Métodos cromatográficos

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Separaciones cromatográficas 
 
En 1903 se describió la separación de pigmentos de hojas de plantas en disolución mediante 
el empleo de adsorbentes sólidos y se llamó a este proceso cromatografía. 
 
Actualmente en los métodos de separación, la mezcla de sustancias que se va a fraccionar 
se disuelve en un líquido o un fluido gaseoso, esto se conoce como fase móvil. La disolución 
que se obtiene fluye por una columna que se constituye de una matriz sólida porosa y se 
conoce como fase estacionaria. Las interacciones de los solutos individuales y la fase 
estacionaria retardan su progreso a través de la matriz; por lo que varía con las propiedades 
de cada soluto. Si la mezcla que se está fraccionando comienza a recorrer por la columna de 
una banda estrecha, se separará en sustancias puras. 
 
La importancia de la cromatografía se debe a la naturaleza continua de los procesos de 
separación, ya que, una sola etapa de separación muestra poca tendencia a separar una 
mezcla en sus componentes; pero, como este proceso se aplica de modo continuo, la 
separación de la mezcla en sus componentes es exitosa, pudiéndose recoger los 
componentes separados para efectuar su análisis o tratamientos posteriores. 
 
Los métodos de cromatografía se clasifican de acuerdo con sus fases móviles y estacionarias 
(gas-líquido y líquido líquido); también, de acuerdo con la interacción entre la fase 
estacionaria y las sustancias que están siendo separadas (cromatografía de intercambio 
iónico, de adsorción, etc.). 
 
Los procedimientos para aislar sustancias biológicas incorporan un significativo número de 
etapas cromatográficas independientes para poder purificar la sustancia de interés. A 
continuación se describen los procesos que se emplean comúnmente. 
 
 
Cromatografía de intercambio iónico 
 
En el proceso de intercambio iónico, los iones que están unidos electrostáticamente a una 
matriz insoluble e inerte químicamente son sustituidos de modo reversible por los iones en 
disolución: 
𝑅+𝐴− + 𝐵− ↔ 𝑅+𝐵− + 𝐴− 
 
𝑅+𝐴− es un intercambiador aniónico en la forma 𝐴−y 𝐵− representa a los aniones en la 
disolución. Los intercambiadores catiónicos, son portadores de grupos con carga negativa 
que unen, por tanto, a los intercambiadores de aniones y de cationes. Sin embargo, las 
proteínas y otros polielectrolitos que son portadores de cargas positivas y negativas pueden 
unirse tanto a los cambiadores de cationes como a los de aniones, dependiendo de su carga 
neta. La afinidad con la que un polielectrolito concreto se une a un cambiador iónico 
determinado depende de las identidades y de las concentraciones de los demás iones 
presentes en la disolución, debido a la competencia entre los diversos iones por los sitios de 
unión sobre el intercambiador iónico. Las afinidades de unión de los polielectrolitos portadores 
de grupos ácido-base dependen también, en gran medida, del pH ya que sus cargas netas 
varían con dicho valor. Estos principios se emplean en el aislamiento de moléculas biológicas 
mediante la cromatografía de intercambio iónico. 
 
Bajo un conjunto de condiciones determinado, es probable que muchas proteínas se unan a 
un intercambiador iónico. Las proteínas que no se adhieren al intercambiador iónico en estas 
condiciones pueden eliminarse por suspensión del intercambiador iónico en el tampón en el 
que fue disuelta la mezcla de proteína. La proteína que interesa puede ser separada del 
intercambiador iónico con un tampón de un pH y concentración de sal que reduzca la afinidad 
de la proteína por el intercambiador iónico. 
La eficacia de este método de purificación discontinuo puede incrementarse mucho mediante 
el sencillo recurso de empaquetar el intercambiador iónico en una columna. 
A medida que se lava la columna, proceso conocido como elución, las proteínas con 
afinidades relativamente bajas por el intercambiador iónico se desplazarán en la columna más 
deprisa que las proteínas que se unen al intercambiador iónico con afinidad superior. 
 
La elución con gradiente mejora las separaciones cromatográficas. 
Los procesos de purificación pueden mejorarse, además, por lavado de la columna cargada 
de proteína empleando el método de elución con gradiente. En este método la concentración 
de la sal o el pH se hacen variar de modo continuo al eludir la columna y así se liberan 
secuencialmente las diversas proteínas que se hallan unidas al intercambiador iónico. Este 
procedimiento conduce habitualmente a una separación mejor de las proteínas que la que se 
consigue por elución de la columna con una sola disolución o mediante el empleo de una 
serie de disoluciones de manera escalonada. 
 
