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MTODOS DE DETECCION, CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE AG VIRALES Y AC ESPECIFICOS
metodologia iv son técnicas que provienen de la inmunologia y la biologia molecular.
Los viriones son macromoleculas complejas, y son antígenos complejos, de mayor o menor complejidaddependendo
de la complejidad estructural del virion.
Estos viriones compuestos de proteínas, glicoprot, ac nucleicos. También contienen ag con sus propios epitopes. Por
otro lado, cuando un virus infecta una cel en su ciclo de repli se generan prot virales, algunas de las vuales vann a
formar parte de la estructuras del virion, otras se sintetizan durante el ciclo, cumplen alguunas funciones, pero no se
incorporan en la est del virin. Todas estas prot est y funcionales uqe se producen durante la repli, también son ag y
por lo tanto su caracterizacion, deteccion, cuantificacion podemos utooilizar técnicas inmunoqca y moleculares. En
relaciona los AC cuando un virus infecta un mammifero, se genera una rta inmune que involucra entre otros
componentes, la prod de AC especificos dirifgidos contra epitopes localizados dirigidos hacia epitopes virales de los
Ag virales.Ag estructurales y los correspondientes a polipep virales funcionales. La deteccion y caracterizacion de Ac
tamiben resulta util para caracterizar las inf virales. Nosotros podemos estudiar, diagnosticar una inf viral mediante la
caracterizacion de la respuesta del hospedero a la infeccion viral. Estas técnicas nos permite caracterizar ac antivirales
y la respuesta vinculada a la generacion de esos Ac.
Algunas tencnicas inmunoquimicas e inmunologicas utilizadas en virologia
• Fijacion del complemento
• Aglutiacion de partículas
• Inhibicion de la hemoaglutinacion.
Limitadas a viriones con la capacidad de lisar GR. ej el virus influenza 
• Inmunofluorescencia- Inmunoperoxidasa
muy utiles en el diag de inf virales respiratorio.
• ELISA-CLIA
• Western blot
• Citometria de flujo
• ELISPOT
Muy utilizada en la caracterizacion de la resp inmune cel, ya que permite detectar en cel aislada la capacidad
de prod ac o citoquinas, en resp a la induccion de ag virales. Muy util para caract y cuantificar las cespuesta
cel
• NEUTRALICACION DE INFECTIVIDAD
Se trata de una tecica que esta en la interface entre la biologia e inmunologia. Podeos decir qu ee s una
tecnica desarrollada en el campo de la biologia. Se basa ; cuando un virion se pone en contacto con un suero
que contiene ac dirigidos contra ag presentes en ese virion, algunos de esos ac pueden reconocer epitopes
localizados en ag que estan vinculados a la capacidad del virion de infectar una cel. Cuando estos ac son
capaces de inhibir la cap del virion de infectar una cel, se dice que son ac neutralizantes. En resp a una
infeccion viral, un hospedero infectado genera una gran variedad de ac dirigidos contra dtos ag virales en la
variedad de ag qu mencionamos. De todas esas variedad de ac solo una fraccion de ac tienen la cap de
ejercer este efecto neutralizantes, a estos se los llaa especificamente ac neutralizante. La caracterizacion,
identificacion cuantificacion es sumamente importante en varios campos de la virologia, por ejemplo en el
desarrollo y evaluacion de vacunas formuladas para la prevencion de infecciones y enf virales.
Como se mide la eficacia de una vacuna, se mide en funcion de la capacidad de prevenir la infeccion o enf
viral en la persona vacunada. Esta capacidad de proteger a la persona va a depender de la presencia de ac
neutralizante, de tal manera que la medicion de ac neutral en respuesta a la inoculacion de una vacuna, es
una medida del valor de la eficacia de esa vacuna.
Otra aplicación de la medicion de la respuesta de ac neutral radica en la selección de lotes de plasma de
convalecientes utilizables para la terapeutica de infecciones en otros hospederos.. 
