Guía de Trabajo Práctico N 2

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Trabajo Práctico N° 2 
Diagnóstico rápido: PCR 
Video explicativo: Introducción TP 2 https://youtu.be/4ydpeMbGWgI 
Introducción 
La reacción en cadena de la polimerasa, PCR (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de 
biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis. Esta técnica, se puede utilizar como 
método diagnóstico en Virología y se la considera como una metodología específica y eficiente, que 
permite amplificar el número de moléculas de ADN, entre 106 y 109 veces al cabo de 20-30 ciclos. 
Esencialmente, la técnica permite la amplificación selectiva de cualquier segmento de ADN, 
conociendo las secuencias que lo flanquean. Durante la reacción, el ADN molde es, en primer lugar, 
desnaturalizado por calentamiento en presencia de un exceso de cebadores y los cuatro dNTPs 
(dATP, cCTP, dGTP, dTTP). Posteriormente, esta mezcla se enfría a una temperatura que permite a 
los cebadores o “primers” aparearse con sus secuencias complementarias en el ADN. Por último, se 
produce la extensión de los cebadores mediante una ADN polimerasa. 
El ciclo de desnaturalización, apareamiento y síntesis de ADN se repite varias veces y debido a que 
el producto de una ronda de amplificación sirve como templado para la siguiente, cada ciclo 
sucesivo duplica la cantidad de ADN. El principal producto de esta reacción exponencial es un 
segmento de ADN bicatenario cuyos extremos están definidos por el extremo 5´ de los cebadores. 
Los componentes básicos de la reacción son: los oligonucleótidos (cebadores o “primers”), ADN 
polimerasa, buffer de reacción, cationes divalentes de Mg2+, deoxirribonucleótidos trifosfato 
(dNTPs) y el ADN utilizado como templado (molde). 
En la actualidad la reacción se efectúa en un termociclador, que es un dispositivo automático que 
permitirá incubar las muestras a las diferentes temperaturas que permitan llevar a cabo: 
 La etapa de desnaturalización, en dónde se produce la ruptura de los puentes de hidrógeno 
que mantiene unidas las hebras del templado de ADN. 
 El apareamiento o hibridación. En esta etapa, los “primers” hibridan con el ADN templado. 
 La extensión del ADN, es decir, la reacción de polimerización mediante la acción de la Taq 
polimerasa. 
Para la detección de virus con genoma ARN, se utiliza una variante de la técnica que es la RT-PCR, 
en dónde a partir de ARN viral se sintetiza el ADNc que posteriormente será sometido a una PCR 
convencional para lograr su amplificación. Para sintetizar el ADNc, se requerirá: el ARN molde, 
una ADN polimerasa ARN dependiente, buffer de reacción, dNTPs y primers a partir de los cuales 
la polimerasa pueda realizar la extensión del ADNc. Estos primers pueden ser específicamente 
diseñados para hibridar a un gen particular o pueden unir a todos los ARNm (Oligo dT). Otras 
opción es utilizar primers que hibriden con varios sectores del ARN molde, generando así 
fragmentos copias de la población completa de moléculas de ARN (Ramdom primers). 
En el presente trabajo práctico se llevará a cabo una reacción de RT-PCR con el objetivo de 
amplificar el gen que codifica la proteína no estructural NS5 de flavivirus. 
 
Objetivos 
- Entender los fundamentos de la retrotranscripción y la amplificación “in vitro”, a través del 
manejo manual de las mismas. 
 
 
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- Comprender la importancia de contar con métodos específicos, sensibles y rápidos en la detección 
de ácidos nucleicos virales. 
- Aplicar técnicas de biología molecular para amplificar un fragmento de ARN viral de flavivirus, 
como modelo de método de diagnóstico rápido. 
 
Materiales 
 Tubos Eppendorf de 200 y 500 μL estériles. 
 Micropipetas y puntas de micropipetas estériles. 
 ARN. 
 Retrotanscriptasa: M-MuLV RT 200 U/µl 
 Buffer de RT 5X 
 Inhibidor de RNAsas 20 U/µl 
 Hexanucleotidos ramdom 0,06 µg/ml 
 Taq polimerasa. 
 Buffer de reacción de PCR 10X. 
 MgCl 50mM. 
 dNTPS 10mM. 
 Oligonucleótidos 10μM: 
Flavi 1 (Foward) 5’ AATGTACGCTGATGACACAGCTGGCTGGGACAC 3’ 
Flavi 2 (Reverse) 5’ TCCAGACCTTCAGCATGTCTTCTGTTGTCATCCA 3’ 
 Agua ultrapura estéril. 
 Termociclador. 
 Cuba de electroforesis para geles de agarosa. 
 Transiluminador. 
 Buffer TAE. 
 
