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SELECCIÓN Y MANEJO DE MACHOS CON CAPACIDAD REPRODUCTIVA Logro: Implementa y analiza métodos de selección de machos con capacidad reproductiva en diferentes animales de granja DIFERENCIACIÓN DEL TESTÍCULO EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO • 1) células germinales migran hacia la cresta germinal e invaden los cordones sexuales. • 2) células de Sertoli a partir de los cordones sexuales y las células de Leydig a partir del mesénquima de la cresta genital. DIFERENCIACIÓN DEL TRACTO REPRODUCTOR EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO • 1) El conducto de Wolff se convertirá en el epidídimo, vasos deferentes y uretra • 2) Conductos de Müller Involucionan PUBERTAD PUBERTAD • Aparece cuando el sistema hipotálamo-hipófisis se desensibiliza frente a la retroalimentación negativa de esteroides gonadales • Gonadotropinas: activación testicular • Andrógenos: desarrollo sistema reproductor masculino y caracteres sexuales secundarios PUBERTAD • Los machos prepúberes secretan testosterona progresivamente en respuesta a la estimulación de gonadotropinas. Cada pulso de gonadotropinas es seguido a intervalos de una hora por una elevación transitoria en la secreción de testosterona. Conforme la pubertad progresa, el incremento de testosterona en sangre causa un descenso en la secreción de gonadotropinas mediante un efecto de retroalimentación negativa (Hafez y Hafez, 2000, citado por Quintero y Ruiz, 2008) PUBERTAD • En toros jóvenes (toretes), el periodo prepúber se caracteriza por el inicio de la espermiogénesis, que está influenciada gradualmente por aumentos en los pulsos de secreción de LH. La espermatogénesis se inicia cuando las células germinales se dividen y forman la espermatogonia, luego se da un aumento en la diferenciación hacia otro tipo de células como los espermatocitos. Cuando el espermatozoide, la célula germinal más diferenciada, se presenta por primera vez en el lumen de los túbulos seminíferos, el animal alcanza la pubertad (Curtis y Amann, 1981; Amann, 1983, citados por Quintero y Ruiz, 2008). PUBERTAD • Durante el desarrollo testicular, el inicio de la secreción de testosterona precede al comienzo de la espermatogénesis. Amman y Walker, 1983, citados por Pérez, 1992; describen la secuencia de desarrollo intratesticular en el toro de la siguiente forma: en primer lugar se produce la diferenciación de las células de Leydig, posteriormente comienza la secreción de testosterona, que induce la diferenciación de las células de Sertoli y la transformación de los gonocitos a preespermatogonias y espermatogonias A iniciándose la espermatogénesis. PUBERTAD • Skinner y col., 1968, citados por Pérez, 1992, estudiaron el desarrollo testicular en corderos Suffolk y observaron que el nivel de testosterona plasmática comenzó a elevarse a los 42 días de edad, y posteriormente, a los 63 días, se inició la espermatogénesís. • Georgie y col.,1985 citados por Pérez, 1992, trabajando con machos cabríos de las razas Black Bengal, Beetal y sus cruces encontraron niveles de testosterona ya a los 15-30 días de edad, con un pico a los 2-3 meses, seguido de un fuerte descenso entre los 3-5 meses para luego volver a aumentar a los 6 meses de edad. Según los autores, este patrón bifásico podría corresponder a la disminución de actividad secretoria de las células de Leydig fetales y su sustitución por células de Leydig postnatales, que se vuelven activas cerca de la pubertad. PUBERTAD • Además de la hormona del crecimiento y su conjunto hormonal de apoyo (tiroideas, calcitonina, vitamina D hormona y hormonas sexuales) los procesos del crecimiento están influidos por factores de crecimiento que se producen localmente en los tejidos. • Al igual que las IGF, el resto de los factores de crecimiento son un grupo de moléculas polipeptídicas con capacidad de estimular o inhibir la división celular e inducir la diferenciación. • En la familia de los Factores de Crecimiento x están el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y el Factor Transformante del Crecimiento