5 EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO DE ALCALOIDES PRESENTE EN EL ALGARROBO (CERATONIA SILIQUA)

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LABORATORIO Nº 5. EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO DE ALCALOIDES PRESENTE EN EL ALGARROBO (CERATONIA SILIQUA)
	
Gian Carlos Naranjo Rojas, e-mail: lvidarragao@uqvirtual.edu.co
Fitoquimica II (2019)
RESUMEN: El objetivo principal de la práctica fue la extracción de alcaloides y reconocimiento de la presencia de ellos mediante pruebas químicas, para ello se realizaron unas secuencias de pasos donde se utilizaron plantas que en su contenido hubiera presencia de alcaloides, la planta estudiada para este fin es el algarrobo, en donde encontramos principalmente el alcaloide denominado juliflorina y otros no relevantes por su poca cantidad en el material vegetal. Se realizaron una serie de procesos con el fin de obtener este metabolito en un alto grado de concentración y así determinar la presencia de este alcaloide. Para esto se emplearon procesos de selección, secado y molienda de material vegetal, desengrasado, extracción de alcaloides, aislamiento y pruebas para alcaloides. Obteniendo así resultados positivos de la presencia de alcaloides en esta Planta.
PALABRAS CLAVE: Alcaloides, desengrase y aislamiento.
EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO DE ALCALOIDES PRESENTE EN EL ALGARROBO (CERATONIA SILIQUA)
1. INTRODUCCIÓN
El algarrobo (Ceratonia siliqua) es una especie arbórea de la familia de las fabáceas originaria de la Cuenca del Mediterráneo. 
El algarrobo es un árbol de hasta 10 metros de altura, aunque su altura media es de 5 a 6 metros; es dioico y es de follaje perenne. Tiene hojas Paripinnadas de color verde oscuro con una dimensión de entre 10 y 20 cm de largo y sus flores son pequeñas, rojas y sin pétalos. El fruto, llamado algarroba o garrofa, es una vaina coriácea de color castaño oscuro, de 1 a 3 dm de longitud, que contiene una pulpa gomosa de sabor dulce y agradable que rodea las semillas. Las vainas son comestibles y se usan como forraje. El algarrobo es una especie de gran rusticidad y resistencia a la sequía, pero es de un desarrollo lento y solo comienza a fructificar después de unos siete a diez años desde la plantación, obteniendo su plena productividad a los quince o veinte años. Suele tener una buena producción cada dos años, oscilando entre 90 y 200 kg de fruto en árboles maduros, haciéndose la recolección a partir del mes de agosto, mediante vareo o directamente del suelo.
Las semillas están recubiertas por un tegumento duro que impide la imbibición de agua, este motivo hace que su germinación sea muy lenta. Cuando el tegumento externo se rompe, la semilla absorbe agua con bastante rapidez, facilitándose así la germinación. El tegumento externo favorece la longevidad de las semillas, se tiene constancia que con cuatro años de edad aún mantienen una viabilidad germinativa semejante a las semillas obtenidas el mismo año. Por consiguiente, los restos de frutos en la tierra de años anteriores representa una estrategia de reproducción propia de este árbol. Los procesos digestivos no afectan a la viabilidad germinativa de las semillas, lo cual favorece la dispersión a larga distancia por medio de los consumidores del fruto. Se ha constatado también cierto grado de resistencia de las semillas de algarrobo al fuego, conservando su poder germinativo. 
El algarrobo es originario de la región mediterránea, pero se cultiva también en otras zonas cálidas. Es un árbol que no necesita mucha agua para crecer ni para vivir normalmente. 
Tradicionalmente, la pasta, la goma y el humo de las hojas y las vainas se aplican para fines 
anticancerígenos, antidiabéticos, antiinflamatorios y antimicrobianos. Los componentes de Prosopis, como los flavonoides, los taninos, los alcaloides, las quinonas o los compuestos fenólicos demuestran potenciales en diversas funciones biológicas, como analgésico, antihelmíntico, antiemético, antioxidante microbiano, antipalústico, antiprotozoario, antipústico y antiulceroso; 
mejora de Hþ, Kþ, ATPasas; desinfección oral; y efectos probióticos y nutricionales; así como en otras aplicaciones biofarmacéuticas, como las capacidades de unión para la producción de tabletas. 
El compuesto juliflorina proporciona una cura en la enfermedad de Alzheimer mediante la inhibición de la acetilcolina esterasa en las sinapsis cerebrales colinérgicas.
Figura 1. Juliflorina.
No existe un método único para extraer y aislar alcaloides, pues este depende tanto de una naturaleza del material a procesar como de las estructuras químicas y, por ende, las propiedades físicas, de los alcaloides presentes o que se de desean separara del material vegetal. Sin embargo, gracias a su basicidad pueden proponerse un proceso general de separación él se puede emplear a conveniencia al realizarlo todo o solo una parte.