Se dispone de varios tipos de intercambiadores iónicos. 
Los intercambiadores iónicos se hallan constituidos por grupos unidos por covalencia a una 
matriz soportante. La naturaleza química de los grupos cargados determina los tipos de iones 
que se unen al intercambiador iónico y la fuerza con la que se unen. 
Como matrices soporte para los intercambiadores iónicos se emplean en general tres clases: 
1. Resinas como el poliestireno unido transversalmente con divinilbenceno. 
2. Celulosa 
3. Poliacrilamida unida consigo misma por enlaces transversales y geles de polidextrano. 
 
Las resinas de intercambio iónico son asequibles en forma granular. Los polímeros de las 
resinas de intercambio catiónico se encuentran muy sustituidas con grupos aniónicos, tales 
como el ácido sulfónico, fuertemente ácido, o por grupos carboxílicos con carácter de ácido 
débil. Las resinas de intercambio iónico se emplean rutinariamente en la separación de 
moléculas pequeñas, pero se ha demostrado que son menos eficaces en la separación de 
proteínas y de otras macromoléculas que los otros tipos de intercambiadores iónicos. Una 
ventaja adicional de los intercambiadores iónicos celulósicos es que su densidad de grupos 
con carga es relativamente pequeña, lo que permite la elución de polielectrolitos grandes en 
condiciones suaves. 
Los intercambiadores iónicos del tipo de gel pueden poseer la misma clase de grupos con 
carga que los intercambiadores iónicos celulósicos. La ventaja de estos reside en que 
combinan las propiedades de separación de la filtración por gel con las del intercambio iónico. 
 
Cromatografía sobre papel 
 
Surgió en 1941, es una técnica muy precisa utilizada actualmente en bioquímica para 
separación de moléculas como aminoácidos y oligopéptidos). 
Se requiere de una tira de papel filtro a una distancia de aproximadamente 2 cm por encima 
del extremo del papel, se depositan unas gotas de la solución que contiene la mezcla de 
componentes a separar y se deja secar. Una vez seco, se introduce el extremo del papel en 
una mezcla de disolventes constituida por componentes acuosos y orgánicos (normalmente 
se utilizan agua-butanol-ácido acético 4:5:1; etanol del 77%, 6 6:7:7 agua/alcohol t-
amílico/piridina, o 1:6:3 agua/n-propanol/ amoniaco concentrado. 
El papel también debe estar en contacto con los vapores en equilibrio con el disolvente. El 
disolvente moja el papel debido a la naturaleza fibrosa del mismo la dirección de migración 
del disolvente puede disponerse de modo que sea ascendente o descendente. (Figura 1) 
 
Figura 1. Dispositivos experimentales en cromatografía ascendente y descendente en papel. 
El componente acuoso del disolvente se une a la celulosa del papel y forma una fase 
estacionaria, como un gel, con el papel. El componente orgánico sigue moviéndose formando 
así la fase móvil. 
Las velocidades de migración de las sustancias están condicionadas por su solubilidad en la 
fase estacionaria polar y en la fase móvil no polar; en una sola etapa de la separación, un 
soluto se distribuye entre las fases móvil y estacionaria de acuerdo con su coeficiente de 
partición, el cual es una constante que se define como: 
 
Las moléculas se separan entonces, por su polaridad;las no polares son más rápidas que las 
polares. 
Cuando el disolvente ha terminado de correr su distancia, el cromatograma se extrae del 
disolvente y se seca; los materiales separados si no son coloreados pueden ser tratados de 
las siguientes formas: 
1. Los materiales marcados radiactivamente pueden ser localizados por métodos de 
detección radiactiva. 
2. Los materiales fluorescentes, o que extinguen fluorescencia del papel pueden verse por 
exposición a la luz UV. 
3. Para poder observar los materiales, se pulveriza el cromatograma con una disolución de 
un reactivo que forma un producto coloreado con la sustancia que se está investigando. 
Por ejemplo, los alfa-aminoácidos y otras aminas primarias, reaccionan con ninhidrina y 
forman un compuesto color púrpura, las aminas secundarias como prolina, reaccionan 
igualmente con ninhidrina; pero forman un compuesto amarillo. 
La relación de migración de una sustancia (Rf) puede expresarse de acuerdo con: 
 