Pongamos en caso de las personas que padecen covid, una persona infectada con sarcov-2 genera ac que uno
los enccuentra en el plasma, una persona convalecieente puede donar plasma, y este ser utilizados para
tratar a otra persona enferma que esta cursando aun la enf, de tal manera que los ac del donante cuando son
suministrado a la persona enferma, contribuyen a la curacion a través de la neutralizacion del virus circulante
en la persona enferma y esta neutralizacion va a depender de la preesencia de ac neutral en el plasma del
donante. Es decir en todos los lotes de plasmas convalecientes que se donana como terapeutica de covid,
deben ser valorados en su cap de neutral. Por eso es una tecnica muy valiosa y con numerosas aplicacines.
La neutaralizacion propiamente
dicha, se lleva a cabo cuando
mezclamos una solución que
contiene ac por j un suero con un
coloide, una sol coloidal que
contiene virus. Si la sol de ac
contiene ac neutralizantes para
ese virus, se va a producir cunado
lo mezclamos la interaccion ag-ac
que va a neutralizar, si a
continuacion utilizamos esa
mezcla para inocular un sist
suceptible a la infeccion con el
virus, y genere una respuesta que
pueda visualizar, vamos apoder
verificar en ese sist de deteccion,
si los ac fueron capaces de
neutralizar al virus. De que
manera, si el sist de deteccion me
revela que hay virus de infeccion,
implica que quedo virus sin neutralizar y por lo tanto o bien no habia ac neutralizante o la conc no era
suficientemente alta como para neutralizar el virus presente en la mezcla. Entonces la obs de efectos citopaticos, me
esta mostrando que no hubo neutralizacion. Por otro lada, si yo no observo efectos citopaticos, eso implica que no
quedo virus caaz de infectar nuestro sist de deteccion, si no observo signo de infeccion, implica que no quedo virus
libre y que este fue neutralizado, y que habia ac capaces de dneutralizar ese virus. Osea que la falta de
manifestaciones de la infeccion, me demuestra uqe hubo neutralizacion. Yo puedo utilizar como sist de deteccion un
cultivo celular, y el efecto que voy a obs es el efecto citopatico, lisis celular, redondeamiento cel, desprendimiento de
las cel de la monocapa, formación de sincicios, aparicion d cuerpos de inclusion. 
O eventualmente puedo utilizar como sist de deteccion animales de experimentacion, y si este muere implica que no
hubo neutralizacion y si sobrevive implica que el virus fue neutralizado porque habia ac neutralizantes.
Uno la puedee utilizar ya sea
para detectar o cuantificar
virus o anticuerpos. Y en este
sentido en priimer lugar uno la
puede utilizar para identificar
virus desconocidos. 
Si yo tengo una muestra clinica
tomada de un pte que
sospecho que esta infectado
con un det virus, y yo poseeo
un antisuero con ac
neutralizantes contra ese virus
que en principio, sospecho que
esta presente en la muestra
clinica, yo puedo plantear una
reaccion de neutralizacion y si
hay neutralizacion yo puedo
verificar ese virus porque reacciono con mi ac que este caso son mis reactivos.
Por el contrario, puedo utilizar la misma tecnica pero formulada alrevez para detectar y cuantificar Ac, si mi incognita
es saber si en el suero esta presente el ac contra un determinado virus, y yo tengo el virus como reactivo puedo
plantear una reaccion de neutralizacion, y si luego dee revelar la reaccion, yo observo signos de infeccion, va a
implicar que el virus reativo no fue neutralizado y x lo tanto en ese suero no habia ac especifico al virus, y si el suero
contenia ac y esos ac neutralizarron todo el virus que agregue como reactivo, no va a quedar virus libre y no va a
haber efecto como consecuencia de la infeccion, esto implica que la muestra contenia ac.
La tercer apllicacion es cuando uno quiere comparar dos virus ddiferentes. Supongamos que aislamos de dos ptes
diferentes dos virus, osea dos aislamiento virales diferentes y queremos identificar cuan emparentado estan esos
aislamientos entre si, desde el puntode vista antigenico, podemos generar antisuero especifico dirigido contra cada
uno de esosvirus y luego hacer reacciones cruzadas; el virus a con el antisuero B y el virus B con el antisuero A, y si
hay reacciones de neutralizacion, eso implica que el aislamiento a y b estan emparentado entre si.
Desde el punto de vista de la
tecnica, hay dos variantes.