Métodos 
Se utilizará el ARN extraído de dos muestras de suero (VER PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN 
EN EL ANEXO 1). Se efectuará una retrotranscripción y posterior amplificación utilizando para tal 
fin primers genéricos que permiten la detección del gen que codifica para la proteína no estructural 
NS5 de flavivirus. En paralelo, se realizarán un control negativo al que no se le agregará ARN y un 
control positivo, en dónde se utilizará ARN del virus de la fiebre amarilla. 
 
Retrotranscripción 
Video explicativo: Retrotranscripción https://youtu.be/YIpygsHrf20 
Colocar en un tubo estéril de 200 μl: 
-2,5 μl de ARN 
-0,5 μl de Random-Primers 0,06 µg/ml 
-2,5 μl de H2O mq estéril 
Incubar 65° C durante 5 min, enfriar sobre hielo, centrifugar brevemente y ubicar en hielo. 
 
 
 
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Agregar los siguientes componentes en el orden indicado: 
-2,0 μl de Buffer 5X 
-2,0 μl de DTT 0,1M 
-0,5 μl de Inhibidor de RNAsa 20 U/µl 
-1,0 μl de dNTPs 10 mM 
-1,0 μl M-MuLV RT 200 U/µl 
Volumen Final de reacción: 12 μl 
INCUBAR: 25°C – 10 min // 37°C – 60 min // 70°C – 10 min // 4°C - ∞ 
 
PCR 
Video explicativo: PCR https://youtu.be/q7j4OLJiC9s 
Preparación de la Master Mix 
Componentes 
 
Concentración 
inicial (stock) 
Cantidad de μl 
por tubo 
 
Buffer 10X 2,5 
MgCl2 25mM 1,5 
dNTPs 10mM 0,5 
“Primer Foward” 10μM 1 
“Primer Reverse” 10μM 1 
Taq Polimerasa 5U/μL 0,15 
Agua estéril c.s.p 50 μL 15,85 
ADN Stock 2,5 
Volumen Final de reacción: 25 μl 
 
El ciclado se realizará según se indica a continuación: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Etapa Tiempo Temperatura 
Hold inicial 2 minutos 94°C 
Desnaturalización 1 minuto 94°C 
Hibridación 1 minuto 58°C 
Extensión 1,5 minuto 72°C 
Extensión final 10 minutos 72°C 
 
45 ciclos 
 
 
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Video explicativo: Gel de agarosa https://youtu.be/ZlAgLTl4Bq0 
 
Posteriormente, los productos de PCR serán resueltos en un gel de agarosa al 2% utilizando como 
colorante SYBR Safe (agente intercalante en moléculas de ADN, más sensible y seguro que el 
bromuro de etidio). Las muestras se sembrarán utilizando buffer de muestra conteniendo glicerol al 
30% y azul de bromofenol. El buffer utilizado para la corrida electroforética es el TAE 1X. Los 
geles se revelarán al exponerlos en un transiluminador. 
 
 
 
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Guía para la elaboración del informe 
1)- 
a. Con ayuda de la hoja de información del Set de dNTPs (imagen siguiente), indicar los 
volúmenes de cada dNTP y de agua necesarios para obtener una solución stock de concentración 10 
mM, y un volumen final de 100 μL. 
 
 
 
 
 
 
 
b. Previamente a la realización de la PCR, se deben resuspender además, los primers liofilizados 
para preparar la solución de trabajo que será utilizada en la reacción de amplificación. A modo de 
práctica, consulten la hoja de información que acompaña los primers (se transcribe a continuación), 
y calcule qué volumen se debe añadir al liofilizado para obtener una concentración de 100 μM? 
 
 
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c. Determinar la concentración final de cada componente en las mezclas de reacción para la 
retrotranscripción y la PCR. 
 d. Determinar los volúmenes de cada componente necesarios para la preparación de la Master 
Mix, teniendo en cuenta para ello la cantidad de reacciones de PCR que realizará cada comisión de 
trabajo. 
 
2)- Dada parte de la secuencia del genoma del virus de la Fiebre Amarilla, determinar donde 
hibridarán los cebadores Flavi 1 y 2. 
 