x (TGFx) (Alvarez, s/f) PUBERTAD • La familia de Factores de Crecimiento Transformante Beta (TGF β-1 y TGF β-2) presentan la propiedad singular de poder estimular o inhibir el crecimiento celular, no solo dependiendo del tejido, sino que pueden estimular o inhibir un mismo tipo de célula dependiendo de las circunstancias en que se encuentren. Presentan una gran similitud estructural con la inhibina y la activina y con la hormona inhibidora de Muller (MIH) que es elaborada por las células de Sertoli en el momento de la diferenciación sexual del embrión másculino para atrofiar al conducto femenino (Alvarez, s/f) CONCENTRACIONES PLASMÁTICAS MEDIAS DE TESTOSTERONA Y PRODUCCIÓN ESPERMÁTICA EN EL HUMANO A DISTINTAS EDADES • 100% de la testosterona circulante unida a proteína • 40% ligado a globulina fijadora de andrógenos • 40% ligado a la albúmina • 17% a otras proteínas ESPERMATOGÉNESIS Senger, 2005 Senger, 2005 Senger, 2005 Control endocrino de la función sexual masculina Actividad paracrina Senger, 2005 Senger, 2005 du Plessis et al., 2011 citado por Serrano, 2018 ORGANIZACIÓN TESTICULAR: ESTROMA-PARÉNQUIMA Unizar.es, 2016 TÚBULO SEMINÍFERO Unizar.es, 2016 Unizar.es, 2016 TEJIDO INTERSTICIAL Células en fase de diferenciación hacia espermatozoide: • –Espermatogonias: Se dividen en de Tipo A, I y B. • –Espermatocito primario • –Espermatocito secundario • –Espermátide Las espermatogonias se dividen a su vez en : • Espermatogonias de tipo A (EGA) • Espermatogonias de tipo I (EGI) • Espermatogonias de tipo B (EGB) • Las EGA pueden clasificarse como células madre, porque pueden dividirse y originar células en diferenciación. • Las EGB y EGI, producen espermatocitos y se las clasifica como células de diferenciación. ESPERMATOCITOGÉNESIS • Espermatogonias: células de la periferia de los túbulos seminíferos que aumentan en número por división mitótica. • Espermatocitos primarios: son producidos por espermatogonios. Sufren división meiótica, reduciendo su número cromosómico a la mitad, transformándose en espermatocitos secundarios –primera división meiótica. • Espermatocitos secundarios: tienen la mitad del número cromosómico. Segunda división meiótica, formando cuatro espermátides. ESPERMIOGÉNESIS • Espermátides: experimenta cambios nucleares y citoplasmáticos que determinan su motilidad potencial debido al desarrollo de un flagelo. • Espermatozoide: son células que requieren sufrir un proceso de capacitación en el tracto genital femenino para adquirir capacidad fecundante. Senger, 2005 Senger, 2005 ESTRUCTURA DEL ESPERMATOZOIDE Senger, 2005 CABEZA CUELLO • Entre la cabeza y la pieza intermedia • Se origina de ambos centriolos. • Pieza de conexión. • Fosa de implantación. COLA • ESTRUCTURA GENERAl: • AXONEMA CENTRAL: 9 pares de microtúbulos dispuesto radialmente a dos filamentos centrales • 9 FIBRAS DENSAS: por fuera, desde el cuello, hasta fin de pieza principal. • PIEZA INTERMEDIA: estructura general + vaina mitocondrial hasta anillo citoplasmático. • PIEZA PRINCIPAL: estructura general + vaina fibrosa. • PIEZA TERMINAL: solo los 9 pares de microtúbulos alrededor de los dos filamentos centrales. CICLO DEL EPITELIO SEMINÍFERO • Producción continua de espermatogonias A0. • Liberación continua de espermatozoides a la luz del túbulo seminífero. • Se necesitan de 2 a 4 semanas para que efectos deletéreos se evidencien en el semen. • Se necesitan de 6 a 12 semanas para restaurar una normal espermatogénesis. Senger, 2005 Senger, 2005 Senger, 2005 Senger, 2005 Senger, 2005 LIBIDO DEFINICIÓN DE LIBIDO • El comportamiento sexual en el toro incluye la detección, cortejo y servicio de hembras en estro. La libido o impulso sexual ha sido definida como la disposición de un macho de tratar de montar y servir a una hembra, mientras que la habilidad de apareamiento describe su habilidad física para completarel servicio. • Existen pruebas de evaluación de libido y capacidad copulatoria a corral que son muy valiosas para conocer la habilidad de servicio y la determinación de anormalidades específicas Tamayo et al., 2010 TÉCNICAS DE EVALUACIÓN EN SEMENTALES