos de bacterias, que revelen una contaminación reciente por materia fecal o materia orgánica, siendo el criterio más utilizado la determinación de la clase y número de microorganismos que ésta contiene. Tradicionalmente se han usado ensayos de microorganismos indicadores más que para la determinación de microorganismos patógenos. El grupo de bacterias coliformes ha sido siempre el principal indicador de calidad de los distintos tipos de agua; el número de coliformes en una muestra, se usa como criterio de contaminación y, por lo tanto, de calidad sanitaria de la misma. Los coliformes son bastones Gram-negativos, aerobios o anaerobios facultativos, que fermentan la lactosa con formación de gas cuando se incuban durante 48 horas a 35°C. Incluye los géneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y especies lactosa positiva de otros géneros. Esto provee información importante sobre la fuente y el tipo de contaminación presente.
Estas bacterias se estudian, junto con el índice de coliformes, con el propósito de controlar un proceso de tratamiento de agua y para verificar su calidad. El método se basa en contar el número de colonias desarrolladas en una placa de medio de cultivo sólido, en el que se ha sembrado un volumen conocido de agua, transcurrido un tiempo y una temperatura de incubación determinados[endnoteRef:3] [3: III Silva, J, Ramírez, L, Alfieri, A, Rivas, G, & Sánchez, M. (2004). Determinación de microorganismos indicadores de calidad sanitaria. Coliformes totales, coliformes fecales y aerobios mesófilos en agua potable envasada y distribuida en San Diego, estado Carabobo, Venezuela. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología, 24(1-2), 46-49. Recuperado en03 de mayo de 2019. Esta informacion se puede encontrar en <http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1315-25562004000100008&lng=es&tlng=es.>
IV Rodríguez, Manuel. (2004). Guía práctica de frutas. Recuperado en 12 de mayo de 2019. Esta informacion se puede encontrar en <http://frutas.consumer.es/mango/propiedades>
V Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science. (2018). Plate count agar (PCA). Esta informacion se puede encontrar en < http://www.vetbact.org/index.php?displayextinfo=97>
VI Cayman chemical. Dibico. (2017).Esta informacion se puede encontrar en < https://www.probiotek.com/productos/reactivos/medios-de-cultivo-reactivos/agar-de-dextrosa-y-papa/>
VII Díaz, Maria A. Departamento Laboratorio, Dirección Provincial de Salud Ambiental. (2014). Analisis microbiológico de los alimentos. Recuperado el 12 de mayo del 2019. 
VIII García Ana (2011). BACTERIAS Y SALMONELAS EN LOS JUGOS DE NARANJA. Recuperado el 15 de mayo del 2019.
IX Annarella Rodríguez Isaac (2003). Determinación de coliformes totales y E. coli en aguas utilizando el Fluorocult LMX (MERCK) I: Comparación con los medios de cultivo tradicionales. Recuperado el 12 de mayo del 2019. ] 
MATERIALES
Los reactivos y materiales fueron dotados por los laboratorios de materiales y reactivos de la universidad del Quindío.
MÉTODOLOGIA
Para iniciar es necesario preparar los medios de cultivo, sitios que servirán de hogar de manera provisional para los microorganismos, los medios de cultivo que se prepararán serán: agar papa dextrosa (PDA), agar plate count (PCA), caldo bilis verde brillante (BRILA), agua peptonada para esto: se deben leer cuidadosamente las instrucciones de la etiqueta del frasco que contiene el medio de cultivo y así poder realizar los cálculos correspondientes para determinar la relación de gramos de acuerdo al volumen a preparar (en nuestro caso los cálculos se hicieron para preparar un volumen de 250 mL), una vez hecho los cálculos se pesa la cantidad exacta del medio deshidratado y se adiciona a un erlenmeyer previamente rotulado (fecha, nombre del medio y nombre de los integrantes del grupo) con una probeta se adiciona la cantidad de agua destilada necesaria para completar el volumen deseado y se agita vigorosamente. Se tapa los erlenmeyer con una torunda de algodón y se calienta hasta disolución completa, para terminar, se esteriliza estos medios y los materiales que se van a usar en el autoclave a 121°C, 15 libras de presión durante 20 minutos. Como paso a seguir se hará un aislamiento de microorganismos utilizando como muestra un jugo de