Desengrase: Es un proceso que consiste en lavado del material vegetal con éter de petróleo normalmente para este proceso se emplea una extracción Soxhlet mediante la cual se extraen los compuestos grasos antes de pasar a la extracción. 
Lixiviación: Es el proceso de remoción o extracción de un compuesto soluble (soluto contenido en medio solido) mediante un solvente apropiado. Este es un proceso de trasferencia de masa por lo que es indispensable que exista contacto íntimo entre el solvente y soluto.
Aislamiento: Proceso mediante el cual se separan metabolitos de interés de una matriz, este proceso se lleva a cabo conociendo las características de las moléculas objetivos.
Pruebas para alcaloides: Son sustancia que al reaccionar con un alcaloide producen un cambio o una señal, la cual es evidencia precia de este tipo de molécula.
· Dragendorff: Se prepara mezclando8 g de nitrato de bismuto pentahidratado en 20 mL de ácido nítrico al 30 % con una solución de 27.2 g de yoduro de potasio en 50 mL de agua. Se deja reposar por 24 h, se decanta y se afora a 100 mL. La presencia de alcaloides se detecta al producirse una coloración naranja rojiza cuando un papel impregnado con el reactivo se pone en contacto con una solución acida de alcaloides. Cuando se usa como reactivo de precipitación las bases precipitan como solidos marrones. 
· Bouchardat: solución de yodo y yoduro de potasio que indica prueba positiva cuando se forma un precipitado de color marrón.
· Mayer: 1.3 g de bicloruro de mercurio en 60 mL de agua y 5 g de yoduro de potasio se afora a 100 mL. Los alcaloides se detectan como un precipitado blanco que es soluble en ácido acético y etanol.
· Scott: Es una prueba química probada para mostrar la presencia de alcaloides. El reactivo tiocianato de cobalto puede ser preparado disolviendo 10 g de tiocianato de cobalto(II) en una mezcla de 490 mL de agua destilada y 500 mL de glicerol. Es específica para detectar cocaína. 
2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Parte 1. Selección, secado y molienda de material vegetal 
Se tomaron hojas (aproximadamente 500g de material húmedo) de un árbol de albarrobo, la recolección se realizó en horas de la mañana. Las hojas se dejaron secan horno a 37°C durante dos semanas, luego se molieron. Así al final de este proceso se obtuvieron 50.465 g de material vegetal en polvo. 
Parte 2. Desengrase de material vegetal empleando una extracción soxhlet 
Se tomaron 50.465 g de material en polvo, los cuales se introdujeron en una columna soxhlet y posteriormente se agregaron 700 mL de hexano, la solución formada se llevó a reflujo durante 9 horas en un rango de temperatura entre 60-80 C. finamente se obtuvo una solución de color oscura y el marco vegetal húmedo, este último se dejó secar al aire libre. 
Resultado parcial
Se obtuvo una solución oscura rica en lípidos y carotenoides además de un marco vegetal libre de grasas un poco húmedo el cual se dejó secar para tomarlo como matriz y en esta analizar la presencia de alcaloides. 
Parte 3. Extracción por medio de lixiviación 
Se tomó el marco vegetal seco, se introdujo en un embudo de decantación, se tomaron 500 mL de etanol los cuales se hicieron pasar a través de la muestra y seguidamente llenar la bolsa de suero. Después de llenada la bolsa de suero se puso a gotear lentamente el líquidoy atravesar la muestra, este procedimiento se repitió durante una semana y constantemente.
Parte 4. Aislamiento de alcaloides 
El extracto etanólico fue tratado con HCl 0.5 N hasta pH ácido agitado durante 2 horas y luego centrifugado con el fin de observar la formación de gomas, en este proceso se remueven las bases como sales solubles. 8 días después la solución ácida fue gasificada con 15% NaOH a pH 10, luego se realizaron 2 extracciones liquido-liquido empleando 30 mL cloroformo en cada una de ellas, posteriormente fueron unidas y llevadas a rota vapor para concentrar la solución.
Parte 5. Pruebas para alcaloides 
Se tomaron gotas del extracto clorofórmico y se transfirieron en una caja escavada de 12 huecos, en los cuatro primeros huecos se agregaron gotas de los reactivos en cuestión (Dragendorff, Bouchardat, Meyer, Scott), esto con el fin de notar su cambio de color, en los siguientes cuatro huecos se agregaron gotas del extracto clorofórmico, y en los últimos cuatro huecos se agregaron gotas del extracto clorofórmico con los reactivos en cuestión. Esta prueba se realizó por duplicado. 
Para comprobar los resultados y permitir la visualización de formación de precipitado, se tomó 1 mL de extracto y se transfirió a cada tubo de ensayo, luego se agregaron algunas gotas de cada reactivo y se observó los cambios de coloración y formación de precipitados 
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Imagen 2. Pruebas para alcaloides, los cuatro huecos de la primera fila es el reactivo puro (Dragendorff, Bouchardat, Meyer, y Scott), los cuatro huecos de la tercera fila es el extracto clorofórmico mas los reactivos en cuestión.