La mas utilizada es la del virus ctes
y suero variable. En este formato
nosotros tenemos en una cantidad
de tubos, dosis ctes y conocida de
virus, por ejemplo 100 microlitros
de stock viral en cada tubo, y luego
inoculamos cada tubo que
contienen la missma cant de virus,
con una dilucion seriada de un
suero incognita, un suero en el cual
quremos valorar su titulo de ac
neutralizante, entonces, luego de
que todos los tubos estan
iinoculados con un identico vol de
diluciones seriadas de suero que
quiero valorar y uincubo para que
se produsca la interaccion ag ac y
luego revelo en mi sist de
deteccion, cultivos celulares o animales de experimentacion. Y luego verifiico si hay neutralixzaciony cual es la dil de
suero que tiene capacidad neutralizante. Por convension se establecce que la ultima dil del suero que tiene ac
neutralizante, la inversa de esa dil es el titulo de ac neutralizante de ese suero.
La otra variante menos utilizada y mas compleja es la de suero cte y virus variable. Aca se enfentan una cant cte de
sueros con dil seriadas de virus; eso se deja reaccionar parra que se prod la neutralizacion y luego el virus remanente
de cada reaccion va a ser titulado y se va a titular en precensia de un suero control no inmune, y por otro lado en
precensia de un suero especifico para ese virus, se calcula la dif entre estoos dos titulos, y la dif espresada como el
log decimal, se lo denomina indice de neutralizacion generalmente es utilizado para caracterizar virus desconocidos..
Equema de reacc de
neutralizacion.
Si en el suero hay ac estos vana
reaccionar con el virus (para que
aya reeaccion el ac tiene que ser
neutralizantes, no cualquierac, y lo
van a neutralizar.
Si por el contrario, en el suero no
hay ac neutralizantes, estos no van
a neutralizar al virus, y si
agregamos esta mezcla sobre
nuestro sist de deteccion que en
este caso es un cultivo celular, en
el caso que haya neutralizacion, en
la parte inferior, las cel no van a
ser infectada, porque el virus ha
perdido la habilidad de infectar la
cel y no va a haber efecto citopatico indicando una neutralizacion positiva. Y viceversa en la parte superior.
En esta diapo podemos apreciar como
se lleva a cabo concretamente una
reaccion de neutralizacion, aca se hace
la dilucion del suero (placa multi) que
se va a valorar, siempre tiene que
haber un control y replicas, y luego se
enfrentan estas dtas dil de suero frente
a una cant cte de virus, al cabo de un
tiempo se hace la incuvacion, esto se
inocula en un cultivo celular, y se
verifica en que posillos hay efecto
citopatico y en cuales no, a medida que
aumenta la dil, aumenta la
probabilidad que no haya efecto
citopatico. A medida que aumenta la
dil aumenta la probabilidad que quede
virus libre y de que haya efeecto
citopatico. La ultima dil que inhibe el
efecto citopatico s tomara como la
inversa del titulo viral. Esta tecnica de
neutralizacion es muy importante en
virologia y tiene numerosas
aplicaciones.
MÉTODOS DE DETECCION,CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES
los viriones contienen ac nucleico, su genoma y las células infectadas también contienen ac nucleicos virales, no solo
los ac nucleicos virales identicos a los genomas parentales, sino tambin aquellos ac nucleicos que se generan de
manera transitoria durante la repli viral. Osea que en un cel infectada no solo vamosa detectar ac nucleicos identocos
al genoma parental, sino que también otros que se generan de manera transitoria en la replicacion del ac nucleico
viral.
Vamos a recordar que los genomas virales, los ácidos
nucleicos pueden ser de DNA o RNA de doble o
simple cadena, circular o lineal. Y los rna puden ser
doble o simple cadena, y son todos lineales, no hay
genoma de rna circulares, y los genomas de rna de
simple cadena puedeen ser entreros o fragmentados,
mientras que los de doble cadena son todos
fragmentados.
La individualidad de un virus viene dada
fundamentalmente por la secuencia de bases de su
genoma, es decir, nosotros podemos identificar un
virus si carcterizamos la sec de bases de su genoma.
Esta sec de bases esta dada por la repeticio
secuencial, en el caso de dna de cuatro bases
nitrogenadas (citocina, guanina adenina y timina) y en
el caso del rna también (citocina, guanina, adenina y
uracilo).