naranja, el cual se compró a un vendedor ambulante a las afueras de la universidad del Quindío, antes de ello y de acuerdo al número de microorganismos esperado y sobre la base de la solución (Jugo de naranja) se prepararon diluciones decimales de 10-1, 10-2 y 10-3, usando pipetas estériles para cada dilución, tomando 1 mL de la muestra (Jugo de naranja) en 9 mL de agua peptonada evitando la formación de espuma, para la dilución 10-1. Para la preparacion de las demás diluciones se toma 1 mL de la solucion anterior en 9 mL de agua peptonada. Mezclar manualmente cada dilución 25 veces en 7 segundos con movimientos ascendentes y descendentes formando un ángulo de abertura de 60 ° entre brazo y antebrazo. A seguir se realiza la siembra, para esto se usaron 4 técnicas de sembrado, cada una en dos medios de cultivos distintos PCA y PDA, entre estas técnicas esta: Siembra de aislamiento en superficie, siembra por estría y siembra por vertido en placa. Antes de realizar cualquier tecnica el medio de cultivo debe ser adicionado a la placa Petri de objetivo. 
· Siembra de aislamiento en superficie: Con el asa de drigalsky se esparce la muestra por toda la caja Petri haciendo movimientos solo en dirección descendente. 
· Siembra por estría: Con el asa de inoculación se esparce la muestra por la caja de Petri, iniciando en uno de los extremos de la caja y haciendo movimientos en forma de zigzag, hasta la mitad de la caja luego se gira la caja 90° y se repite el anterior procedimiento. Esto debe realizarse hasta que se obtenga un ángulo de 360°
· Siembra por vertido en placa: Esta tecnica consiste en esparcir la muestra por la caja Petri, haciendo movimientos sobre una superficie rígida en forma de siete y L. 
Para finalizar el procedimiento de sembrado se deben incubar las placas a 37°C por 24-48 h.
Considerando que los resultados no son válidos se realiza el mismo procedimiento anterior con otra muestra (jugo de mango), elaborada por un integrante de este grupo, se prepararon a partir de la muestra y se sembraron por duplicado en medio de cultivo PCA usando la tecnica por vertido en placa, para completar este analisis se sembraron en el medio de cultivo BRILA, para confirmar o descartar la presencia de coliformes, para ello se adicionaron asépticamente a 3 tubos que contenían 10 mL del medio bilis verde brillante (BRILA), 1 mL de cada dilución 10-1, 10-2, 10-3 (Los tubos deben estar rotulados), para finalizar se Incuban a 35 °C por 24-48 ± 2 h.
El objetivo de esta práctica de laboratorio es poder detectar microorganismos patógenos o no patógenos en muestras liquidas (mesófilos aerobios y coliformes totales), estos microorganismos pueden ser observados en el microscopio óptico compuesto, sin embargo, por motivos de seguridad y al no saber a ciencia cierta lo que nos enfrentamos, la observación se hace a celulas epiteliales de la boca para ello se coloca una pequeña gota de agua destilada en el portaobjetos (con pipeta Pasteur) a seguir se Re-suspende la muestra (saliva de un integrante del grupo) en el portaobjetos. Fijar el frotis al calor (mechero). Luego se adiciona el colorante cristal violeta cubriendo toda la muestra, esperar 1min, pasado este tiempo se elimina el exceso de colorante y se lava rápidamente con agua, manteniendo el portaobjetos en posición inclinada luego cubrir el frotis con lugol durante 60 segundos y lavar nuevamente con agua, añadir la mezcla alcohol-acetona a la muestra (paso más crítico del procedimiento) esperar 15s a 30s, según corresponda y lavar con agua por ultimo agregar el colorante safranina cubriendo la muestra, durante 30 s y lavar con agua. Secar y observar al microscopio. Si es la primera vez que va a usar un microscopio óptico compuesto remítase al manual de microscopia, donde explicaran con detalle el buen manejo del microscopio.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 1. Microorganismos mesófilos aerobios en PDA, (jugo de naranja)
	TECNICA DE AISLAMIENTO
	ENSAYO
	RESULTADO
	Extensión en superficie
	Para realizar esta tecnica de aislamiento, se emplea el asa de digralsky, el asa se humedece totalmente en la muestra y en una placa de Petri con el medio de cultivo previamente sembrado (PDA), se esparce la muestra haciendo movimientos solo en dirección descendentes con el asa. (duplicado)
	
