metodologia IV

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MTODOS DE DETECCION, CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE AG VIRALES Y AC ESPECIFICOS
metodologia iv 			son técnicas que provienen de la inmunologia y la biologia molecular.
Los viriones son macromoleculas complejas, y son antígenos complejos, de mayor o menor complejidaddependendo de la complejidad estructural del virion.
Estos viriones compuestos de proteínas, glicoprot, ac nucleicos. También contienen ag con sus propios epitopes. Por otro lado, cuando un virus infecta una cel en su ciclo de repli se generan prot virales, algunas de las vuales vann a formar parte de la estructuras del virion, otras se sintetizan durante el ciclo, cumplen alguunas funciones, pero no se incorporan en la est del virin. Todas estas prot est y funcionales uqe se producen durante la repli, también son ag y por lo tanto su caracterizacion, deteccion, cuantificacion podemos utooilizar técnicas inmunoqca y moleculares. En relaciona los AC cuando un virus infecta un mammifero, se genera una rta inmune que involucra entre otros componentes, la prod de AC especificos dirifgidos contra epitopes localizados dirigidos hacia epitopes virales de los Ag virales.Ag estructurales y los correspondientes a polipep virales funcionales. La deteccion y caracterizacion de Ac tamiben resulta util para caracterizar las inf virales. Nosotros podemos estudiar, diagnosticar una inf viral mediante la caracterizacion de la respuesta del hospedero a la infeccion viral. Estas técnicas nos permite caracterizar ac antivirales y la respuesta vinculada a la generacion de esos Ac.
Algunas tencnicas inmunoquimicas e inmunologicas utilizadas en virologia
	Fijacion del complemento
	Aglutiacion de partículas
	Inhibicion de la hemoaglutinacion.
Limitadas a viriones con la capacidad de lisar GR. ej el virus influenza 
	Inmunofluorescencia- Inmunoperoxidasa
muy utiles en el diag de inf virales respiratorio.
	ELISA-CLIA
	Western blot
	Citometria de flujo
	ELISPOT
Muy utilizada en la caracterizacion de la resp inmune cel, ya que permite detectar en cel aislada la capacidad de prod ac o citoquinas, en resp a la induccion de ag virales. Muy util para caract y cuantificar las cespuesta cel
	NEUTRALICACION DE INFECTIVIDAD
Se trata de una tecica que esta en la interface entre la biologia e inmunologia. Podeos decir qu ee s una tecnica desarrollada en el campo de la biologia. Se basa ; cuando un virion se pone en contacto con un suero que contiene ac dirigidos contra ag presentes en ese virion, algunos de esos ac pueden reconocer epitopes localizados en ag que estan vinculados a la capacidad del virion de infectar una cel. Cuando estos ac son capaces de inhibir la cap del virion de infectar una cel, se dice que son ac neutralizantes. En resp a una infeccion viral, un hospedero infectado genera una gran variedad de ac dirigidos contra dtos ag virales en la variedad de ag qu mencionamos. De todas esas variedad de ac solo una fraccion de ac tienen la cap de ejercer este efecto neutralizantes, a estos se los llaa especificamente ac neutralizante. La caracterizacion, identificacion cuantificacion es sumamente importante en varios campos de la virologia, por ejemplo en el desarrollo y evaluacion de vacunas formuladas para la prevencion de infecciones y enf virales.
Como se mide la eficacia de una vacuna, se mide en funcion de la capacidad de prevenir la infeccion o enf viral en la persona vacunada. Esta capacidad de proteger a la persona va a depender de la presencia de ac neutralizante, de tal manera que la medicion de ac neutral en respuesta a la inoculacion de una vacuna, es una medida del valor de la eficacia de esa vacuna.
Otra aplicación de la medicion de la respuesta de ac neutral radica en la selección de lotes de plasma de convalecientes utilizables para la terapeutica de infecciones en otros hospederos.. 
