Guía TP n 1 Propagación de virus en cultivos celulares

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Virología 2020 
Trabajo Práctico N° 1 
 
Presentación docentes trabajos prácticos https://youtu.be/UcOdAtPjCHw 
 
Introducción 
 
La familia Baculoviridae está integrada por virus envueltos, con genoma ADN 
doble cadena y nucleocápside helicoidal. Una particularidad de los baculovirus es 
que durante su ciclo de replicación se forman dos tipos de viriones, 
genotípicamente idénticos pero fenotípicamente diferentes. Así, en la etapa 
temprana del ciclo, se producen los viriones brotados que son los encargados de 
la diseminación de la infección en el insecto huésped y de iniciar una infección en 
un cultivo celular. En tanto que, la etapa muy tardía se caracteriza por la 
producción de los viriones ocluidos responsables de la infección primaria de los 
hospederos. El virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Anticarsia gemmatalis 
(AgMNPV), que forma parte de la familia arriba mencionada, tiene la particularidad 
de infectar en forma específica a las larvas de Anticarsia gemmatalis, uno de los 
principales insectos plagas que ataca a los cultivos de soja ocasionando grandes 
pérdidas económicas y de producción. El interés por la producción en cultivos 
celulares del AgMNPV se debe a sus variadas aplicaciones, entre las que se 
destacan: su utilización como agente de control biológico, la expresión de 
proteínas recombinantes y su empleo como vehículos de transferencia génica. 
 
Videos explicativos: 
-Laboratorio de Virología https://youtu.be/YP1rPW9ascE 
-Línea celular https://youtu.be/eqhep4Ovjko 
-Virus https://youtu.be/hhdZ5FEvNyQ 
-Parámetros de infección https://youtu.be/breY88YeUks 
-Procedimiento para realizar un pasaje celular o iniciar un nuevo cultivo 
 https://youtu.be/v-adbDNclMI 
https://youtu.be/UcOdAtPjCHw
https://youtu.be/YP1rPW9ascE
https://youtu.be/eqhep4Ovjko
https://youtu.be/hhdZ5FEvNyQ
https://youtu.be/breY88YeUks
https://youtu.be/v-adbDNclMI
 
 
 
1- Observación de cultivos estáticos de una línea celular de insectos 
lepidópteros sin infectar e infectados con un baculovirus 
Materiales 
- Cultivos de la línea celular UFL-AG-286 adaptados al crecimiento estático en el 
medio UNL-8 + 10% de suero fetal bovino (SFB). 
- Cultivos de la línea celular UFL-AG-286 adaptados al crecimiento estático en el 
medio UNL-8 + 10% SFB e infectados con AgMNPV a distintas multiplicidades de 
infección (MOI): 0,01 y 10 DICC50.célula-1. 
- Microscopio óptico invertido. 
 
Video: Diferencias entre cultivos celulares infectados a baja MOI y alta MOI
 https://youtu.be/UdAE4rO-9eE 
 
Metodología de trabajo 
a) Observar las características morfológicas de las células en cultivo sin infectar. 
b) Identificar la presencia de efecto citopático (ECP) en los cultivos infectados y 
establecer las diferencias entre los cultivos infectados en forma sincrónica (alta 
MOI) y los infectados en forma no sincrónica (baja MOI). 
 
2- Cálculo de la densidad celular de cultivos estáticos infectados y sin 
infectar 
El recuento de células es una técnica habitual dentro del conjunto de 
procedimientos que se utilizan en el cultivo de células animales. Entre los distintos 
métodos empleados con este fin, el hemocitómetro o cámara de Neubauer es la 
herramienta más utilizada. La posibilidad de distinguir células viables de no 
viables, mediante la tinción con un colorante de exclusión, le otorga un valor 
adicional a la técnica. Entre los colorantes de uso más frecuente se encuentra el 
azul de Trypan (solución al 0,4% en PBS) que tiñe de azul las células no viables y 
es excluido de las viables. 
https://youtu.be/UdAE4rO-9eE
 
 
Materiales 
- Cultivos de la línea celular UFL-AG-286 adaptados al crecimiento estático en el 
medio UNL - 8 + 10% SFB. 
- Microscopio óptico invertido. 
- PBS (1X). 
- Solución de azul de Trypan 0,4% 
 