El número de microorganismos en todas las cajas Petri, esta entre 30 y 300, sin embargo, estos datos no son confiables ya que el tiempo de incubación fue mayor a 48 horas, lo que puede provocar que la muestra se contamine con microorganismos del entorno. 
	Estría múltiple
	Para realizar esta tecnica se emplea el asa de inoculación se esparce la muestra por la caja de Petri, iniciando en uno de los extremos de la caja y haciendo movimientos en forma de zigzag, hasta la mitad de la caja luego se gira la caja 90° y se repite el anterior procedimiento. Esto debe realizarse hasta que se obtenga un ángulo de 360°.
	
	Dilución en masa: 10-1
	Para la preparacion de esta placa Petri, sobre el medio de cultivo se tomó 1 mL de la dilución 10-1 y se sembró por la tecnica vertido en placa. 
	
Tabla 2. Microorganismos mesófilos aerobios en PCA, (jugo de naranja)
	TECNICA DE AISLAMIENTO
	RESULTADO
	Extensión en superficie
	
El número de microorganismos en todas las cajas Petri, esta entre 30 y 300, sin embargo, estos datos no son confiables ya que el tiempo de incubación fue mayor a 48 horas, lo que puede provocar que la muestra se contamine con microorganismosdel entorno.
	Estría múltiple
	
	Dilución en masa 
10-1 
10-2
	
La tabla 1 y 2 contiene el resultado de la siembre en el medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) y en el medio de cultivo agar plate count (PCA) respectivamente, realizada con las técnicas de aislamiento estudiadas en clase. El jugo se utilizado fue de naranja (tres) el cual es de la familia Rutáceas. El jugo se elaboró a las 6:40 am hora local, por un vendedor ambulante al frente de las instalaciones de la universidad del Quindio. Se decidió usar la naranja por su alto contenido energético y nutricional (ver tabla 3) que aporta al organismo los nutrientes necesarios para realizar las tareas del día a dia.IV
Tabla 3. Datos nutricionales de la naranja
Luego de tener la muestra (Jugo de naranja) preparada se procede a hacer el análisis para la evaluación de mesófilos aerobios, para ellos se empleó el medio de cultivo agar plate count (PCA), el cual es un medio de crecimiento microbiológico comúnmente utilizado para evaluar o monitorear el crecimiento bacteriano "total" o viable de una muestra. PCA no es un medio selectivo. La composición del agar de placa puede variar, pero típicamente contiene (w/v): peptona al 0.5%, extracto de levadura al 0.25%, glucosa al 0.1%, agar al 1.5% y un Ph ajustado a neutro 32°C por 48 horas.V
También se empleó el medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) ya que permite el crecimiento de hongos y levaduras) al tener una infusión de papa como fuente de almidones y dextrosa. El bajo pH (3.5) evita el crecimiento de las bacterias. La composición del agar de placa puede variar, pero típicamente contiene (w/v): 4 g de patatas, 20 g de dextrosa y 15 g de agar en polvo.VI
Una vez sembrado la muestra en el medio de cultivo deseado se lleva a incubación por 24 - 48 horas a 37°C, tiempo y temperatura ideal para el crecimiento de microorganismos mesófilos aerobios.VII Sin embargo este tiempo no fue cumplido y la prueba se considera negativa ya que los microorganismos obtenidos en las siembras no corresponden solo a la muestra (Jugo de naranja).
Según la doctora Ana García en su estudio titulado “BACTERIAS Y SALMONELAS EN LOS JUGOS DE NARANJA” el 43 % de los jugos de zumo de naranja servido en bares, restaurantes y comercializados en la calle en Colombia presentan un alto índice de contaminación. En concreto, el análisis destaca la presencia de enterobacterias, una familia que, en general, produce fermentaciones y oxidaciones de alimentos, lo que disminuiría la calidad nutricional del zumo. En los casos más graves, a esta familia pertenecen la Escherichia coli y la salmonela, que puede provocar trastornos digestivos graves. También se detectó que un 12% excedía los límites de microorganismos aerobios mesófilos (que son los que pueden vivir entre 25 y 40 grados), que incluyen hongos y levaduras. La situación es grave ya que en Colombia se consume 138 millones de litros al año.VIII
Tabla 4. Microorganismos mesófilos aerobios en PCA, 10-1,10-2,10-3 por duplicado (jugo de mango)
	DILUCIÓN
	ENSAYO
	RESULTADO
	10-1
	1. Para la preparacion de esta placa Petri, sobre el medio de cultivo se tomó 1 mL de la dilución 10-1 y se sembró por la tecnica vertido en placa.
	El número de microorganismos en todas las cajas Petri, fue mayor a 300, haciendo imposible el conteo de microorganismos totales, lo anterior indica que es necesario hacer más diluciones. La preparacion de las cajas de Petri fue tipo sándwich, agregando 10 ml del agar semisólido PCA, luego se le agrego 1 ml a cada placa de la dilución correspondiente por duplicado, (10-1,10-2,10-3), por último, se adiciono un poco del medio en cuestión y se procedió a hacer movimientos apoyado en una superficie plana de forma de siete y forma de 7. Finalmente se incubo a por 24 h.
	
