Informe TP 2

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Trabajo Practico N.º 2
Diagnostico rapido: PCR
1)-
	a. Con ayuda de la hoja de información del Set de dNTPs (imagen siguiente), indicar los volúmenes de cada dNTP y de agua necesarios para obtener una solución stock de concentración 10 mM, y un volumen final de 100 μL.
	b. Previamente a la realización de la PCR, se deben resuspender además, los primers liofilizados para preparar la solución de trabajo que será utilizada en la reacción de amplificación. A modo de práctica, consulten la hoja de información que acompaña los primers (se transcribe a continuación), y calcule qué volumen se debe añadir al liofilizado para obtener una concentración de 100 μM?
c. Determinar la concentración final de cada componente en las mezclas de reacción para la retrotranscripción y la PCR.
	Retrotranscripcion
	-2,0 μl de Buffer 5X
	
	-2,0 μl de DTT 0,1M
	
	-0,5 μl de Inhibidor de RNAsa 20 U/µl
	
	-1,0 μl de dNTPs 10 mM
	
	-1,0 μl M-MuLV RT 200 U/µl
	
	Volumen Final de reacción: 12 μl
	d. Determinar los volúmenes de cada componente necesarios para la preparación de la Master Mix, teniendo en cuenta para ello la cantidad de reacciones de PCR que realizará cada comisión de trabajo.
	PCR
	Componentes
	Concentracion (stock)
	Cantidad de μL/tubo
	Concentracion Final
	Volumen necesario (μL)
	Buffer
	10X
	2,5
	
	17,5
	MgCl2
	25mM
	1,5
	
	10,5
	dNTPs
	10mM
	0,5
	
	3,5
	“Primer Foward”
	10μM
	1
	
	7,0
	“Primer Reverse”
	10μM
	1
	
	7,0
	Taq Polimerasa
	5U/μL
	0,15
	
	1,05
	Agua estéril
	c.s.p 50 μL
	15,85
	---
	110,95
	ADN
	Stock
	2,5
	--
	17,5
	Volumen Final de reacción: 25 μl
2)- Dada parte de la secuencia del genoma del virus de la Fiebre Amarilla, determinar donde hibridarán los cebadores Flavi 1 y 2.
5’GCCCTGGGATTCCTGAATGAGGACCATTGGGCTTCCAGGGAAAACTCAGGAGGAGGAGTGGAAGGCATTGGCTTACAATACCTAGGATATGTGATCAGAGACCTGGCTGCAATGGATGGTGGTGGATTCTACGCGGATGACACCGCTGGATGGGACACGCGCATCACAGAGGCAGACCTTGATGATGAACAGGAGATCTTGAACTACATGAGCCCACATCACAAAAAACTGGCACAAGCAGTGATGGAAATGACATACAAGAACAAAGTGGTGAAAGTGTTGAGACCAGCCCCAGGAGGGAAAGCCTACATGGATGTCATAAGTCGACGAGACCAGAGAGGATCCGGGCAGGTAGTGACTTATGCTCTGAACACCATCACCAACTTGAAAGTCCAATTGATCAGAATGGCAGAAGCAGAGATGGTGATACATCACCAACATGTTCAAGATTGTGATGAATCAGTTCTGACCAGGCTGGAGGCATGGCTCACTGAGCACGGATGTGACAGACTGAAGAGGATGGCGGTGAGTGGAGACGACTGTGTGGTCCGGCCCATCGATGACAGGTTCGGCCTGGCCCTGTCCCATCTCAACGCCATGTCCAAGGTTAGAAAGGACATATCTGAATGGCAGCCATCAAAAGGGTGGAATGATTGGGAGAATGTGCCCTTCTGTTCCCACCACTTCCATGAACTACAGCTGAAGGATGGCAGGAGGATTGTGGTGCCTTGCCGAGAACAGGACGAGCTCATTGGGAGAGGAAGGGTGTCTCCAGGAAACGGCTGGATGATCAAGGAAACAGCTTGCCTCAGCAAAGCCTATGCCAACATGTGGTCACTGATGTATTTTCACAAAAGGGACATGAGGCTACTGTCATTGGCTGTTTCCTCAGCTGTTCCCACCTCATGGGTTCCACAAGGACGCACAACATGGTCGATTCATGGGAAAGGGGAGTGGATGACCACGGAAGACATGCTTGAGGTGTGGAACAGAGTATGGATAACCAACAACCCACACATGCAGGACAAGACAATGGTGAA 3’
 → Flavi 1
 → Flavi 2
 
3)- Calcular el tamaño de fragmento que será amplificado.
El tamaño del fragmento genomico que se va a amplificar sera de 863 pb.
4)- Análisis del gel de agarosa:
a. ¿Hay amplificación en las muestras?
Si, hay amplificacion de las muestras, dado que el control positivo de la PCR dio bien, y también el control de la RT; por lo que podemos concluir que si hubo amplificacion de la muestra y que ademas el procedimiento fue adecuado y correcto.
Por lo que podemos decir que la muestra 1 es positiva para el virus de la Fiebre Amarilla mientras que la muestra 2 es negativa.
b. ¿Existen fragmentos inespecíficos? ¿Por qué? Si existieran, ¿cómo resolvería este inconveniente? 
No no existen fragmentos inespecificos; las bandas que se ven de aproximadamente 100 pb podrían ser restos sobrantes de dNTPs ya que se agregan en excesos, primers que no se unieron, restos de proteínas como la tac polimerasa. En el caso de que existieran fragmentos inespecificos se puede solucionar utilizando otros tipos de primers.
c. ¿A qué pueden atribuirse las bandas que se observan más abajo en todas las calles del gel?
Las bandas observadas abajo que son de aproximadamente 100 pb, podrian ser restos de primers, dNTP que no se utilizaron, restos de proteínas.
5)-Luego de una RT-PCR, en el caso de no observar productos de amplificación. ¿Cuáles pueden ser las causas? Indique por lo menos cuatro de ellas.
	Enzima RT desnaturalizada.
	Primers erróneos y que no hayan hiridado en ninguna parte de la cadena de ADN.
	Temperatura errónea.
	Fallas en el termociclador.
	Fallas en la extracción de ADN.
	La tac polimerasa este desnaturalizada.
	Mala preparación del gel, puede pasar que se preparo el gel en una concentración menor a la necesaria y a igual condiciones de corrida la muestra se salio del gel dado que correcta mas rápido.
VIROLOGIA 2020
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