DE ESPECIES DOMÉSTICAS • La evaluación de la fertilidad potencial en toros es una manera eficiente y confiable de identificar los que tienen un bajo potencial reproductivo, y esto va a ser mas eficiente si la selección y eliminación ocurre antes de que los toros se mezclen con las hembras. • La evaluación es también importante para identificar a los toros con potencial reproductivo satisfactorio a excelente, los que pueden entonces utilizarse en el servicio con un mayor número de hembras. COMPORTAMIENTO SEXUAL Y FEROMONAS • En los animales domésticos , bajo el nombre genérico de comportamiento o conducta sexual se incluye la conducta de apareamiento en la cual se distinguen dos fases: a) deseo sexual o libido b) las fases de la cópula • La libido es una característica altamente heredable (Duchens, 1999) • Gran parte de los machos domésticos son capaces de detectar la presencia de una hembra en celo a mucha distancia, esto básicamente porque poseen una estructura conocida como órgano vomeronasal, el cual tiene la capacidad de captar dichas sustancias odoríferas volátiles. EVALUACIÓN DE LIBIDO • Toro: la ausencia del deseo sexual es mas frecuente en algunas razas que en otras. la inhibición se caracteriza por rechazo de la cópula o eyaculación incompleta. • Potro: la conducta de apareamiento anormal se debe a un inadecuado manejo en el periodo reproductivo. • Carnero: factores estacionales como la duración del día y la temperatura. • Verraco: la baja de libido se asocia a obesidad , estrés térmico, línea genética. PRUEBA DE EVALUACIÓN DE LIBIDO La técnica descrita por Chenoweth consta de los siguientes puntos: • En un pequeño corral dos hembras son sujetas en cepos distanciados 5 - 7 metros. • Los toros deben observar la monta de otros por diez minutos para que se estimulen. • Se prueban dos toros y se observan durante diez minutos. Boggio, 2007 PRUEBA DE EVALUACIÓN DE LIBIDO Se utiliza para su evaluación la siguiente escala de puntaje: 0: El toro no muestra interés sexual. 1: Demuestra interés sexual sólo una vez. 2: Interés sexual más de una vez. 3: Búsqueda activa con persistente interés sexual. 4: Una monta o intento de monta sin servicio. 5: Dos montas o intentos de monta sin servicio. 6: Más de dos montas o intentos de monta sin servicio. 7: Un servicio seguido de desinterés sexual. 8: Un servicio seguido de interés con montas o intentos 9: Dos servicios seguidos de desinterés sexual. 10: Dos o más servicios seguidos por interés sexual con montas o intentos de monta. Cada toro es evaluado dos veces en días distintos y el peor se descarta. Boggio, 2007 FACTORES QUE AFECTAN LA LIBIDO • FACTORES GENETICOS • ETNOLOGICOS • EDAD • BIENESTAR • SANIDAD PRUEBAS DE EVALUACIÓN DE HABILIDAD DE SERVICIO Aparte de las once categorías de libido se estiman cuatro para habilidad de servicio: (Boggio, 2007) • Grupo 1: Toros que sirven satisfactoriamente. • Grupo 2: Toros que hicieron intentos de monta pero no culminaron en servicio, debido a inexperiencia, falta de técnica de apareamiento o factores patológicos. • Grupo 3: Toros que montaron pero que no llegaron al servicio debido a falta de cooperación de la hembra. Puede reflejar factores tales como inexperiencia baja libido o uso de una hembra inadecuada. • Grupo 4: Toros en los que no existe registro de habilidad de monta debido a falta de suficiente actividad para hacer una estimación. • Según Geymonat (1985), citado por Boggio, 2007, esta técnica tiene una serie de desventajas como: • Tiempo excesivamente corto, aunque permite evaluar muchos toros en un día, impide la presentación de problemas del aparato locomotor que se observarían en una prueba más larga. • Tiene un sistema de registro engorroso. • Habilidad de monta determinada en forma que no permite una definición adecuada. Por ejemplo, los toros incluidos en el Grupo 2, pueden permanecer en el hato (inexperiencia) y otros deben ser descartados (factores patológicos). • Al tener un sistema de puntaje cerrado impide estimar las relaciones con fertilidad en el empadre y el potencial de apareamiento de ese toro. CAPACIDAD DE