	2. Igual al anterior.
	
	10-2
		
	1. Para la preparacion de esta placa Petri, sobre el medio de cultivo se tomó 1 mL de la dilución 10-2 y se sembró por la tecnica vertido en placa.
	
	
	2. Igual al anterior.
	
	10-3
	1. Para la preparacion de esta placa Petri, sobre el medio de cultivo se tomó 1 mL de la dilución 10-3 y se sembró por la tecnica vertido en placa.
	
	
	2. Igual al anterior.
	
La tabla anterior contiene el resultado de la siembre en el medio de cultivo agar plate count (PCA), realizada a cada dilución de la muestra (jugo de mango) por duplicado. Los resultados no fueron lo esperado se observa en la tabla que en todas las cajas Petri se cuenta un número mayor a 300 microorganismos. Esto puede deberse a varios factores como: la mala manipulación de la materia prima en el momento del transporte o en el momento de la elaboración del jugo que probablemente pudo contaminar a la muestra, también se puede deber a que el jugo fue elaborado con agua de la llave y mediante los resultados se puede concluir que el agua no es muy limpia ya que contiene un número elevado de mesófilos aerobios. Para poder realizar el conteo es necesario emplear más diluciones, para poder aislar los microorganismos. O en su defecto usar agua destilada que agua de la llave.
El jugo se realizó usando la fruta mango (uno) el cual es de la familia mangifera indica, y 100 mL de agua de llave de la ciudad de Armenia a las 6:00 am hora local. Se decidió usar el mango por su alto contenido energético y nutricional (ver tabla 5) que aporta al organismo los nutrientes necesarios para realizar las tareas del dia a dia.IV
Tabla 5. Datos nutricionales del mango
La calidad del agua potable de la ciudad de Armenia es discutible ya que es necesario la implementación de nuevas plantas de tratamiento de aguas residuales y mejor control sobre la contaminación de los afluentes hídricos. El 30 de enero del 2018 la abogada especialista en derecho ambiental Jhoana Suarez Montejo hizo un llamado de atención a empresas públicas de Armenia (EPA), entidad encargada de la distribución de agua potable en dicha ciudad, para que tuviera en cuenta la totalidad de agentes contaminantes que deterioran la salud humana al momento de dar resultados sobre la calidad de agua. Durante ese mismo año en el mes de junio se publicó el informe de riesgo de calidad de agua (IRCA), en donde el agua potable de la ciudad tuvo una calificación de 0.57, en dicho estudio se evaluaron aspectos fisicoquímicos como turbiedad, color, PH, alcalinidad, fosfatos, dureza, cloruros, hierro, cloro residual, sulfatos, conductividad, nitritos, aluminio y calcio; y 3 parámetros microbiológicos: coliformes totales, coliformes fecales y mesófilos", catalogando el agua como sin riesgo para el consumo humano, sin embargo el tema sobre la calidad de agua es un debate que tiene un tiempo de nunca a acabar y no es tema de tratar en este informe, solo se puede afirmar que para motivos de estudio y evitar estos penosos resultados, es necesario elaborar las muestras (Jugo de mango) con agua hervida o agua destilada. 
Luego de tener la muestra (Jugo de mango) preparada es hora de hacer el analisis para la evaluación de mesófilos aerobios, para ellos se empleó el medio de cultivo agar plate count (PCA), el cual es un medio de crecimiento microbiológico comúnmente utilizado para evaluar o monitorear el crecimiento bacteriano "total" o viable de una muestra. PCA no es un medio selectivo. La composición del agar de placa puede variar, pero típicamente contiene (w/v): peptona al 0.5%, extracto de levadura al 0.25%, glucosa al 0.1%, agar al 1.5% y un Ph ajustado a neutro 32°C por 48 horasV
Una vez sembrado la muestra en el medio de cultivo deseado se lleva a incubación por 24 horas a 37°C, tiempo y temperatura ideal para el crecimiento de microorganismos mesófilos aerobiosVII, sin embargo, por factores como la calidad del agua enunciada anteriormente no se obtuvo una cantidad deseada de mesófilos para realizar el conteo por lo anterior no es posible hacer un analisis objetivo. 
Tabla 6. Microorganismos coliformes totales en BRILA, de izquierda a derecha “Grupo 1=10-1 tubo1,2,3”; “Grupo 2=10-2 tubo1,2,3”; “Grupo 3=10-3 tubo1,2,3” temperatura = 43°C, tiempo = 24 h
	DILUCIÓN
	ENSAYORESULTADO
	DESCRIPCIÓN
	10-1
	1. Para la preparacion de estos tubos, se tomaron 1 mL de la dilución 10-1 en 10 mL del medio de cultivo BRILA.
	Positivo = 1
	Presencia de gas, espuma y turbamiento.
	