Pongamos en caso de las personas que padecen covid, una persona infectada con sarcov-2 genera ac que uno los enccuentra en el plasma, una persona convalecieente puede donar plasma, y este ser utilizados para tratar a otra persona enferma que esta cursando aun la enf, de tal manera que los ac del donante cuando son suministrado a la persona enferma, contribuyen a la curacion a través de la neutralizacion del virus circulante en la persona enferma y esta neutralizacion va a depender de la preesencia de ac neutral en el plasma del donante. Es decir en todos los lotes de plasmas convalecientes que se donana como terapeutica de covid, deben ser valorados en su cap de neutral. Por eso es una tecnica muy valiosa y con numerosas aplicacines.
La neutaralizacion propiamente dicha, se lleva a cabo cuando mezclamos una solución que contiene ac por j un suero con un coloide, una sol coloidal que contiene virus. Si la sol de ac contiene ac neutralizantes para ese virus, se va a producir cunado lo mezclamos la interaccion ag-ac que va a neutralizar, si a continuacion utilizamos esa mezcla para inocular un sist suceptible a la infeccion con el virus, y genere una respuesta que pueda visualizar, vamos apoder verificar en ese sist de deteccion, si los ac fueron capaces de neutralizar al virus. De que manera, si el sist de deteccion me revela que hay virus de infeccion, implica que quedo virus sin neutralizar y por lo tanto o bien no habia ac neutralizante o la conc no era suficientemente alta como para neutralizar el virus presente en la mezcla. Entonces la obs de efectos citopaticos, me esta mostrando que no hubo neutralizacion. Por otro lada, si yo no observo efectos citopaticos, eso implica que no quedo virus caaz de infectar nuestro sist de deteccion, si no observo signo de infeccion, implica que no quedo virus libre y que este fue neutralizado, y que habia ac capaces de dneutralizar ese virus. Osea que la falta de manifestaciones de la infeccion, me demuestra uqe hubo neutralizacion. Yo puedo utilizar como sist de deteccion un cultivo celular, y el efecto que voy a obs es el efecto citopatico, lisis celular, redondeamiento cel, desprendimiento de las cel de la monocapa, formación de sincicios, aparicion d cuerpos de inclusion. 
O eventualmente puedo utilizar como sist de deteccion animales de experimentacion, y si este muere implica que no hubo neutralizacion y si sobrevive implica que el virus fue neutralizado porque habia ac neutralizantes.
Uno la puedee utilizar ya sea para detectar o cuantificar virus o anticuerpos. Y en este sentido en priimer lugar uno la puede utilizar para identificar virus desconocidos. 
Si yo tengo una muestra clinica tomada de un pte que sospecho que esta infectado con un det virus, y yo poseeo un antisuero con ac neutralizantes contra ese virus que en principio, sospecho que esta presente en la muestra clinica, yo puedo plantear una reaccion de neutralizacion y si hay neutralizacion yo puedo verificar ese virus porque reacciono con mi ac que este caso son mis reactivos.
Por el contrario, puedo utilizar la misma tecnica pero formulada alrevez para detectar y cuantificar Ac, si mi incognita es saber si en el suero esta presente el ac contra un determinado virus, y yo tengo el virus como reactivo puedo plantear una reaccion de neutralizacion, y si luego dee revelar la reaccion, yo observo signos de infeccion, va a implicar que el virus reativo no fue neutralizado y x lo tanto en ese suero no habia ac especifico al virus, y si el suero contenia ac y esos ac neutralizarron todo el virus que agregue como reactivo, no va a quedar virus libre y no va a haber efecto como consecuencia de la infeccion, esto implica que la muestra contenia ac.
La tercer apllicacion es cuando uno quiere comparar dos virus ddiferentes. Supongamos que aislamos de dos ptes diferentes dos virus, osea dos aislamiento virales diferentes y queremos identificar cuan emparentado estan esos aislamientos entre si, desde el puntode vista antigenico, podemos generar antisuero especifico dirigido contra cada uno de esos virus y luego hacer reacciones cruzadas; el virus a con el antisuero B y el virus B con el antisuero A, y si hay reacciones de neutralizacion, eso implica queel aislamiento a y b estan emparentado entre si.
Desde el punto de vista de la tecnica, hay dos variantes.