SERVICIO Capacidad de servicio (CS) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Circunferencia escrotal (CE) 30 30.5 31 31.5 32 32.5 33 33.5 34 Potencial de empadre (PE) 40 45 50 55 60 65 70 75 80 La Capacidad de servicio se define como la cantidad de servicios que un toro realiza en un período de empadre a campo de 21 días y es predicho en más de un 90 % de exactitud por el número de servicios que completa en una prueba estandarizada en corral durante 20 minutos Boggio, 2007 CAPACIDAD DE SERVICIO • La prueba de Capacidad de Servicio reúne lo mejor para optimizar los resultados" (Geymonat, 1985, citado por Boggio, 2007)). • Libido es el deseo, impulso, vehemencia del macho a montar y probar el servicio de una hembra. Es preciso; sin embargo, diferenciar entre Libido y Capacidad de Servicio. Libido o deseo sexual es el factor predisponente y determinante de la Capacidad de Servicio, mientras que ésta última es la aptitud y destreza del toro para encontrar la hembra, detectar el celo y realizar el servicio una o más veces. • Un toro puede tener altísima Libido, pero Capacidad de Servicio baja o nula. Pero siempre que tenga baja libido su Capacidad de Servicio será baja (Boggio, 2007) • Existen pruebas de evaluación de libido y capacidad copulatoria a corral que son muy valiosas para conocer la habilidad de servicio y la determinación de anormalidades específicas. • Mediante estas pruebas se puede categorizar a los toros en alta, media y baja libido. Los de alta libido en general preñan más hembras temprano que los toros de baja libido, lo cual conduce a mejores tasas de parición y pesos de destete. • Los toros de alta libido son superiores en la detección de celo y tienden a servir más hembras con mayor frecuencia que los toros de menor libido. • Hay que tener mucho cuidado al categorizar a los toros de baja libido en el corral porque su comportamiento puede estar influenciado por distintos factores y no correlacionarse con su comportamiento a campo. CALIDAD SEMINAL • Determinar si un toro tiene buena calidad seminal es tan importante como su tamaño testicular y su libido. Poca importancia tiene un toro de buena circunferencia escrotal y alta capacidad de servicio si su semen no es bueno. • El estudio del semen es una manera de evaluar la capacidad reproductiva de un toro y algunas pruebas de laboratorio son útiles para predecir la fertilidad del semen. • Todas estas pruebas para determinar la calidad seminal son de fácil aplicación a campo y deben ir acompañadas de una exhaustiva anamnesis y revisación clínica del animal en cuestión. CARACTERÍSTICAS SEMINALES CARACTERISTICAS SEMINALES • Macroscópicas: • Volumen • Color • Aspecto • pH • Microscópicas: • Motilidad • Concentración • % espermatozoides vivos • % de anormalidades • Vitalidad • Integridad de ADN • Volumen: Es la medida en ml o cc del eyaculado (De Alba Romero, 2014). • Color: se consideran normales entre blanco y amarillento, mientras que los colores rosado, marrón y verdoso son signos de patología (De Alba Romero, 2014; Gómez y Miglorisi, 2009) • Aspecto: el eyaculado es un líquido denso, cremoso, cuyo plasma seminal contiene a los espermatozoides en suspensión (Ax y col, 2000) • pH: varía de acuerdo a la especie, con tendencia a la acidez en rumiantes y havia la alcalinidad en verracos y potros. Características macroscópicas: • Motilidad: la evaluación de este parámetro determina la proporción de espermatozoides móviles y de movimiento progresivo. • Concentración: consiste en un recuento celular que requierela dilución previa de la muestra seminal. La preparación correcta de la muestra determina la precisión del resultado (De Alba Romero, 2014). • % de espermatozoides vivos: es el porcentaje de epermatozoides que en el momento de la tinción se encuentran vivos y no se colorean porque la membrana citoplasmática es impermeable. Características microscópicas: • % de anormalidades: realizado bajo tinción y permite determinar las diferentes alteraciones de las partes que conforman un espermatozoide. • Vitalidad: refleja la integridad de la membrana plasmática y acrosomal