	2. Igual al anterior.
	Positivo = 1
	Presencia de gas, espuma y turbamiento.
	
	3. Igual al anterior.
	Positivo = 1
	Presencia de gas, espuma y turbamiento.
	10-2
	1. Para la preparacion de estos tubos, se tomaron 1 mL de la dilución 10-2 en 10 mL del medio de cultivo BRILA.
	Positivo = 1
	Presencia de espuma y turbamiento.
	
	2. Igual al anterior.
	Positivo = 1
	Presencia de espuma y turbamiento.
	
	3. Igual al anterior.
	Positivo = 1
	Presencia de espuma y turbamiento.
	10-3
	1. Para la preparacion de estos tubos, se tomaron 1 mL de la dilución 10-3 en 10 mL del medio de cultivo BRILA.
	Positivo = 1
	Presencia de espuma y turbamiento.
	
	2. Igual al anterior.
	Positivo = 1
	Presencia de espuma y turbamiento.
	
	3. Igual al anterior.
	Positivo = 1
	Presencia de espuma y turbamiento.
Tabla 7. Microorganismos coliformes totales en BRILA, de izquierda a derecha “Grupo 1=10-1 tubo1,2,3”; “Grupo 2=10-2 tubo1,2,3”; “Grupo 3=10-3 tubo1,2,3” temperatura = 43°C, tiempo = 48 h
	DILUCIÓN
	ENSAYO
	RESULTADO
	DESCRIPCIÓN
	10-1
	1
	Positivo = 1
	Presencia de gas.
	