5’GCCCTGGGATTCCTGAATGAGGACCATTGGGCTTCCAGGGAAAACTCAGGAGGAGGAGTGGAAGGCAT
TGGCTTACAATACCTAGGATATGTGATCAGAGACCTGGCTGCAATGGATGGTGGTGGATTCTACGCGGAT
GACACCGCTGGATGGGACACGCGCATCACAGAGGCAGACCTTGATGATGAACAGGAGATCTTGAACTAC
ATGAGCCCACATCACAAAAAACTGGCACAAGCAGTGATGGAAATGACATACAAGAACAAAGTGGTGAAAGTGTTGAGACCAGCCCCAGGAGGGAAAGCCTACATGGATGTCATAAGTCGACGAGACCAGAGAGGATCC
GGGCAGGTAGTGACTTATGCTCTGAACACCATCACCAACTTGAAAGTCCAATTGATCAGAATGGCAGAAG
CAGAGATGGTGATACATCACCAACATGTTCAAGATTGTGATGAATCAGTTCTGACCAGGCTGGAGGCATG
GCTCACTGAGCACGGATGTGACAGACTGAAGAGGATGGCGGTGAGTGGAGACGACTGTGTGGTCCGGCC
CATCGATGACAGGTTCGGCCTGGCCCTGTCCCATCTCAACGCCATGTCCAAGGTTAGAAAGGACATATCT
GAATGGCAGCCATCAAAAGGGTGGAATGATTGGGAGAATGTGCCCTTCTGTTCCCACCACTTCCATGAAC
TACAGCTGAAGGATGGCAGGAGGATTGTGGTGCCTTGCCGAGAACAGGACGAGCTCATTGGGAGAGGAA
GGGTGTCTCCAGGAAACGGCTGGATGATCAAGGAAACAGCTTGCCTCAGCAAAGCCTATGCCAACATGTG
GTCACTGATGTATTTTCACAAAAGGGACATGAGGCTACTGTCATTGGCTGTTTCCTCAGCTGTTCCCACCT
CATGGGTTCCACAAGGACGCACAACATGGTCGATTCATGGGAAAGGGGAGTGGATGACCACGGAAGACA
TGCTTGAGGTGTGGAACAGAGTATGGATAACCAACAACCCACACATGCAGGACAAGACAATGGTGAA 3’ 
 
3)- Calcular el tamaño de fragmento que será amplificado. 
4)- Análisis del gel de agarosa: 
 
 
 
 
 
Primer Flavi 1 (Foward) 
5’ AATGTACGCTGATGACACAGCTGGCTGGGACAC 3’ 
10,6 OD Tm: 80,8°C 
335,4 µg 31,8 µg/OD 
32,9 nmol MW: 10188 
 
Primer Flavi 2 (Reverse) 
5’ TCCAGACCTTCAGCATGTCTTCTGTTGTCATCCA 3’ 
13,9 OD Tm: 79,3 °C 
466,2 µg 33,4 µg/OD 
45,2 nmol MW: 10295 
 
 
 
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a. ¿Hay amplificación en las muestras? 
b. ¿Existen fragmentos inespecíficos? ¿Por qué? Si existieran, ¿cómo resolvería este 
inconveniente? 
c. ¿A qué pueden atribuirse las bandas que se observan más abajo en todas las calles del gel? 
5)-Luego de una RT-PCR, en el caso de no observar productos de amplificación. ¿Cuáles pueden ser 
las causas? Indique por lo menos cuatro de ellas. 
 
 
 
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Anexo 1 
 
Extracción de ARN utilizando el reactivo comercial TRIZOL® (Invitrogen BRL Cat#15596-
026 x 100 ml) 
 
Video explicativo: Extracción de RNA https://youtu.be/s_szOjCQUV4 
 
1. Rotular un microtubo de 1.5 ml. 
2. Bajo campana de PCR, colocar 1 µl de glicógeno. 
3. En área de extracción, agregar en cada tubo con glicógeno 750 µl de Trizol® 
4. Añadir 250 µl de suero. 
5. Homogeneizar con vortex. 
6. Incubar 10 min a temperatura ambiente. 
7. Agregar 200 µl de cloroformo. 
8. Homogeneizar con vortex. 
9. Dejar reposar 10 min a temperatura ambiente. 
10. Centrifugar 10 min a 14.000 RPM a 4ºC. 
11. En un nuevo tubo colocar 600 µl de isopropanol. 
12. Separar la fase acuosa (aprox. 500 µl) cuidando de no llegar a la inferfase y agregarla a los 
tubos con isopropanol. Mezclar. 
13. Incubar 24 hs a -20°C. 
14. Centrifugar 20 min a 14.000 RPM a 4ºC. 
15. Descartar el isopropanol cuidando de no perder el pellet (no se ve todavía). 
16. Agregar 1000 µl de etanol 75% para lavar el pellet del exceso de sales. Conservar a -20°C, 
si no se realizará ese mismo día la RT-PCR 
17. Centrifugar 15 min a 14.000 RPM a 4ºC. 
18. Descartar el alcohol con cuidado de no perder el pellet (se ve a simple vista), no agitar el 
tubo. Cuidar que no queden restos de alcohol, porque inhibe la PCR. 
19. Dejar secar el pellet a Tº ambiente o a 37ºC en bloque térmico. Evitar el resecamiento del 
pellet, ya que dificulta la solubilización posterior del RNA. 
20. Resuspender el pellet en un volumen adecuado (20 µl) de agua libre de ARNasas a 37°C. 
21. Continuar con la RT-PCR o conservar a -80°C. EL RNA en agua que se conserve distribuirlo 
en dos o tres microtubos. Marcar aquellos tubos que se descongelen y vuelvan a congelar.