y se puede evaluar a través de la prueba de resistencia osmótica (Test de Host) • Integridad de ADN: El estudio de la estructura de la cromatina espermática es un método para evaluar la fragmentación del ADN del esperma, un parámetro que se relaciona negativamente con la fertilidad a nivel de campo en varias especies de mamíferos. Este método calcula un índice de fragmentación del ADN (DFI) cuyos valores altos indican una estructura de la cromatina anormal (Myromslien, et al., 2019) Características microscópicas: CARACTERÍSTICAS SEMINALES - BOVINOS Parámetro Valores Bueno Regular Malo Volumen, ml 3 – 5 2 – 3 <2 Palma, 2009 Aspecto Valor descriptivo Nº esperm (millones spz/m) Cremoso Muy bueno > 750 Lechoso Bueno 400 – 750 Leche aguada Regular 250 - 400 Traslúcido Malo < 250 Ax y col, 2000 CARACTERÍSTICAS SEMINALES - BOVINOS Grado Movimiento en ondas Valor descriptivo +++ 5/5 y 4/5 Corrientes turbulentas o vertiginosas que se mueven muy rápidamente Muy buena ++ 3/5 Ondas lentas Buena + 1/5 y 2/5 Movimientos singulares o esporádicos y ninguna actividad de masa Regular - 0 Necrospermia o inmovilidad total Mala Escala para evaluar la motilidad masal del eyaculado De Alba Romero, 2014 CARACTERÍSTICAS SEMINALES - BOVINOS Escala para evaluar la motilidad individual del eyaculado Bonadonna, 1989 Porcentaje de motilidad individual 5/5 80 y 100 % de spz con movimiento rectilíneo uniforme 4/5 60 y 80% de spz con movimiento rectilíneo uniforme 3/5 40 y 60% de spz con movimiento rectilíneo uniforme 2/5 20 y 40% de spz con movimiento rectilíneo uniforme 1/5 20% o < de spz con movimiento rectilíneo uniforme CARACTERÍSTICAS SEMINALES - BOVINOS Escala para evaluar el vigor del movimiento ondulado de los espermatozoides Ax y col, 2000 Grado Nivel de movimiento 5 Movimiento progresivo muy rápido (difícil de seguir visualmente) 4 Movimiento progresivo rápido 3 Movimiento progresivo continuo a velocidad lenta 2 Movimiento lento de cola con algo de movimiento progresivo 1 Leve movimiento de cola sin desplazamiento progresivo 0 Sin movimiento CARACTERÍSTICAS SEMINALES - BOVINOS Moncayo, 2016 BNS, 2015 Ojeda, 2017 CARACTERÍSTICAS SEMINALES - PORCINOS Kubus, 2010 • El eyaculado de verraco se compone de tres fracciones: • Fase pre-espermática, es transparente, líquida y hay presencia de grumos gelatinosos. No contiene espermatozoides (10-15 cc) • Frase espermática o rica en espermatozoides, es de color blanco y muy densa y de aspecto lechoso. Tiene una gran concentración de espermatozoides y un volumen promedio de 100 cc. • La fracción post espermática o pobre en espermatozoides. Es de color blanquecino transparente con grumos gelatinosos (aprox. 200 cc). CARACTERÍSTICAS SEMINALES - PORCINOS Rodríguez-Martínez, s/f Característica Rango Volumen de eyaculado, ml 100-300 Nº total de espermatozoides x 109 10-100 Motilidad progresiva, % 70-90 Anormalidades de cabezas espermáticas, % 2-5 Gotas citoplasmáticas proximales, % 1-5 Defectos de acrosoma, % 1-2 Anormalidades de pieza media, % 2-5 Colas dobladas simples, % 1-5 Rangos y nivel de aceptabilidad de algunos parámetros de semen porcino CARACTERÍSTICAS SEMINALES - PORCINOS CaracterísticaEspermat Nº animales Promedio Volumen total (ml) 244 290.1 pH 277 7.6 Motilidad individual (%) 277 94.1 Calidad del movimiento (%) 277 4.2 Concentración (x 10³/mm³) 277 615.4 Espermatozoides normales (%) 260 77.9 Anormalidades de cabeza (%) 258 2.6 Anormalidades de pieza media (%) 259 16.6 Anormalidades de pieza principal (%) 260 2.8 Acrosomas normales (%) 260 88.1 Vitalidad (%) 256 91.9 Test hipoosmótico 271 75.7 Henao y col, 2004 Almaguer et al., 2015 CARACTERÍSTICAS SEMINALES - PORCINOS Anormalidades de espermatozoides porcinos Kubus, 2010 CARACTERÍSTICAS SEMINALES - OVINOS Sistema de valoración de ondas de movimiento Orellana, 2009 CARACTERÍSTICAS SEMINALES - OVINOS Lozano-Márquez et al., 2016 CARACTERÍSTICAS SEMINALES - OVINOS Castro et al., 2017 CARACTERÍSTICAS SEMINALES - OVINOS Castro et al., 2017 ALPACAS POTRO CONEJO AVES MÉTODOS DE ANÁLISIS DE SEMEN MÉTODOS DE ANÁLISIS DE SEMEN • Evaluación tradicional • Evaluación