La mas utilizada es la del virus ctes y suero variable. En este formato nosotros tenemos en una cantidad de tubos, dosis ctes y conocida de virus, por ejemplo 100 microlitros de stock viral en cada tubo, y luego inoculamos cada tubo que contienen la missma cant de virus, con una dilucion seriada de un suero incognita, un suero en el cual quremos valorar su titulo de ac neutralizante, entonces, luego de que todos los tubos estan iinoculados con un identico vol de diluciones seriadas de suero que quiero valorar y uincubo para que se produsca la interaccion ag ac y luego revelo en mi sist de deteccion, cultivos celulares o animales de experimentacion. Y luego verifiico si hay neutralixzaciony cual es la dil de suero que tiene capacidad neutralizante. Por convension se establecce que la ultima dil del suero que tiene ac neutralizante, la inversa de esa dil es el titulo de ac neutralizante de ese suero.
La otra variante menos utilizada y mas compleja es la de suero cte y virus variable. Aca se enfentan una cant cte de sueros con dil seriadas de virus; eso se deja reaccionar parra que se prod la neutralizacion y luego el virus remanente de cada reaccion va a ser titulado y se va a titular en precensia de un suero control no inmune, y por otro lado en precensia de un suero especifico para ese virus, se calcula la dif entre estoos dos titulos, y la dif espresada como el log decimal, se lo denomina indice de neutralizacion generalmente es utilizado para caracterizar virus desconocidos..
Equema de reacc de neutralizacion.
Si en el suero hay ac estos vana reaccionar con el virus (para que aya reeaccion el ac tiene que ser neutralizantes, no cualquierac, y lo van a neutralizar.
Si por el contrario, en el suero no hay ac neutralizantes, estos no van a neutralizar al virus, y si agregamos esta mezcla sobre nuestro sist de deteccion que en este caso es un cultivo celular, en el caso que haya neutralizacion, en la parte inferior, las cel no van a ser infectada, porque el virus ha perdido la habilidad de infectar la cel y no va a haber efecto citopatico indicando una neutralizacion positiva. Y viceversa en la parte superior.
En esta diapo podemos apreciar como se lleva a cabo concretamente una reaccion de neutralizacion, aca se hace la dilucion del suero (placa multi) que se va a valorar, siempre tiene que haber un control y replicas, y luego se enfrentan estas dtas dil de suero frente a una cant cte de virus, al cabo de un tiempo se hace la incuvacion, esto se inocula en un cultivo celular, y se verifica en que posillos hay efecto citopatico y en cuales no, a medida que aumenta la dil, aumenta la probabilidad que no haya efecto citopatico. A medida que aumenta la dil aumenta la probabilidad que quede virus libre y de que haya efeecto citopatico. La ultima dil que inhibe el efecto citopatico s tomara como la inversa del titulo viral. Esta tecnica de neutralizacion es muy importante en virologia y tiene numerosas aplicaciones.
MÉTODOS DE DETECCION,CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES
los viriones contienen ac nucleico, su genoma y las células infectadas también contienen ac nucleicos virales, no solo los ac nucleicos virales identicos a los genomas parentales, sino tambin aquellos ac nucleicos que se generan de manera transitoria durante la repli viral. Osea que en un cel infectada no solo vamosa detectar ac nucleicos identocos al genoma parental, sino que también otros que se generan de manera transitoria en la replicacion del ac nucleico viral.
Vamos a recordar que los genomas virales, los ácidos nucleicos pueden ser de DNA o RNA de doble o simple cadena, circular o lineal. Y los rna puden ser doble o simple cadena, y son todos lineales, no hay genoma de rna circulares, y los genomas de rna de simple cadena puedeen ser entreros o fragmentados, mientras que los de doble cadena son todos fragmentados.
La individualidad de un virus viene dada fundamentalmente por la secuencia de bases de su genoma, es decir, nosotros podemos identificar un virus si carcterizamos la sec de bases de su genoma. Esta sec de bases esta dada por la repeticio secuencial, en el caso de dna de cuatro bases nitrogenadas (citocina, guanina adenina y timina) y en el caso del rna también (citocina, guanina, adenina y uracilo).
