BTLB_U4_EA - JESSICA VERONICA MENDOZA PRADO (7)

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Universidad Abierta y a Distancia de México
División de Ciencias de la Salud, Biológicas y Ambientales
Ingeniería en Biotecnología
Técnicas de laboratorio de biología
Unidad 4
Evidencia de Aprendizaje
Colorantes y reactivos 
Obtención y tinción de microorganismo
7 de septiembre de 2020
Prácticas virtuales
Tincion de Gram
Fue publicado por el bacteriólogo Hans Christian Gram en 1884. Es una tinción diferencial compuesta que permite dividir a casi todas las bacterias en dos grupos: Gram positivo y Gram negativo, basado en las características de la pared celular. Las únicas bacterias que no pueden ser clasificadas con este método son las bacterias que carecen de pared celular como las de los géneros Micoplasma, Ureaplasma y las intracelulares obligadas. 
Fundamento 
Se basa en la diferencia que hay entre la pared de las células Gram positiva y Gram negativas. En la pared celular se encuentra un peptidoglicano que es mureína forma una malla porosa alrededor de la pared celular, proporcionando rigidez y forma a las bacterias. 
Aplicación 
· Diagnóstico rápido preliminar en contexto clínico medico 
· Mejor dirección de la antibioterapia 
· Establecimiento de grupos bacterianos en Gram + y Gram –
· Clasificación de bacterias de acuerdo con su forma y agrupación 
· Identificación de bacterias con ayuda de pruebas bioquímicas 
Procedimeinto 
Materiales 
· 
· Cristal violeta, tiene afinidad por el peptidoglucano y tiñe de morado a todas las bacterias presentes 
· Alcohol acetona, desestabiliza la membrana externa celular y permite la liberación del cristal violeta. 
· Lugol (Yodo de Gram), actúa como mordiente, induciendo la formación de complejos insolubles de cristal de violeta-yodo-proteínas ribonucleares 
· Safranina actúa como colorante de contraste
· Asa bacteriológica 
· Portaobjetos 
· Microscopio óptico 
· Aceite de inmersión 
· Muestra 
· Cerillo o encendedor 
· Marcador 
· Mechero
Método 
1. Con el asa bacteriológica colocar la muestra sobre la laminilla. De ser necesario añadir una gota de agua destilada para distribuir uniformemente la muestra en la laminilla. Esta no debe ser demasiada, pues podría impedir la observación bacteriana. 
2. Dejar secar al medio ambiente, después fijar exponiendo la laminilla brevemente al calor del mechero durante 3 segundos aproximadamente. Rotular con el marcador. 
3. Cubrir el portaobjetos con cristal violeta por 1 minuto. Lavar después con agua, inclinando el portaobjetos, de forma delicada. No secar. 
4. Aplicar Lugol y dejar por 1 minuto. Lavar de igual forma, no secar. 
5. Aplicar alcohol acetona de 15 a 30 segundos, gota a gota, con el portaobjetos inclinado. Cuando este deje de arrastrar color, lavar con agua nuevamente. No secar. 
6. Cubrir el portaobjetos con safranina de 30 segundos a 1 minuto. Lavar con agua y dejar secar. 
7. Colocar la laminilla en el microscopio, usar el objetivo de 100x con aceite de inmersión. 
8. Al finalizar, limpiar el objetivo con papel seda o una torunda con alcohol al 50%
Tincion de Ziehl Neelsen 
La tuberculosis es una enfermedad endémica en México, con más de 20 mil casos al año. El género Mycobacterium se compone por más de 125 especies de micobacterias, que son bacilos rectos o ligeramente curvos que van de 1 a 10 micrómetros. La tinción de Ziel Neelsen es un medio económico y accesible para realizar el diagnóstico de la enfermedad en muestras clínicas. 
Fundamento 
Es una tinción utilizada para permitir la observación de bacterias que no pueden ser teñidas por la tinción de Gram. Estas bacterias se denominan acido alcohol resistente, ya que sus paredes son ricas en lípidos y ácidos grasos como el ácido micólico, que por su alto peso molecular (alrededor de 90 átomos de carbono), impiden que las bacterias sean decoloradas con el alcohol acido por lo tanto impidiendo que colorantes como el cristal violeta y la safranina tiñan a estas bacterias. Otros ácidos grasos relevantes en la pared celular son las ceras, los fosfolípidos, los ácidos mico séricos y el ácido phtienoico. 