macroscópica : volumen , color, consistencia, pH • Evaluación microscópica : concentración, porcentaje vivos y muertos, anormalidades, test de host • Técnicas modernas : spermacue y sistema casa. • Una vez que el semen llega al laboratorio, se debe colocar en el Baño María a una temperatura de entre 32 y 35ºC para comenzar con su evaluación. EVALUACIÓN MACROSCÓPICA • Volumen: se observa directamente sobre el tubo graduado, teniendo en cuenta que un toro mayor de 2 años debe tener un eyaculado de no menos de 4ml. El volumen puede variar entre 2 y 12ml. En el caso del verraco el volumen promedio es 150ml, y del carnero 1ml. Migliorisi, 2017 • Color: se consideran normales los colores que van del blanco al amarillento. • Colores anormales: Amarillo Presencia de pus u orina Rojizo o rosado Presencia de sangre fresca Pardo o marrón Presencia de sangre vieja Amarillo verdoso Contaminación con Pseudomona aeruginosa o tratados con Vit. B12 • Densidad: la densidad del semen varía desde un semen acuoso, lechoso, lechoso cremoso, hasta un cremoso, estando directamente relacionada con la concentración: MB = Cremoso, espeso 750.000 esp/mm3 B = lechoso, 400 a 750.000 esp/mm3 R = leche aguada, 250 a 400.000 esp/mm3 P = traslucido, menos de 250.000 esp/mm3 Migliorisi, 2017 • pH: se evalúa extrayendo una gota de semen del tubo y colocándola sobre una tira indicadora de pH. Se considera un pH normal, entre 6.2 y 6.8. • No introducir la tira dentro del tubo para no alterar el semen con el reactivo de la misma. Migliorisi, 2017 EVALUACIÓN MICROSCÓPICA • Motilidad: Masal e Individual • Concentración • Coloración vital: Porcentaje de vivos y muertos • Porcentaje de anormalidades Los espermatozoides se evalúan por medio de 2 tipos de movimientos: • De rotación (alrededor de su eje) • Progresivo (desplazamiento de la célula), el cual puede ser a su vez: lineal o circular. MOTILIDAD EN MASA • Se coloca una gota del semen puro sobre un portaobjetos temperado a 36-37ºC, sobre una platina térmica de microscopio, y se lo observa a 4X a 10X, evaluando la presencia de ondas. • Se debe evaluar cerca del borde de la gota, donde la profundidad de la misma es menor y es más fácil de observar. • La escala que se toma es de 1 a 5, evaluando como 1 al semen que no presenta ondas y 5 cuando las ondas se mueven rápidamente formado remolinos. El movimiento en masa depende de tres factores: • concentración espermática • porcentaje de espermatozoides móviles en progresión lineal • velocidad de progresión de los espermatozoides. EVALUACIÓN DE LA MOTILIDAD ESPERMÁTICA Calificación Tipo de movimiento 0 Sin movimiento 1 Movimiento de cola leve sin desplazamiento progresivo 2 Movimiento de cola lento con ligero movimiento progresivo 3 Movimiento progresivo a velocidad lenta 4 Movimiento progresivo rápido 5 Movimiento progresivo rápido difícil seguir una célula determinada MOTILIDAD INDIVIDUAL Se obtiene mediante la observación en microscopio óptico a 10X – 40X de una gota seminal (generalmente diluida) dispuesta en portaobjeto. Se valoran dos parámetros: • 1. El porcentaje estimado de espermatozoides motiles que muestran algún tipo de movimientoo “motilidad total”. • 2. El porcentaje de espermatozoides motiles que presentan un movimiento progresivo o “motilidad progresiva” • Es una evaluación subjetiva Clasificación Motilidad Individual Muy buena > 80 % Motilidad progresiva Buena 60 – 79% Motilidad progresiva Regular 40 -59% Motilidad progresiva Mala < al 40% Motilidad progresiva CONCENTRACIÓN • Se colocan 10 microlitros de semen puro en 2ml. de solución salina formolada (1/200) y se homogeniza invirtiendo el tubo varias veces. • Se toman aproximadamente 14 microlitros y se carga la Cámara de Neubauer por capilaridad, en ambos retículos, teniendo en cuenta de cargar otros 14 microlitros para el segundo retículo volviendo a homogeneizar entre una carga y otra. Micropipetas • Se cuentan todos los espermatozoides que se encuentren en las 4 cuadrículas de las puntas y la central (5 en total) teniendo en cuenta de incluir también los espermatozoides que se encuentren sobre 