Estas bases nitrogenadas, se reconocen mutuamente entre si a través
de la formación de reacciones del tipo pte de hidrogeno que vinculan
a una guanina con una citocina y a una adenida con una timina. De tal
manera que cuando tenemos una det secuencia del nuceotido que
esta formada por una sucesion de bases nitrogenadas, esa secuencia
podra sr reconocida especificamente por una secuencia de bases que
se complementen con la secuencia blanco, es decir que donde hay
una citocina, le ofrescan de manera compleentaria una guanina,
donde haya un T una A, y asi sucesivamente
la reaccion que se lleva a cabo entre dos sec que son complementaria
de esta forma se llama reaccion de hibridacion, esta reaccion
dependen de la complementariedad de la sec de bases entre dos
cadenas de ac nucleicos. Si se trata de dos cadenas de DNA
monocatenario, sera una hibridacion homogenea, si se trata de una
cadena de DNA y una dde RNA, se tratara de una hibridacion
heterogenea, pero en ambos casos, esa hibridacion se tiene que
producir por apareamiento especifico de bases. Esta hibridacion es el
fundamento de todas las técnicas de biologia molecular e ing
genetica que utilizamos con el propocito de detectar, caract o
cuantificar acc nucleicos virales o virus, a través de la deteccion, caract o cuantificacion de sus ac nucleicos.
En esta diappo tenemos una mla de dna donde
se estan apareando por complementariedad
especifica entre las bases, dos cadenas
complementarias; estas cadenas
complementarias estan muy fuertemente
unidas debido a la cant de ptes de H que se
gneran cuando ambas son perfectamente
complementarias, y para separarlas hay que
aplicar una gran cant de energia. Esa energia se
suministra por calentamiento, este permite
romper los ptes de hidrogenos y separar las
cadenas, si yo enfrio estas dos cadenas, se dice
que se renaturalizan, lo mismo sucede con el
RNA, yo puedo generar hibridos de DNA-Rna
siempre y cuando, ambas sean
complementarias entre si. Osea que hay
hibridacion entre cadenas de dna y también
hibridacion de RNA con DNA.
→ Tecnicas de deteccion e identificacion de ac nucleicos por hibridacion:
• Hibridacion en fase liquida.
• Hibridacion en fase solida.
• Dot-hibridacion
son manchas, se siembra una muestra incognita conteniendo el ac nucleico incog y se agrega una zonda
conteniendo una sec conocida y complementaria de aquella sc que deseo detectar en la muestra sembrada
en el dot, y si la zonda cuya sec es complementaria a la sec blanco se hibrido y no es desprendida por los
lavados, luego se va a revelar con una rx colorimetrica, gralmente esa zonda tiene un reactivo revelable que
puede generar un color o fluoresceencia, o una enzima o un radiactivo
• Southern-blot
es mas compleja xq implica una sucesion de separacion en un gel de agarosa, luego la transf a una membrana
y finalmente una rx de hibridacion.
• Northern-blot
es analoga a la anterior, y se utiliza para la deteccion de sec de DNA, la analoga para rna northen ?que
también implica la separacion electroforetica, la transf a un soporte solido, y luego el revelado para una
zonda especifica. 
• Hibridacion “in situ”
El soporte dodne se va a realizar la hibridacion es untejido por ejemplo tomado de una biopsia, ese tejido
tiene que ser desnaturalizado para exponer el ac nucleico y dejarlo libre y desnaturalizado para reaccionar
con una zonda que se agrega directamente sobre el tejido desnaturalizado, y luego se revela de manera
similar con la ventajaque yo puedo reconocer en casos de infecciones virales cual es la fraccion de un tejido
que esta infectado y cuales son las fracciones que no estan infectadas.
Hibridacion de ac nucleicos: 
Parametros que afectan la vel y 
fidelidad de lla reaccion
*Soncentracion de sales
* Solventes
* Temperatura
* Complejidad del Ac nucleico
* Concentracion de la soda
* Condiciones de exigencia de lavado
PCR, tecnica de reaccion de polimerasa en cadena,
que es una tec de amplificacion de blancos, es
decir, amplifica aquella sec de ac nucleicos que yo
deseo detectar o que deseo cuantificar. Pero las
técnicas de amplificacion de blanco no son las
unicas, hay técnicas que amplifican la señal de la
reaccion en vez del blanco. La mas utilizadas son
las b-dna; que es una tecnica facilmente
estandarizable que tiene la ventaja que se realiza
bajo condiciones isotermicas y que también se
puede hacer cuantitativa y permite hacer
estimaciones de carga viral en muestras clinicas.
