1-Metodos

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Métodos histológicos
Microscopía
Técnicas histológicas
Campus: AeH2020
primero Ana María Puyó
•Observación directa de células y tejidos vivos.
•Análisis de células y tejidos muertos.
•Estudio de los componentes de células.
•COMPRENDER LA MICROANATOMÍA DE CÉLULAS, 
TEJIDOS Y ÓRGANOS
•CORRELACIONAR ESTRUCTURA CON FUNCIÓN
OBJETIVO DE LA UTILIZACIÓN DE TÉCNICAS 
HISTOLÓGICAS
MICROSCOPIO ÓPTICO (MO) DE CAMPO CLARO
1 m = 103 mm = 106 m = 109 nm = 1010 A = 1012 pm
1 mm = 1000 m
m = micrometro o micrón
nm = nanometro
A = Angstrom
pm = picometro
UNIDADES
Límite de resolución (d) = distancia mínima que debe existir
entre 2 puntos del objeto para que se visualicen separados.
d = 0.61 x l
AN
l = longitud de onda de la luz utilizada
Luz visible  l = 500 nm
Luz UV  λ = 200 nm
Ojo humano: 0.2 mm
Microscopio óptico de campo claro: 0.2 m
Microscopio de luz ultravioleta: 0.1 μm
Microscopio electrónico de barrido (MEB): 2.5 nm
Microscopio electrónico de transmisión (MET): 1 nm
Microscopio de fuerza atómica (MFA): 50 pm
LÍMITE DE RESOLUCIÓN
AN = apertura numérica = medida de la capacidad del
microscopio de agrupar las refracciones de la luz producidas por los
detalles del objeto.
AN = h x sen 
η = índice de refracción del 
medio que separa el cubre-
objetos de la lente objetivo.
 = ángulo de semiapertura = 
mitad del ángulo limitado por 
los rayos más periféricos que 
entran en el objetivo.
LÍMITE DE RESOLUCIÓN
MICROSCOPIO ÓPTICO (MO) DE CAMPO CLARO
480 X
MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
MO DE CAMPO CLARO MO DE CAMPO OSCURO
MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
•anillos ópticos en objetivo 
y condensador
•utiliza las diferencias en 
el índice de refracción 
producidas por la luz que
atraviesa el objeto
• = l = resolución
•Utilidad = observación de 
células y tejidos vivos, no 
coloreados
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE
•Utiliza diferencias de fase producidas por la luz que 
atraviesa el objeto.
•Se pueden obtener datos cuantitativos.
MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA
MICROSCOPIO DE LUZ UV
• Lentes de cuarzo
• λ < (250 nm) >
resolución
• Absorción de luz
UV por las 
moléculas de la 
muestra 
• Se registra en 
placa fotográfica
• Utilidad = ácidos 
nucleicos y algunos 
aminoácidos
MICROSCOPIO DE LUZ UV
MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA
• Filtro polarizador
entre luz y 
condensador
• Filtro analizador
entre objetivo y 
observador
• Sustancias que 
rotan el plano de 
luz polarizada 
producen 
birrefringencia
• Permite observar 
células vivas
MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
UV
LUZ MONO-
CROMÁTICA
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Moléculas de actina + Ac anti-actina con fluoresceína
1400 X
MICROSCOPIO CONFOCAL
Orificio puntiforme que está en 
conjunción con el punto focal de 
la lente
Enfoca el objetivo 
en un solo plano de 
corte a la vez.
Un rayo laser barre
todos los puntos del 
plano focal
MICROSCOPIO
CONFOCAL
MICROSCOPIO
DE 
FLUORESCENCIA
Haz de electrones
l = 0.005 nm
Bobinas 
electromagnéticas
Placa fotográfica
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)
Células absortivas del epitelio 
cilíndrico simple del intestino 
delgado
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)
Mitocondria 200000 X
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB)
• Los electrones no atraviesan el objeto.
• El límite de resolución es 2,5 nm.
• La imagen es tridimensional.
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB)
Células absortivas del epitelio 
cilíndrico simple del intestino delgado
Bacteria
MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA (MFA)
• No óptico.