Este impedimento es sorteado al colocar carbol fuscina y calentar la muestra ligeramente para solubilizar las ceras, lípidos y ácidos grasos de la pared para permitir el paso del colorante, que es muy afín a los ácidos micólicos. Así, al enfriarse la muestra, estos componentes se solidifican y el colorante no es lavado por el alcohol acido. 
Aplicación 
· Se utiliza sobre todo con fines clínicos, ya que es un procedimiento sencillo que permite identificar la presencia de bacilos del género Mycobacterium, causantes de la tuberculosis en el ser humano. 
Procedimiento
Preparación previa de la muestra 
Debe obtenerse una muestra bacilar, ya sea de biopsia cuando se sospecha de formas extrapulmonares de la enfermedad o de esputo si se sospecha de la forma clásica. 
La muestra de esputo se procesa en un frotis de 2 cm de largo por 1 a 2 cm de ancho, seleccionando material mucopurulento o mucosanguinolento para aumentar la probabilidad de encontrar al bacilo. 
Materiales 
· Muestra fijada en laminilla
· Carbol Fuscina al 0.3%, es un colorante básico fenólico. 
· Acido alcohol al 3%, se usa para decolorar las estructuras que no son AAR. 
· Azul de metileno al 0.3%, se usa como colorante secundario para contrastar la muestra y es absorbido solo por las células decoloradas. 
· Mechero de alcohol 
· Aceite de inmersión 
· Varillas para las tinciones 
· Contenedor de RPBI
Método 
1. Se coloca la laminilla sobre dos varillas en el área destinada a realizar las tinciones
2. Se cubre con fucsina por 5 a 10 minutos, mientras que con el mechero de alcohol se aplica calor por debajo de la laminilla hasta que la fucsina emita vapor. Es importante evitar que esta hierva y se puede añadir más en caso de que esta se evapore. 
3. Se lava el frotis con agua corriente
4. Se decolora con alcohol acido por 1 minuto Ilustración 1 Tinción de Ziehl Neelsen. Se observan bacilos formando cuerdas. Ollero, J. (2018) LaboATLAS.
5. Se lava el frotis con agua 
6. Se cubre la muestra con azul de metileno por 1 minuto 
7. Se lava y se deja secar 
8. Se observa al microscopio con el objetivo de 100x y usando aceite de inmersión 
Resultado 
Los organismos acido alcohol resistente se apreciarán de un color rojo intenso mientras que el resto de los organismos se teñirán en color azul. 
Referencias
1. Briceño, K. (2021) tinción de Ziehl-Neelsen. Lifeder. Recuperado de https://www.lifeder.com/tincion-ziehl-neelsen/
2. Departamento de Microbiología y Patología (2019) Microbiología I Manual de Prácticas. Universidad de Guadalajara. Segunda Edición
3. Gil, M. (2018) tinción de Gram: Fundamento, materiales, técnica y usos. Recuperado de https://www.lifeder.com/tincion-de-gram/
4. Graterol R, Oswaldo A, Barreto E, Michel E, Ramos, Nidian A, Fernández F, Sandra, Da Mata J, Omaira J, & Angulo, José A. (2016). Diseño del Kit de Tinción Ziehl Neelsen del Instituto Nacional de Higiene �Rafael Rangel�. Revista del Instituto Nacional de Higiene Rafael Rangel, 47(1-2), 18-26. Recuperado en 08 de septiembre de 2021, de http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0798-04772016000100003&lng=es&tlng=es.
5. Lopez-Jacome, L. (2014) Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Revista investigación en Discapacidad. Vol3 Num 1. Recuperado de https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
Las bacterias Gram positivas la estructura de peptidoglicano es gruesa con gran cantidad de acido teicoico asociado por enlaces covalentes, que forman una gruesa malla. Esta es la responsable que después de la decoloración con alcohol acetona, el colorante de cristal violeta y el Lugol queden atrapados al interior de la misma después del cierre de los espacios en la malla posterior a la deshidratación. 
Las bacterias Gram negativas el peptoglicano no representa mas del 10% de la pared, además de estar rodeado de una membrana externa, que es sensible a los solventes por ser de estructura lipídica y contener moléculas de lipopolisacárido. Por ello, cuando se realiza la tinción deGram, el epigmento de cristal violeta no es retenido mientras que la safranina si tiñe la muestra.