Estas bases nitrogenadas, se reconocen mutuamente entre si a través de la formación de reacciones del tipo pte de hidrogeno que vinculan a una guanina con una citocina y a una adenida con una timina. De tal manera que cuando tenemos una det secuencia del nuceotido que esta formada por una sucesion de bases nitrogenadas, esa secuencia podra sr reconocida especificamente por una secuencia de bases que se complementen con la secuencia blanco, es decir que donde hay una citocina, le ofrescan de manera compleentaria una guanina, donde haya un T una A, y asi sucesivamente
la reaccion que se lleva a cabo entre dos sec que son complementaria de esta forma se llama reaccion de hibridacion, esta reaccion dependen de la complementariedad de la sec de bases entre dos cadenas de ac nucleicos. Si se trata de dos cadenas de DNA monocatenario, sera una hibridacion homogenea, si se trata de una cadena de DNA y una dde RNA, se tratara de una hibridacion heterogenea, pero en ambos casos, esa hibridacion se tiene que producir por apareamiento especifico de bases. Esta hibridacion es el fundamento de todas las técnicas de biologia molecular e ing genetica que utilizamos con el propocito de detectar, caract o cuantificar acc nucleicos virales o virus, a través de la deteccion, caract o cuantificacion de sus ac nucleicos.
En esta diappo tenemos una mla de dna donde se estan apareando por complementariedad especifica entre las bases, dos cadenas complementarias; estas cadenas complementarias estan muy fuertemente unidas debido a la cant de ptes de H que se gneran cuando ambas son perfectamente complementarias, y para separarlas hay que aplicar una gran cant de energia. Esa energia se suministra por calentamiento, este permite romper los ptes de hidrogenos y separar las cadenas, si yo enfrio estas dos cadenas, se dice que se renaturalizan, lo mismo sucede con el RNA, yo puedo generar hibridos de DNA-Rna siempre y cuando, ambas sean complementarias entre si. Osea que hay hibridacion entre cadenas de dna y también hibridacion de RNA con DNA.
 Hibridacion de ac nucleicos: Parametros que afectan la vel y fidelidad de lla reaccion *Soncentracion de sales * Solventes * Temperatura * Complejidad del Ac nucleico * Concentracion de la soda * Condiciones de exigencia de lavado 
→ Tecnicas de deteccion e identificacion de ac nucleicos por hibridacion:
	Hibridacion en fase liquida.
	Hibridacion en fase solida.
	Dot-hibridacion
son manchas, se siembra una muestra incognita conteniendo el ac nucleico incog y se agrega una zonda conteniendo una sec conocida y complementaria de aquella sc que deseo detectar en la muestra sembrada en el dot, y si la zonda cuya sec es complementaria a la sec blanco se hibrido y no es desprendida por los lavados, luego se va a revelar con una rx colorimetrica, gralmente esa zonda tiene un reactivo revelable que puede generar un color o fluoresceencia, o una enzima o un radiactivo
	Southern-blot
es mas compleja xq implica una sucesion de separacion en un gel de agarosa, luego la transf a una membrana y finalmente una rx de hibridacion.
	Northern-blot
es analoga a la anterior, y se utiliza para la deteccion de sec de DNA, la analoga para rna northen ?que también implica la separacion electroforetica, la transf a un soporte solido, y luego el revelado para una zonda especifica. 
	Hibridacion “in situ”
El soporte dodne se va a realizar la hibridacion es un tejido por ejemplo tomado de una biopsia, ese tejido tiene que ser desnaturalizado para exponer el ac nucleico y dejarlo libre y desnaturalizado para reaccionar con una zonda que se agrega directamente sobre el tejido desnaturalizado,y luego se revela de manera similar con la ventajaque yo puedo reconocer en casos de infecciones virales cual es la fraccion de un tejido que esta infectado y cuales son las fracciones que no estan infectadas.
PCR, tecnica de reaccion de polimerasa en cadena, que es una tec de amplificacion de blancos, es decir, amplifica aquella sec de ac nucleicos que yo deseo detectar o que deseo cuantificar. Pero las técnicas de amplificacion de blanco no son las unicas, hay técnicas que amplifican la señal de la reaccion en vez del blanco. La mas utilizadas son las b-dna; que es una tecnica facilmente estandarizable que tiene la ventaja que se realiza bajo condiciones isotermicas y que también se puede hacer cuantitativa y permite hacer estimaciones de carga viral en muestras clinicas.