2 de las triples líneas de cada cuadrícula, ya sean la superior y derecha ó la izquierda e inferior. Se cuentan los retículos de ambos lados de la cámara y se saca el promedio. • El número de espermatozoides contado, se multiplica por 10.000 en el caso de rumiantes y 5.000 en el caso de verracos y caballos; así se obtiene la cantidad de espermatozoides por milímetro cúbico de semen COLORACIÓN VITAL PORCENTAJE DE VIVOS Y MUERTOS • Se realiza extrayendo una gota de aproximadamente 10 microlitros de semen puro y colocándola a 36,-37ºC sobre la platina térmica. • Sobre esta gota se coloca una gota de aproximadamente 30 microlitros de eosina- nigrosina, que debe estar a la misma temperatura del semen, en un tubo dentro del Baño María. • Se mezcla suavemente con la punta de la pipeta por aproximadamente 20 segundos. • Se deja secar sobre la platina térmica y se procede a su lectura. • El fundamento de esta técnica es el siguiente: el colorante penetra la membrana de los espermatozoides muertos, dejando sin teñir los que se encontraban vivos al momento de realizar la tinción. • Se cuentan no menos de 100 células y se saca el porcentaje. • Valor mínimo aceptable, el 70 % de espermatozoides vivos La prueba de resistencia osmótica (HOST) • Evalúa la integridad de la membrana espermática y la prueba de integridad acrosomal, a través de tinción Azul de Tripán/ Giemsa, permiten predecir con bastante confiabilidad la capacidad fértil de un toro, toda vez que se ha encontrado correlaciones altas y positivas con la tasa de fertilidad in vivo. ANORMALIDADES ESPERMÁTICAS • Cabezas piriformes y angostas • Micro y Macrocefalia. • Defectos en el acrosoma. • Cabezas sueltas. • Cola Doblada. • Células medusa. • Gota citoplasmática proximal. SISTEMAS COMPUTADORIZADOS DE ANÁLISIS SEMINAL (CASA) SISTEMA CASA • Los sistemas automatizados (Computer Assisted Sperm Analysis, CASA) actuales substituyen el sistema perceptivo y de análisis de un observador por un sistema electrónico de captura de imágenes y un software específico para el análisis computacional de la información SISTEMA CASA • Los sistemas CASA se basan en el análisis de imagen computarizado, es decir la obtención de información numérica a partir de una imagen, sea una secuencia de imágenes para movilidad o una imagen fija para morfología. Un sistema CASA incluye un microscopio óptico equipado con contraste de fases, a ser posible de tipo negativo, con una platina calefactada; una cámara de vídeo; un ordenador y un software adecuado y fiable • El sistema CASA combina una cámara termostáticamente controlada, denominada cámara de Makler, en la cual se deposita una alícuota de semen y se mantiene la temperatura (37°C) durante el examen. Por otra parte, posee un sistema óptico con iluminación de contraste de fase, un detector de imágenes, un sistema de computación y un monitor de video. (Brogliatti, 2008) Este sistema permite calcular : -Porcentaje de espermatozoides móviles -Porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva -Velocidad de movimiento - Integridad de ADN (Brogliatti, 2008) Permite identificar la existencia de sub-poblaciones de espermatozoides, con distintos patrones de movimiento, que coexisten en la misma muestra de semen, lo cual es una visión más real, ya que una muestra de semen es una población heterogénea (Muiño et al., 2006). PARÁMETROS DEL SISTEMA CASA QUE EVALÚAN LA MOTILIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES: SEGÚN LA VELOCIDAD DE DESPLAZAMIENTO • Velocidad curvilínea (VCL): velocidad promedio de desplazamiento de la cabeza del espermatozoide a lo largo de su trayectoria real. Se mide en µm/seg. • Velocidad rectilínea (VSL): velocidad promedio de la cabeza del espermatozoide a lo largo de una línea recta, desde la primera hasta la última posición. Se mide en µm/seg. • Velocidad promedio de desplazamiento (VAP): velocidad promedio de la cabeza del espermatozoide a lo largo de su trayectoria promedio. Se mide en µm/seg. • Porcentaje de linealidad (LIN): relación entre VSL y VCL. Se mide en porcentaje (%). • Índice de rectitud (STR): relación entre