	2
	Positivo = 1
	Presencia de gas y turbamiento.
	
	3
	Positivo = 1
	Turbamiento.
	10-2
	1
	Negativo = 0
	Presencia de burbujas.
	
	2
	Negativo = 0
	
	
	3
	Negativo = 0
	
	10-3
	1
	Negativo = 0
	
	
	2
	Negativo = 0
	
	
	3
	Negativo = 0
	
Paso a seguir se trató de observar la presencia de coliformes totales presentes en el jugo de mango, para esta tarea se empleó 10 mL del medio de cultivo caldo verde brillante (BRILA) y se adiciono asépticamente a 3 tubos que contengan 10 mL del medio bilis verde brillante, 1 mL de cada dilución 10-1, 10-2, 10-3. Posteriormente se Incubaron a 35 °C de 24-48 ± 2 h. Se utilizó el medio de cultivo BRILA ya que es un medio selectivo que permite el crecimiento de microorganismos que fermentan la lactosa (coliformes) IX. En la tabla 6 y en la tabla 7 estan consignados los resultados de estos ensayos, en ambas tablas se emplearon la misma temperatura de incubación (43°C) la diferencia radica es que en la primera tabla fue a un tiempo de incubación de 24 horas y en la segunda tabla fue de 48 horas.
Para realizar el conteo de coliformes totales se empleará la tabla x. 
Tabla 8. Número más probable (NMP) para 1g 0 1 mL de muestra cuando se usan 3 tubos con porciones de 0.1; 0.01 y 0.001g o mL.
Observando la tabla 6 y la tabla 7 se obtiene los siguientes resultados, Para el tiempo de incubación 24 h, los resultados fueron: 3 tubos positivos para la dilución 10-1, 3 tubos positivos para la dilución 10-2, y 3 tubos positivos para la dilución 10-3, teniendo en cuenta estos resultados y observando la tabla, el número más probable de coliformes totales esperado en el jugo de mango por cada 1 mL de muestra es mayor a 1110. 
Para el tiempo de incubación 48 h, los resultados fueron: 3 tubos positivos para la dilución 10-1, 0 tubos positivos para la dilución 10-2, y 0 tubos positivos para la dilución 10-3, teniendo en cuenta estos resultados y observando la tabla 8, el número más probable de coliformes totales esperado en el jugo de mango por cada 1 mL de muestra es 23. La disminución de microorganismos coliformes en el paso del tiempo, es debido a su curva general de crecimiento lo cual hace más vulnerable al microorganismoIX, este resultado tan a bruto es debido a que el jugo de mango se preparó con agua de la llave. 
El objetivo de esta práctica de laboratorio es poder detectar microorganismos patógenos o no patógenos en muestras liquidas (mesófilos aerobios y coliformes totales), estos microorganismos pueden ser observados en el microscopio óptico compuesto, sin embargo, por motivos de seguridad y al no saber a ciencia cierta lo que nos enfrentamos, la observación se hace a celular epiteliales de la boca. 
	Objetivo
	Resultado
	4x
	
	10x
	
	40x
	
El microscopio óptico consiste en 4 objetivos de observación los cuales les da ese poder de aumento, lo cuales son 4x, 10x, 40x y 100x, este último es especial ya que para poder usarse debe adicionarse aceite de inmersión a la muestra, por la razón anterior solo se usaron los objetivos 4x, 10x y 40x, para poder observarlas se deben colorear ya que las celulas son transparentes, para ello se empleó la tinción de Gram, que pone de manifiesto las bacterias Gram positivas (violeta) y las bacterias Gram negativas (rosado). 
CONCLUSIONES
· Al realizar el análisis de mesofilos aerobios y coliformes usando como muestra jugo de mango los resultados no fueron los esperados, esto se debe a la obtención de más de 300 microorganismos evidenciados en el momento de realizar el conteo, este resultado se da debido a la preparación de la muestra, en la cual se diluyó el mango en agua de grifo de una localidad de Armenia; en todas las muestras la prueba fue positiva para coliformes, lo que evidencia la contaminación de dicha agua; Para obtener mejores resultados es necesario realizar mayor cantidad de diluciones o preparar la muestra con agua hervida o agua destilada.
· Los resultados del análisis de mesofilos aerobios usando como muestra jugo de naranja no se pueden tener en cuenta, esto es consecuencia de una incubación excesiva de la muestra más de 96 horas, cuando el cultivo necesitaba de 24 a 48 horas de incubación; por lo anterior, con veracidad no se puede hacer el recuento, debido a que se presentan otros microorganismos no deseados.
· Los errores que se pueden presentar debido a la contaminación se redujeron al máximo trabajando en lugares desinfectados y creando un área de trabajo con mayor temperatura, se sometió a autoclave todos los materiales de vidrio a utilizar después de haber hecho una limpieza minuciosa con su respectiva forma de almacenamiento; lo anterior contribuyó en gran medida a la obtención de resultados precisos y convencionales.
BIBLIOGRAFÍAS