También hay técnicas basadas en la amplificacion de la zonda que uno utiliza para detectar la sec blanco. Como la tecnica LCR (reaccion en cadena de la ligasa), tecnicamente sz muy parecida a la pcr, con la dif que no se amplifica la sec blanco, sino que se amplifica la zonda que detecta la sec blanco, y por lo tanto esta puede ser mas expecifica que la pcr.
En grla estas técnicas son hoy muuy utilizadas en la virologia con dif propocitos, pero se ahn expandido muchisimo en el area de diagnostico virologico, asi como se han expandido ene l resto de la virologia, pero particularmente en la virologia ha encontrado una cant importante de aplicaciones.
Este es un esquema de como se lleva a cavo una rx de b-dna en este caso para detectar y cuantificar una mla dee rna viral, puede ser el rna de un virus como el hiv o como el sars-cov2.
Por ejemplo las técnicas utilizadas para la cuantificacion de carga viral en pte infectados con hiv o hepatitis c tienen este formato. Fijensen que una vez que eel rnaviral, el traget ah sido liberado, se lo hace rx con una mezcla de zondas, una zonda de captura que retiene a la sec blanco, al ac nucleico blanco sobre una superficie solida, por ejempolo en este caso la sup de un posillo de una placa de 96 posillos. Esa zonda de captura, no rx directamente con la sec blanco, sino que reacciona con un segundo target, con una segunda sonda que tiene dos brazos, uno que reconoce a la zonda de captura y otro que reconoce a la sec blanco sobre la molécula de rna blanco. Esto retiene al rna blanco luego de los lavados en el pocillo, lo retiene en la fase solida, y luego esto se hace rx con una sonda de preamplificacion que rx con el rna blanco pero en una secuencia de bases diferentes a la que reconocian las sondas dee captura inicial. Esa sonda de preamplificacion también tiene dos brasos, con uno reconoce una secuencia blanco en el rna blanco y con el segundo braso (el que no queda ligado al rna blanco) va a reconocer a una cuarta sonda que se llama amplificadora, esta sonda amplificadora se va a ligar al segundo braso de la sonda preamplificadora y esta sonda amplificadora se caracteriza porque tiene brasos que son especies de sondas, y cada uno de estos tienen multiples arcadores, cuya presencia puede ser reveladada mediante una rx color o fluorimetrica. De tal manera que cuando se agrega el marcador de revelado se va a generar una señal colorimetrica o fluorescente cuya magnitud va a ser proporcional frente a una curva de calibrado a la concentración de rna viral presente en la muestra, de tal manera, esta rx se puede realizar de manera cuantitativa.
La PCR es una rx que amplifica blancos, para esta es necesario tener como sustrato inicial para la rx un dna doble cadena que va a actuar como blanco, aca esta contenida la secuencia que yo deseo amplificar, ese dna blanco debe desnaturalizarce para separar ambas cadenas, y luego hacese reaccionar esa mezcla desnat con un par de sondas que vana reconocer secuencias sobre ambas cadenas de la doble hebra desnaturalizada, estos primers se diseñan especificamente para delimitar la zona de la secuncia que yo tengo interés de amplificar. Estos bajo condiciones de determianda temperatura (la desnat se hace a altas temp), luego la tem se reduce para que las sondas reconoscan y se hibriden sobre las sec que reconocen sobre la mla blanco, y luego que se ha producido ese reconocimiento va a intervenir una dna pol que en presencia de oxinucleotidos, va a proceder a la extencion de los primers, siempre en sentido 5’ → 3’ de tal manera, que cada una de las cadenas al cabo de esta extencion va a haber duplicado su cant original. Originalmente teniamos una sec blanco que luego de la desnaturalizacion dio las dos cadenas separadas, y al cabo del primer ciclo vamos a tener dos moleculas de dna de doble cadena que cuando se vuelvan a desnat me van a generar dos simples cadenas de cada una de las sec complementarias. Entonces como se produce la duplicacion de la sec blanco luego de cada ciclo, si nosotros repetimos esta rx muchas veces, y en cada seclo se duplica la cant de secuencias a amplificar, al cao de 25-30 ciclos ya voy a tener miles de copias que se han generados, y voy a estar en condiciones de detectar facilmente esa secuencia amplificada mediante una electroforesiss en gel de agarosa por ej.
