Informe TP 2 evaluado

Vista previa del material en texto

VIROLOGÍA 2020
9,7
Trabajo Practico N.º 2
Diagnostico rapido: PCR
1)- 
	a. Con ayuda de la hoja de información del Set de dNTPs (imagen siguiente), indicar los volúmenes de cada dNTP y de agua necesarios para obtener una solución stock de concentración 10 mM, y un volumen final de 100 μL. 
	b. Previamente a la realización de la PCR, se deben resuspender además, los primers liofilizados para preparar la solución de trabajo que será utilizada en la reacción de amplificación. A modo de práctica, consulten la hoja de información que acompaña los primers (se transcribe a continuación), y calcule qué volumen se debe añadir al liofilizado para obtener una concentración de 100 μM? 
c. Determinar la concentración final de cada componente en las mezclas de reacción para la retrotranscripción y la PCR.
	Retrotranscripcion 
	-2,0 μl de Buffer 5X 
	
	-2,0 μl de DTT 0,1M 
	
	-0,5 μl de Inhibidor de RNAsa 20 U/µl 
	
	-1,0 μl de dNTPs 10 mM 
	
	-1,0 μl M-MuLV RT 200 U/µl 
	
	Volumen Final de reacción: 12 μl 
	d. Determinar los volúmenes de cada componente necesarios para la preparación de la Master Mix, teniendo en cuenta para ello la cantidad de reacciones de PCR que realizará cada comisión de trabajo. 
	PCR
	Componentes
	Concentracion (stock)
	Cantidad de μL/tubo
	Concentracion Final
	Volumen necesario (μL)
	Buffer 
	10X 
	2,5 
	
	17,5
	MgCl2 
	25mM 
	1,5 
	
	10,5
	dNTPs 
	10mM 
	0,5 
	
	3,5
	“Primer Foward” 
	10μM 
	1 
	
	7,0
	“Primer Reverse” 
	10μM 
	1 
	
	7,0
	Taq Polimerasa 
	5U/μL 
	0,15 
	
	1,05
	Agua estéril 
	c.s.p 50 μL 
	15,85 
	---
	110,95
	ADN 
	Stock 
	2,5 
	--
	17,5
	Volumen Final de reacción: 25 μl 
2)- Dada parte de la secuencia del genoma del virus de la Fiebre Amarilla, determinar donde hibridarán los cebadores Flavi 1 y 2. 
5’GCCCTGGGATTCCTGAATGAGGACCATTGGGCTTCCAGGGAAAACTCAGGAGGAGGAGTGGAAGGCATTGGCTTACAATACCTAGGATATGTGATCAGAGACCTGGCTGCAATGGATGGTGGTGGATTCTACGCGGATGACACCGCTGGATGGGACACGCGCATCACAGAGGCAGACCTTGATGATGAACAGGAGATCTTGAACTACATGAGCCCACATCACAAAAAACTGGCACAAGCAGTGATGGAAATGACATACAAGAACAAAGTGGTGAAAGTGTTGAGACCAGCCCCAGGAGGGAAAGCCTACATGGATGTCATAAGTCGACGAGACCAGAGAGGATCCGGGCAGGTAGTGACTTATGCTCTGAACACCATCACCAACTTGAAAGTCCAATTGATCAGAATGGCAGAAGCAGAGATGGTGATACATCACCAACATGTTCAAGATTGTGATGAATCAGTTCTGACCAGGCTGGAGGCATGGCTCACTGAGCACGGATGTGACAGACTGAAGAGGATGGCGGTGAGTGGAGACGACTGTGTGGTCCGGCCCATCGATGACAGGTTCGGCCTGGCCCTGTCCCATCTCAACGCCATGTCCAAGGTTAGAAAGGACATATCTGAATGGCAGCCATCAAAAGGGTGGAATGATTGGGAGAATGTGCCCTTCTGTTCCCACCACTTCCATGAACTACAGCTGAAGGATGGCAGGAGGATTGTGGTGCCTTGCCGAGAACAGGACGAGCTCATTGGGAGAGGAAGGGTGTCTCCAGGAAACGGCTGGATGATCAAGGAAACAGCTTGCCTCAGCAAAGCCTATGCCAACATGTGGTCACTGATGTATTTTCACAAAAGGGACATGAGGCTACTGTCATTGGCTGTTTCCTCAGCTGTTCCCACCTCATGGGTTCCACAAGGACGCACAACATGGTCGATTCATGGGAAAGGGGAGTGGATGACCACGGAAGACATGCTTGAGGTGTGGAACAGAGTATGGATAACCAACAACCCACACATGCAGGACAAGACAATGGTGAA 3’ 
 → Flavi 1
 → Flavi 2
 
3)- Calcular el tamaño de fragmento que será amplificado. 
El tamaño del fragmento genómico que se va a amplificar será de 863 pb.
4)- Análisis del gel de agarosa: 
a. ¿Hay amplificación en las muestras? 
Si, hay amplificación de las muestras, dado que el control positivo de la PCR dio bien, y también el control de la RT; por lo que podemos concluir que si hubo amplificación de la muestra y que además el procedimiento fue adecuado y correcto. 
Por lo que podemos decir que la muestra 1 es positiva para el virus de la Fiebre Amarilla mientras que la muestra 2 es negativa.
b. ¿Existen fragmentos inespecíficos? ¿Por qué? Si existieran, ¿cómo resolvería este inconveniente? 
No no existen fragmentos inespecíficos; las bandas que se ven de aproximadamente 100 pb podrían ser restos sobrantes de dNTPs ya que se agregan en excesos, primers que no se unieron, restos de proteínas como la taq polimerasa. En el caso de que existieran fragmentos inespecíficos se puede solucionar utilizando otros tipos de primeras. 
c. ¿A qué pueden atribuirse las bandas que se observan más abajo en todas las calles del gel?
Las bandas observadas abajo que son de aproximadamente 100 pb, podrían ser restos de primers, dNTP que no se utilizaron, restos de proteínas.
5)-Luego de una RT-PCR, en el caso de no observar productos de amplificación. ¿Cuáles pueden ser las causas? Indique por lo menos cuatro de ellas. 
1. Enzima RT desnaturalizada.
2. Primers erróneos y que no hayan hibridado en ninguna parte de la cadena de ADN.
3. Temperatura errónea.
4. Fallas en el termociclador.
5. Fallas en la extracción de ARN.
6. La taq polimerasa está desnaturalizada.
7. Mala preparación del gel, puede pasar que se preparó el gel en una concentración menor a la necesaria y a igual condiciones de corrida la muestra se salió del gel dado que correcta más rápido.
1/4