Metodología para el cálculo de la densidad celular y la determinación de la 
viabilidad de un cultivo. 
Para calcular la densidad de un cultivo celular se emplea un hemocitómetro de 
doble cámara, que debe tener el cuadriculado de Neubauer. Cada hemicámara 
permite realizar cuatro recuentos independientes. Cada recuento se realiza sobre 
un cuadrado de 1 mm de lado y la altura (dada por el espacio dejado por el cubre 
cámara) es de 0,1 mm. De esta manera, el volumen de suspensión con el que se 
trabaja en cada uno de los cuatro recuentos de una cámara es de 0,1 mm3. 
 
 
 
 
 
 
 
Cuadriculado de Neubauer correspondiente a una hemicámara de un hemocitómetro 
 
 
 
 
Los círculos indican las zonas 
donde se realizan los 
recuentos celulares 
 
10 l Azul de 
Trypan 
 
Técnica operatoria 
 0,5 ml suspensión celular 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para los cálculos de las densidades celulares y el porcentaje de viabilidad se 
aplicarán las siguientes fórmulas: 
NT (células totales.ml-1) = promedio células x 104 x (factor de dilución)-1 
Nm (células muertas.ml-1) = promedio de células azules x 104 x (factor de dilución)-1 
Nv (células viables.ml-1) = NT - Nm 
% viabilidad = Nv / (NT) x 100 
 
3- Cálculo del título de viriones brotados 
Los viriones brotados de AgMNPV son el fenotipo viral responsable de iniciar una 
infección en un cultivo celular. El título de un stock de este fenotipo viral puede ser 
determinado por el método virológico clásico de dilución límite y punto final. 
 
Titulación viral aplicando el método de dilución límite y punto final 
Video: Procedimiento para la titulación viral aplicando el método de dilución limite y 
punto final https://youtu.be/bOfrLCc0C7U 
Cultivo celular 
resuspendido y 
homogenizado 
 
10 l de la mezcla por cada 
hemicámara 
50 l 
40 l PBS 
https://youtu.be/bOfrLCc0C7U
 
 
 
La determinación de un título viral por la técnica de dilución límite y punto final 
involucra la inoculación de múltiples unidades de prueba (cultivos celulares) con 
diferentes diluciones de la muestra viral que se desea cuantificar, y la estimación 
de la dilución de esa muestra que infectaría el 50% de unidades de prueba. Esta 
cantidad de virus es conocida como dosis infecciosa para cultivos celulares 
50% (DICC50). Los títulos virales determinados de esta manera pueden ser 
expresados en DICC50.ml-1. El método aquí descripto para estimar el valor de la 
DICC50 fue desarrollado y publicado por Reed y Müench en 1938. 
Materiales 
- Cultivos de la línea celular UFL-AG-286 adaptados al crecimiento estático en el 
medio UNL - 8 + 10% SFB 
- Stock de viriones brotados del AgMNPV. 
- Placa para cultivos celulares de 96 pocillos. 
Metodología 
- Dilución de la muestra que contiene los viriones brotados 
 
 
 
 
Descongelar la muestra en baño de hielo y homogenizar. 
 
 
 
 
 
 
Importante!!!!: entre dilución y dilución, se deben cambiar las puntas de las 
micropipetas y homogenizar varias veces. 
 
450 l UNL - 8 + 10% SFB 
stock viral 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
50 l 50 l 50 l 50 l 50 l 50 l 50 l 50 l
stock viral 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
50 l 50 l 50 l 50 l 50 l 50 l 50 l 50 l
Stock 
ccviral 
 
 
- Preparación de las células 
1) Retirar un frasco de cultivo de 25 cm2 de la estufa de incubación (T = 28 ºC) y 
observar al microscopio óptico invertido la integridad de la monocapa celular 
(células adaptadas al crecimiento en el medio de cultivo UNL - 8 + 10% SFB). 
2) Resuspender, por acción mecánica, la monocapa celular. Homogenizar varias 
veces la suspensión celular tratando de no formar espuma. 
3) Calcular la densidad celular del cultivo (células viables.ml-1). 
4) Dispensar en un tubo cónico de 15 mL, una alícuota de la suspensión celular de 
manera de partir de una densidad de 4x105 células viables.ml-1 (volumen final = 5 
ml). 
5) Centrifugar la alícuotade la suspensión celular a 1000 rpm durante 5 minutos. 
6) Descartar el sobrenadante y el pellet celular reconstituirlo en 5 ml del medio 
UNL- 8 + 10% SFB. 
7) Distribuir la suspensión celular resultante de la siguiente manera: 
 