La especificidad de la amplific depende de cuan especifica sea la rx de la sondas con las se ca a amplificar.
Aca ttenemos representada la amplificacion del tipo exponencial que se da. 
Supongamos que arranco de una sola mla blanco, al cabo del primer ciclo ya tengo dos, en el sig 4 , 8, 16 y asi progresivamente. 
Hay variantes de la PCR adaptadass para propositos diferentes, a la simple amplificacion de molas de dna.
Por ejemplo la reaccion de RT-PCR, permite amplificar RNA, antes de entrar a la tecnica de PCR se hace una retrottranscrippcion, hay que transformar ese RNA en una mla de dna doblecadena, la cual se va a amplificar luego por una pcr común.
Nestet PCR o PCR anidada, se hacen dos PCR en serie, utilizando dos primers dif en la primer reaccion, por ejemplo se utilizan un par de primers y se hace una amplificacion de por ej 20 ciclos, y en la segunda PCR en lugar de utilizar los mismos primer, se van a utilizar otros primers que van a hibridar en sonas internas a la secuencia anterior, de manera que se va a amplificar una region mas corta. Esta segunda PCR le da a la rx una especificidad mayor que la que suministra una PCR común. 
Multiplex PCR: no se utiliza un unico par d primers, sino varios, dos o mas que van a reconocer blanco dif en una misma reaccion, de tal manera que en una unica corrida yo voy a detectaar varios target al mismo tiempo. Supongamos que tenemos una infeccion respiratoria, que puede ser prod por dif agts virales, también por bacterias u hongos, y yo quiero descartar de que se trate de una infeccion viral, entonces, lo que puedo hacer es diseñar una multiplex PCR e introdusco pares de sondas que me permitan amplificar RNAs de todos aquellos virus que sopecho que pueden estar actuando como agtes etiologicos de aquella infeccion, y de esa manera amplifico todos al mismo tiempo y ahorro tiempo para hacer el descarte de la infeccion viral
Ral Time PCR: PCR en tiempo real o cuantitativa que permite llevar a cabo esta rx de manera que nos permita valorar cuantittivamente la cantidad de DNAs o RNAs si esta combinada con una transc reversa previa presente en una muestra, y se llama real time porque uno puede seguir la amplificacion que se produce en tiempo real, porque en esta x a medida que se va amplificando el blanco, se va generando fluorescencia que uno puede ir midiendo de manera continua y que me permite obtener un resultado cuantitativo.
Secuenciamiento de Ac nucleicos
La identidad ultima de un det virus, esta determinada por la sec de nucleotidos de su genoma, y esta identidad, entonces no puede ser especificada de manera mas exaustiva que a través de a determinacion de la secuencia de nucleotidos de su genoma. Las posibilidades para hacer secuenciamiento de ac nucleicos, basicamente se localizan en 3 alternativas tecnologicas.
	Metodo químico de Maxam y Gilbert.
	Metodo del dideoxinucleotido de Sanger.
	Tecnicas de alto rendimiento:NGS (“Nex Generation Sequencing”) (actuales)
Permiten secuenciar rapidamente y con una infraestructura mucho mas sensilla que las utilizadas. Permite secuenciar rapidamente gran cantidad de genoma. Por ejemplo, podemos mencionar que entre marzo y agosto del 2020 se han podido secuenciar los genomas de mas de 400 aislamientos de virus sarscov 2 efectuado en la argentina. Esto es algo que hace pocos años atrás era impensable, y hoy esta practicamente al alcanze de muchos labs, directamente porque poseen los equipamientos o porque tienen acceso a estas técnicas por servicion con costos altamente factibles.
A continuacion pego unas diapos que cambiaron los HDP
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