*Para cada disolvente y tipo de papel, cada sustancia presenta un Rf distinto. 
Esta técnica puede emplearse como preparativa para purificar cantidades pequeñas de 
sustancias. La disolución con la sustancia de interés se aplica en una línea a través del fondo 
de una hoja de papel filtro y se cromatografía toda la hoja, como se ha descrito. La sustancia 
de interés se visualiza en el cromatograma, detectándolo por una tira pequeña que sea 
cortada del cromatograma a lo largo de la línea de migración del disolvente, o de acuerdo con 
su valor conocido de Rf. Por último, se corta la banda de la sustancia purificada y se recupera 
al extraerla del papel con un disolvente apropiado. 
Si una sustancia no se ha separado completamente en una sola cromatografía sobre papel, 
se trata por cromatografía bidimensional sobre papel; técnica que se desarrolla un 
cromatograma como el descrito antes, excepto que la muestra se deposita en una esquina 
del papel filtro y el cromatograma corre paralelo al borde del papel. Terminada la corrida, y 
cuando se haya secado el papel; se gira 90 grados el cromatograma y se hace la 
cromatografía paralela al segundo borde, pero usando otros disolventes. 
 
 
 
Cromatografía de filtración por gel 
 
También conocida como cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de tamiz 
molecular, las moléculas se separan de acuerdo con sus tamaños y sus formas. En esta 
técnica la fase estacionaria se halla constituida por gránulos de un material esponjoso 
hidratado que contiene oiris que comprenden un intervalo de tamaños, relativamente 
reducido, de dimensiones moleculares. Si por una columna que contenga estos tamices 
moleculares, se hace atravesar una disolución acuosa que contenga moléculas de varios 
tamaños, las moléculas que son demasiados grandes para atravesar los poros quedarán 
excluidos del volumen de disolvente contenido en el interior de los gránulos del gel. El límite 
de exclusión se refiere a la masa molecular de la molécula más pequeña que es incapaz de 
penetrar en los poros de un gel determinado. Las moléculas alargadas como consecuencia 
de su radio de hidratación mayor es menos probable que penetren en un poro del gel concreto 
que las moléculas esféricas del mismo volumen molecular. El comportamiento de una 
molécula sobre una columna de gel particular puede caracterizarse cuantitativamente; si Vx 
es el volumen ocupado por los gránulos del gel y Vo el volumen vacío que es el volumen del 
disolvente del espacio que rodea a los gránulos, luego Vt el volumen de lecho total de la 
columna es simplemente la suma: 
 
El volumen de elución de un soluto determinado Vt es el volumen de disolvente que se 
necesita para eluir el soluto desde la columna después que ha establecido su primer contacto 
con el gel. El comportamiento de un soluto se caracteriza por la relación Ve/Vo que es el 
volumen de elución relativo una cantidad independiente de la columna particular que se 
emplea. Las moléculas con masa moleculares comprendidas por debajo del límite de 
exclusión de un gel se eluirán desde el gel en el orden de sus masas moleculares siendo las 
de mayor masa las que eluyen en primer lugar. 
 
Figura 2. Esquema de la cromatografía filtración por gel. 
 
La cromatografía de filtración por gel puede emplearse para la determinación de las masas 
moleculares, existe una relación lineal entre el volumen de elución relativo de una sustancia 
y el logaritmo de su masa molecular en un intervalo considerable de masas moleculares. La 
cromatografía de filtración por gel se emplea para determinar masas moleculares ya que 
puede aplicarse a muestras muy impuras (suponiendo que la molécula que interesa puede 
identificarse) y a que puede efectuarse con rapidez empleando un equipo sencillo. 
 
La mayoría de los geles se confeccionan con dextrano, agarosa o poliacrilamida. La filtración 
por gel se emplea con frecuencia para desalar una disolución de proteína. Un ejemplo es 
cuando una proteína precipitada por sulfato de amonio puede liberarse con facilidad de la sal 
por disolución del precipitado de proteína en un volumen mínimo de tampón adecuado y 
aplicado esta disolución a una columna de gel con un limitante de exclusión inferior al de la 
masa molecular de la proteína. Por elución de la columna con el tampón. La proteína 
precederá al sulfato de amonio a través de la columna, pueden prepararse derivados de los 
geles de dextrano y de poliacrilamida que contienen grupos ionizables, tales como DEAE y 
CM para formar geles de intercambio iónico. Las sustancias que se cromatografía con estos 
geles se hallan sometidas a una separación de acuerdo con sus cargas iónicas así como sus 
tamaños y formas. 
 
La diálisis es un proceso que separa moléculas de acuerdo a su tamaño, mediante el empleo 
de membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones inferiores a las 
macromoleculares. Estos poros permiten que moléculas pequeñas tales como las de los 
disolventes, sales y metabolitos pequeños se difundan a través de la membrana pero 
bloquean el tránsito de moléculas mayores. La celofana (acetato de celulosa) es el material 
de diálisis que se emplea más corrientemente aunque se emplean de modo semejante 
nitrocelulosa y colodión. 
 