También hay técnicas basadas en la amplificacion
de la zonda que uno utiliza para detectar la sec
blanco. Como la tecnica LCR (reaccion en cadena
de la ligasa), tecnicamente sz muy parecida a la
pcr, con la dif que no se amplifica la sec blanco,
sino que se amplifica la zonda que detecta la sec
blanco, y por lo tanto esta puede ser mas expecifica que la pcr.
En grla estas técnicas son hoy muuy utilizadas en la virologia con dif propocitos, pero se ahn expandido muchisimo en
el area de diagnostico virologico, asi como se han expandido ene l resto de la virologia, pero particularmente en la
virologia ha encontrado una cant importante de aplicaciones.
Este es un esquema de como se lleva a cavo una rx de b-dna en este caso para detectar y cuantificar una mla dee rna
viral, puede ser el rna de un virus como el hiv o como el sars-cov2.
Por ejemplo las técnicas utilizadas para la cuantificacion de carga viral en pte infectados con hiv o hepatitis c tienen
este formato. Fijensen que una vez que eel rnaviral, el traget ah sido liberado, se lo hace rx con una mezcla de
zondas, una zonda de captura que retiene a la sec blanco, al ac nucleico blanco sobre una superficie solida, por
ejempolo en este caso la sup de un posillo de una placa de 96 posillos. Esa zonda de captura, no rx directamente con
la sec blanco, sino que reacciona con un segundo target, con una segunda sonda que tiene dos brazos, uno que
reconoce a la zonda de captura y otro que reconoce a la sec blanco sobre la molécula de rna blanco. Esto retiene al
rna blanco luego de los lavados en el pocillo, lo retiene en la fase solida, y luego esto se hace rx con una sonda de
preamplificacion que rx con el rna blanco pero en una secuencia de bases diferentes a la que reconocian las sondas
dee captura inicial. Esa sonda de preamplificacion también tiene dos brasos, con uno reconoce una secuencia blanco
en el rna blanco y con el segundo braso (el que no queda ligado al rna blanco) va a reconocer a una cuarta sonda que
se llama amplificadora, esta sonda amplificadora se va a ligar al segundo braso de la sonda preamplificadora y esta
sonda amplificadora se caracteriza porque tiene brasos que son especies de sondas, y cada uno de estos tienen
multiples arcadores, cuya presencia puede ser reveladada mediante una rx color o fluorimetrica. De tal manera que
cuando se agrega el marcador de revelado se va a generar una señal colorimetrica o fluorescente cuya magnitud va a
ser proporcional frente a una curva de calibrado a la concentración de rna viral presente en la muestra, de tal
manera, esta rx se puede realizar de manera cuantitativa.
La PCR es una rx que amplifica
blancos, para esta es necesario tener
como sustrato inicial para la rx un dna
doble cadena que va a actuar como
blanco, aca esta contenida la
secuencia que yo deseo amplificar, ese
dna blanco debe desnaturalizarce para
separar ambas cadenas, y luego
hacese reaccionar esa mezcla desnat
con un par de sondas que vana
reconocer secuencias sobre ambas
cadenas de la doble hebra
desnaturalizada, estos primers se
diseñan especificamente para
delimitar la zona de la secuncia que yo
tengo interés de amplificar. Estos bajo
condiciones de determianda
temperatura (la desnat se hace a altas
temp), luego la tem se reduce para
que las sondas reconoscan y se hibriden sobre las sec que reconocen sobre la mla blanco, y luego que se ha
producido ese reconocimiento va a intervenir una dna pol que en presencia de oxinucleotidos, va a proceder a la
extencion de los primers, siempre en sentido 5’ → 3’ de tal manera, que cada una de las cadenas al cabo de esta
extencion va a haber duplicado su cant original. Originalmente teniamos una sec blanco que luego de la
desnaturalizacion dio las dos cadenas separadas, y al cabo del primer ciclo vamos a tener dos moleculas de dna de
doble cadena que cuando se vuelvan a desnat me van a generar dos simples cadenas de cada una de las sec
complementarias. Entonces como se produce la duplicacion de la sec blanco luego de cada ciclo, si nosotros
repetimos esta rx muchas veces, y en cada seclo se duplica la cant de secuencias a amplificar, al cao de 25-30 ciclos ya
voy a tener miles de copias que se han generados, y voy a estar en condiciones de detectar facilmente esa secuencia
amplificada mediante una electroforesiss en gel de agarosa por ej.