 
 
 
 
Rotular los 8 primeros tubos desde 10-1 a 10-8. El último, rotularlo como tubo 
control. 
- Llenado de la placa de cultivos celulares 
 
 
 
 
 
 
 
 
300 l de suspensión celular 
dilución del virus
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
dilución del virus
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
control
300 l
suspensión celular
UN-10
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 control
300 l
suspensión celular
UN-10
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 
300 µl 
UNL-
8+10%SFB 
 
 
 
Homogenizar varias veces la suspensión resultante. De cada dilución, por pocillo, 
dispensar por quintuplicado 100 l de la mezcla células - virus. Igual tratamiento 
se realizará con el tubo control. Finalmente, llevar la placa a la estufa de 
incubación (28 ºC). 
 
Video: Placa de titulación de viriones brotados por el método de punto límite y punto final
 https://youtu.be/sd11N3qOmCc 
 
Registro de resultados y cálculo del título viral 
Utilizando un microscopio óptico invertido a los 7 días de incubación se realizará el 
registro final de los resultados teniendo en cuenta el siguiente criterio: si se 
observa en un pocillo al menos una célula con ECP (presencia de cuerpos de 
oclusión), ese pocillo será considerado positivo. En caso contrario, será registrado 
como negativo. 
 
Importante!!!!!!!!: si en alguno de los pocillos correspondiente al control sin 
infección se observa una célula con presencia de cuerpos de oclusión, la titulación 
deberá realizarse nuevamente. 
 
Finalmente, se calculará el título de la muestra aplicando el método de Reed-
Müench. 
https://youtu.be/sd11N3qOmCc
 
 
 
Virología 2020 
Informe de Trabajo Práctico 
 
1-a) Calcular la densidad de células totales, células viables, células no viables y 
porcentaje de viabilidad de un cultivo de la línea celular UFLAg-286, a partir de los 
siguientes recuentos: 
Hemicámara 1: 
Células sin coloración: 89; 92; 95; 91 
Células azules: 1; 4; 3; 1 
Hemicámara 2: 
Células sin coloración: 79; 85; 90; 91 
Células azules: 0; 3; 5; 1 
Tener en cuenta que la muestra de células, tomada del cultivo, fue diluida al medio 
antes de realizar el recuento. 
b) Si, en función de los resultados obtenidos anteriormente, tiene que iniciar un 
nuevo cultivo de densidad 3,5x105 células viables.ml-1 (volumen final del cultivo 5 
ml), ¿qué volumen de inoculo celular debería utilizar? 
 
2- A partir de las explicaciones de los docentes y de las imágenes observadas, 
indicar las diferencias (morfología celular; densidad celular de los cultivos y 
porcentaje de efecto citopático) entre un cultivo celular infectado a alta MOI y otro 
infectado a baja MOI. 
 
3- En la siguiente tabla se transcriben los resultados observados en una placa de 
titulación de un stock viral aplicando el método de dilución límite y punto final. 
 
 
 
 
 
 
100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 C 
+ + + + + + + + - - 
+ + + + + + + - - - 
+ + + + + + + - - - 
+ + + + + + + + - - 
+ + + + + + + + - - 
 
 
a) De acuerdo a los datos consignados en la tabla, calcular el título del stock viral 
aplicando el método de Reed y Müench teniendo en cuenta que el inóculo viral 
utilizado fue de 50 µl. 
b) ¿Cómo procedería si en uno de los pocillos control observa presencia de efecto 
citopático? 
 
4- En función del título viral obtenido en el punto “3 a” ¿qué volumen del stock viral 
se necesitan para infectar, a una MOI de 2 DICC50 .célula-1, un cultivo celular de 
densidad 2,0 x 105 células.ml-1 (volumen final del cultivo 5 ml).