• Sonda puntiaguda con el 
extremo del tamaño de átomo.
• Puede estudiar tejidos vivos.
• Límite de resolución = 50 pm
MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA (MFA)
ATP sintetasas ADN
MICROSCOPÍA VIRTUAL
Análisis de imágenes
Técnicas histológicas
estudio de poblaciones
celulares vivas fuera 
del organismo
animal vivo
células o tejidos vivos
MÉTODOS DE OBSERVACIÓN DIRECTA DE CÉLULAS Y 
TEJIDOS VIVOS
CULTIVOS DE 
TEJIDOS
TINCIONES VITALES
TINCIONES 
SUPRAVITALES
ESTUDIO DE TEJIDOS MUERTOS
MICROSCOPÍA ÓPTICA
TÉCNICA HISTOLÓGICA
•Fijación detiene los procesos celulares
mantiene la estructura
•Deshidratación concentraciones crecientes de 
etanol
•Aclaración xileno
•Inclusión parafina
•Corte micrótomo
crióstato
CORTE POR MICRÓTOMO
ESTUDIO DE TEJIDOS MUERTOS
MICROSCOPÍA ÓPTICA
TÉCNICA HISTOLÓGICA
Aclaración el xileno quita la parafina
Hidratación cc decrecientes de etanol
los colorantes son soluciones acuosas
Coloración colorantes básicos y ácidos (H & E)
Deshidratación cc crecientes de etanol 
Montaje cubreobjetos
Acidofilia
colorantes ácidos o aniónicos 
forman enlaces electrostáticos 
con grupos tisulares de carga 
positiva
Basofilia
colorantes básicos o catiónicos 
forman enlaces electrostáticos 
con grupos tisulares de carga 
negativa
MÉTODOS HISTOQUÍMICOS
MÉTODOS PARA SISTEMA NERVIOSO
Nissl
colorantes básicos que se unen 
a los ácidos nucleicos.
Cajal
Impregnación argéntica que 
utiliza sales de Ag que se 
reduce a Ag° sobre los neuro-
filamentos.
Kluver-Barrera
Combina un colorante básico y 
uno para mielina.
MÉTODOS HISTOQUÍMICOS
Metacromasia colorantes básicos: forma monomérica
azul y forma polimérica roja.
MÉTODOS BASADOS EN LA REACCIÓN DE 
SCHIFF PARA ALDEHIDOS
Reactivo de Schiff leucofucsina incolora que forma un producto 
estable rojo con aldehidos
Ácido periódico-Schiff (PAS) 
macromoléculas ricas en H de C 
Feulgen
ADN
MÉTODO HISTOQUÍMICO PARA LÍPIDOS
• Fijación con formalina
• Corte por congelación
• Coloración con Sudán en alcohol diluído
• Inclusión en medio acuoso
MÉTODO HISTOQUÍMICO PARA ENZIMAS
•Especificidad de
sustrato
•Corte por congelación
de tejido no fijado
•Producto de reacción
visible que señala la
localización de la 
enzima
MÉTODOS INMUNOHISTOQUÍMICOS 
Directo
Indirecto
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA E 
INDIRECTA
Ag
Ac 2º 
fluoresc.
Ac 1º
HIBRIDACIÓN IN SITU
• Se utiliza una sonda formada por un ácido nucleico monocatenario con una 
secuencia de bases conocida complementaria de la secuencia que se quiere 
demostrar
• Permite identificar secuencias de ADN correspondientes a determinados 
genes y la expresión de genes por demostración de secuencias de ARNm.
RADIOAUTOGRAFÍA
•Se inyecta una molécula marcada
con un isótopo radioactivo
•Las moléculas marcadas se
integran a macromoléculas
•Después del montaje de los
cortes se agrega una emulsión
fotográfica
•Permite saber donde se sintetiza
un producto celular y sus
desplazamientos dentro de la
célula y al salir de la misma
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ME
•Fijación glutaraldehido + OsO4
•Deshidratación concentraciones crecientes de 
etanol
•Aclaración xileno
•Inclusión resina epoxi
•Corte ultramicrótomo
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ME