La especificidad de la amplific depende de cuan especifica sea la rx de la sondas con las se ca a amplificar.
Aca ttenemos representada la amplificacion del tipo exponencial que se da. 
Supongamos que arranco de una sola mla blanco, al cabo del primer ciclo ya tengo dos, en el sig 4 , 8, 16 y asi
progresivamente. 
Hay variantes de la PCR adaptadass para
propositos diferentes, a la simple amplificacion
de molas de dna.
Por ejemplo la reaccion de RT-PCR, permite
amplificar RNA, antes de entrar a la tecnica de
PCR se hace una retrottranscrippcion, hay que
transformar ese RNA en una mla de dna
doblecadena, la cual se va a amplificar luego por
una pcr común.
Nestet PCR o PCR anidada, se hacen dos PCR en
serie, utilizando dos primers dif en la primer
reaccion, por ejemplo se utilizan un par de
primers y se hace una amplificacion de por ej 20
ciclos, y en la segunda PCR en lugar de utilizar
los mismos primer, se van a utilizar otros primers
que van a hibridar en sonas internas a la
secuencia anterior, de manera que se va a
amplificar una region mas corta. Esta segunda
PCR le da a la rx una especificidad mayor que la
que suministra una PCR común. 
Multiplex PCR: no se utiliza un unico par d primers, sino varios, dos o mas que van a reconocer blanco dif en una
misma reaccion, de tal manera que en una unica corrida yo voy a detectaar varios target al mismo tiempo.
Supongamos que tenemos una infeccion respiratoria, que puede ser prod por dif agts virales, también por bacterias u
hongos, y yo quiero descartar de que se trate de una infeccion viral, entonces, lo que puedo hacer es diseñar una
multiplex PCR e introdusco pares de sondas que me permitan amplificar RNAs de todos aquellos virus que sopecho
que pueden estar actuando como agtes etiologicos de aquella infeccion, y de esa manera amplifico todos al mismo
tiempo y ahorro tiempo para hacer el descarte de la infeccion viral
Ral Time PCR: PCR en tiempo real o cuantitativa que permite llevar a cabo esta rx de manera que nos permita valorar
cuantittivamente la cantidad de DNAs o RNAs si esta combinada con una transc reversa previa presente en una
muestra, y se llama real time porque uno puede seguir la amplificacion que se produce en tiemporeal, porque en
esta x a medida que se va amplificando el blanco, se va generando fluorescencia que uno puede ir midiendo de
manera continua y que me permite obtener un resultado cuantitativo.
Secuenciamiento de Ac nucleicos
La identidad ultima de un det virus, esta determinada por la sec de nucleotidos de su genoma, y esta identidad,
entonces no puede ser especificada de manera mas exaustiva que a través de a determinacion de la secuencia de
nucleotidos de su genoma. Las posibilidades para hacer secuenciamiento de ac nucleicos, basicamente se localizan en
3 alternativas tecnologicas.
• Metodo químico de Maxam y Gilbert.
• Metodo del dideoxinucleotido de Sanger.
• Tecnicas de alto rendimiento: NGS (“Nex Generation Sequencing”) (actuales)
Permiten secuenciar rapidamente y con una infraestructura mucho mas sensilla que las utilizadas. Permite
secuenciar rapidamente gran cantidad de genoma. Por ejemplo, podemos mencionar que entre marzo y
agosto del 2020 se han podido secuenciar los genomas de mas de 400 aislamientos de virus sarscov 2
efectuado en la argentina. Esto es algo que hace pocos años atrás era impensable, y hoy esta practicamente
al alcanze de muchos labs, directamente porque poseen los equipamientos o porque tienen acceso a estas
técnicas por servicion con costos altamente factibles.
A continuacion pego unas diapos que cambiaron los HDP
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