	Prueba
	Abundancia
	Evidencia
	Color
	Dragendorff
	++
	Precipitado
	Naranja
	Bouchardat
	++
	Precipitado
	Café naranja 
	Mayer
	--
	
	Sin cambio de color
	Scoot
	--
	 
	Sin cambio de color 
Tabla 1. Pruebas para alcaloides, resumen de la imagen 2.
Las técnicas de reconocimiento de alcaloides se basan en la capacidad que tengan estos para combinarse con yodo y metales pesados como el bismuto, mercurio, tungsteno, entre otros. De esta manera la formación de precipitados y/o cambios de color indican la presencia o ausencia del alcaloide en la muestra. (Arango, G., 2008) Según lo anterior y teniendo en cuenta el resultado de estas pruebas (Tabla 1.) podemos afirmar que hay presencia de alcaloides más no qué tipos de alcaloides, pues estos reactivos sólo evidencian la presencia o ausencia de estos.  Aunque estas pruebas no permitan la identificación de un alcaloide especifico, soportándonos en la literatura podemos inferir a qué tipo de alcaloide hace referencia la prueba.
Los alcaloides son sustancias básicas que contienen nitrógeno en un anillo heterocíclico,
son derivados de aminoácidos y se encuentran en las plantas superiores
de un ácido orgánico. En el análisis fitoquímico preliminar las técnicas de reconocimiento
son basadas en la capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal (extractos ácidos), de combinarse con el yodo y métales pesados formando
precipitados con reactivos como el mercuriyoduro de potasio (de mayer) y yoduro de bismuto (Dragendorff), estas reacciones se basan en los siguientes
comportamientos: El yoduro de potásico cuando reacciona con cloruro mercúrico, forma un precipitado rojo de yoduro mercúrico: [HgCl2 + 2 I- 2 Cl- + HgI2] soluble en exceso de iones de yoduro con formación de un anión complejo incoloro: [HgI2 + I- HgI2–4] La solución alcalina de este complejo sirve para descubrir indicios de amoníaco. En esta reacción se forma el compuesto de color pardo oxiyoduro mercuri amoníaco, que es soluble en exceso de complejo [HgI24 ],generando intenso color amarillo. Los alcaloides por su carácter nitrogenado pueden comportarse de forma
similar al amoníaco, ante estos reactivos (Reactivo de mayer); muchos alcaloides presentes en un material vegetal forman con el bismuto, yoduros dobles insolubles
de fórmula general Bil3B · HI (Reactivo de Dragendorff)
Según la comisión nacional contra la biopiratería analizaron mediante unas pruebas fitoquímicas al algarrobo y encontraron que en este se encuentran compuestos como los alcaloides juliflorina, juliprosopina, prosoflorina, juliprosina, que dan positivos para la prueba de Dragendorff y Bouchardat, aca existe una discrepancia ya que el reactivo de mayer debe ser positivo, este resultado negativo puede ser a la concentracion del compuesto. 
En un trabajo adverso publicado por el doctor Jorge Milán Domínguez (2016) llamado caracterización Fitoquimica de Ceratonia siliquia (algarrobo), obtiene unos resultados positivos cuando trata el extracto del algarrobo al reactivo de Dragendorff.
En un trabajo publicado por Jenifer Ibeth Bailey llamado (“manual técnico científico a utilizar para la detección de cocaína y marihuana mediante pruebas químicas de campo”), evidencia que el reactivo de Scott es único para detectar el alcaloide cocaína. Según la informacion anterior el reactivo de Scoot da prueba negativa ya que en la algarroba no hay presencia de cocaína. 
4. CONCLUSIONES
· Si bien la Extracción Soxhlet es un proceso simple; ya que consta de solo tres partes;(tubo refrigerante, tubo extractor y el balón de destilación) y que además su proceso es bastante lento, los resultados que se pueden obtener de este son muy eficientes y beneficiosos.
· Se logró identificar la presencia de alcaloides por medio de los diferentes reactivos de precipitación, en el extracto clorofórmico con un alto grado de abundancia.
5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
· Universidad de Antioquia, Gabriel Jaime Arango Acosta, alcaloides y compuestos nitrogenados, Medellín junio 2008.
· Deanna et al. Fitoquimica Orgánica. universidad central de Venezuela. 2002. 
· Arango, Caro S. (2004b). Guía de Plantas Medicinales de uso Común en Salento. Colombia Copyright © 2004 Missouri Botánica Garden Press P. O. Box 299 St. Louis, Missouri 63166-0299, U.S.A. Todos los derechos reservados. Impreso en E.U.A
· Carrizosa, S. (1991). Contribución al conocimiento de la estructura de un bosque nublado altoandino en la Cordillera Oriental, Cundinamarca, Colombia. Revista Trianea 4: 409-436.
· Cueva, N. (2002). Estrategias para la conservación, manejo y repoblamiento de bosques de Podocarpaceae en la zona alto
· Laboratorio de alcaloides. Profesor Fernando Agudelo Aguirre, Fitoquimica II