VSL y VAP. Se mide en porcentaje (%). SEGÚN LA TRAYECTORIA QUE REALIZA LA CABEZA DEL ESPERMATOZOIDE • Índice de oscilación (WOB): relación entre VAP y VCL. Se mide en porcentaje (%). • Amplitud del desplazamiento lateral de cabeza (ALH): valor promedio lado a lado de la cabeza en cada ciclo de batido. Se mide en µm. • Frecuencia de batido (BCL): frecuencia con la cual la verdadera trayectoria del espermatozoide cruza la trayectoria promedio. Se mide en Hz. • Desplazamiento angular medio absoluto (MADAbs) • Desplazamiento angular medio algebraico (Medang) • Menor oscilación armónica de la cabeza del espermatozoide (HLO) • Mayor oscilación armónica de la cabeza del espermatozoide (HHI) • Oscilación media de la cabeza del espermatozoide (HHI) • Máxima amplitud de la oscilación de la cabeza espermática (HMX): • Armónico básico de la oscilación de la cabeza espermática (HBS) • Amplitud del armónico (HY) Sin embargo, no todos estos parámetros se utilizan de manera rutinaria, y no todos son esenciales a la hora de la evaluación de una muestra. INTEGRIDAD DE ADN • El contenido de la cromatina en el núcleo del espermatozoide del mamífero maduro es una estructura compacta y estable. Esta organización no solo le permite transferir la información genética al ovocito, también asegura que el ADN sea liberado en una forma física y química ideal para que el embrión en desarrollo pueda acceder a la información genética (Sakkas et al., 1999). • Las alteraciones en la cromatina pueden afectar la capacidad de fertilización del espermatozoide (Hernández et al., 2006). • Se han desarrollado una variedad de métodos para detectar cambios en la estructura de la cromatina o en la integridad del ADN, uno de ellos es el ensayo de la estructura de la cromatina espermática (SCSA), que mide, mediante citometría de flujo, la susceptibilidad del ADN espermático a la desnaturalización in situ (Evenson et al., 1980). SISTEMA CASMA El desarrollo de sistemas de análisis de la morfometría del espermatozoide asistidos por ordenador (CASMA) ha permitido el uso de los parámetros morfométricos para identificar subpoblaciones espermáticas en diferentes especies (Esteso et al., 2009; Martí et al., 2011; Maroto Morales et al., 2012). Es importante disponer de estos datos morfométricos para intentar mejorar la capacidad fecundante in vivo de las dosis seminales, puesto que se ha comprobado que la morfometría anormal de las cabezas espermáticas influye negativamente en la fertilidad de los sementales bovinos (Gravance et al., 1996) En el análisis morfométrico, los parámetros que se suelen medir en la cabeza del espermatozoide son: -El área (A, en μm2, como la suma de toda el área de píxeles contenidos dentro de los límites) -El perímetro (P, en μm, como la suma de las fronteras exteriores) -La anchura (W) -La longitud (L) (en μm, los valores máximo y mínimo, respectivamente,de los diámetros del núcleo). FERTILIDAD DE MACHO CARACTERÍSTICAS EMPLEADAS PARA SU EVALUACIÓN • Concentración • Volumen • Motilidad • Motilidad masal • Motilidad individual • Morfología • Espermatozoides normales • Espermatozoide anormales • Circunferencia escrotal FACTORES QUE AFECTAN LA FERTILIDAD DEL MACHO • Edad • Ambiente • Anomalías congénitas. • Endocrinopatías. FACTORES QUE AFECTAN LA FERTILIDAD DEL MACHO • Si es un macho adulto, se debe plantear si el problema está en la libido-erección. Puede ser porque: • Se está cubriendo en un momento del celo inadecuado • Preferencias. • Ambiente inadecuado. • Inexperiencia. • Orden jerárquico. • Malas experiencias. • Factores físicos. • Dolor en patologías. • Endocrinopatías. • Edad. Rimbaud, 2005 FACTORES QUE AFECTAN LA FERTILIDAD DEL MACHO • Si tienen una erección y conducta normales se debe mirar si eyacula o no eyacula: • Eyaculación retrógrada. • Problemas del simpático (condiciona la eyaculación). • Si es normal puede ser: • Problemas de la hembra. • Problemas cromosómicos. • Técnica de inseminación artificial y conservación y transporte de semen. • Inmunidad muy rara. • Brucelosis Rimbaud, 2005
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