Cromatografía de afinidad 
 
En esta técnica una molécula conocida como ligando, a la que se une específicamente la 
proteína que interesa, se une por covalencia a una matriz inerte porosa. Cuando se hace 
atravesar a través de este material cromatográfico una disolución de proteína impura, la 
proteína deseada se une al ligando inmovilizado mientras que las demás sustancias se 
eliminan de la columna con el tampón, La proteína deseada se puede recuperar entonces, en 
forma muy purificada, variando las condiciones de elución de modo que se libere la proteína 
de la matriz cromatográfica. La gran ventaja de esta cromatografía es su capacidad de 
aprovechar las propiedades bioquímicas singulares de la proteína deseada en lugar de las 
pequeñas diferencias entre las propiedades fisicoquímicas de otras proteínas que utilizan 
distintas cromatografías. 
 
La matriz cromatográfica debe ser inerte químicamente, tener porosidad elevada y muchos 
grupos funcionales para formar enlaces covalentes con los ligandos. Si el ligando es portador 
de un grupo amino que no es esencial para su unión a la proteína de interés, puede unirse 
por covalencia a la agarosa en un proceso de dos etapas. 
1. Se hace reaccionar la agarosa con bromuro de cianógeno a fin de preparar un 
intermediario. 
2. El ligando reacciona con la agarosa activada y forma un producto unido por 
covalencia. 
 
El ligando empleado en el aislamiento por cromatografía de afinidad de una proteína 
determinada debe poseer una afinidad bastante alta para inmovilizar la proteína sobre el gel 
de agarosa, pero no tan alta que impida la liberación subsiguiente. Si el ligando es un sustrato 
para una enzima que estásiendo aislado, las condiciones cromatográficas deben ser tales 
que el enzima no funcione catalíticamente, de lo contrario en ligando sería destruido. 
 
Un método para conseguir separar la proteína libre de impurezas de la columna, es eluir la 
columna con una disolución de un compuesto con mayor afinidad por el sitio de unión de la 
proteína que exhibe el ligando unido. Otro es alterar las condiciones de la disolución de la 
disolución de modo que el complejo proteína-ligando ya no sea estable como cambios de pH, 
fuerza iónica y temperatura. Sin embargo debe cuidarse que las condiciones de la disolución 
no sean tan inhóspitas que la proteína pueda resultar dañada irreversiblemente. 
 
La cromatografía de afinidad se ha empleado para aislar sustancias como enzimas, 
anticuerpos, proteínas de transporte receptores de hormonas, membranas y aun células 
completas. Un famoso ejemplo es la aislación de la proteína receptora de la insulina. 
 
Otras técnicas cromatográficas 
 
● Cromatografía de absorción 
Separa sustancias no polares (método de cromatografía original); las moléculas se absorben 
físicamente sobre sustancias insolubles (alúmina, carbón activado, tierra de diatomeas, 
sacarosa finamente pulverizada, gel de sílice), por intervención de asociaciones de Van Der 
Waals y enlaces de hidrógeno. Las moléculas se eluyen entonces de la columna mediante un 
disolvente puro (cloroformo, hexano, éter etílico, o mezcla de tales disolventes). El proceso 
de separación se basa en la distribución de las diversas sustancias entre el material de la 
columna polar y el disolvente no polar. Este procedimiento se emplea, muy frecuentemente, 
para separar moléculas no polares en lugar de aplicarlo a las proteínas. 
 
● Cromatografía hidroxiapatito 
Separa proteínas a través de su absorción por los geles de hidroxiapatito cristalino, que es 
una forma insoluble de fosfato de calcio de fórmula empírica 𝐶𝑎5(𝑃𝑂4)3𝑂𝐻 Se consigue por 
elución de la columna con un gradiente de tampón de fosfato (la presencia de otros aniones 
no es importante). La base fisicoquímica no está aclarada por completo pero, aparentemente, 
incluye la absorción de aniones en los sitios del 𝐶𝑎2+ y de cationes en los sitios del 𝑃𝑂4
3+ de 
la red cristalina del hidroxiapatito. 
 
● Cromatografía en capa delgada (TLC) 
Se emplea para separar moléculas orgánicas; una capa delgada (∿0.25mm) de un material 
sólido, se extiende sobre una placa de vidrio o de plástico que se emplea de modo semejante 
a la de cromatografía ascendente sobre papel. De acuerdo a la elección del disolvente para 
la fase móvil, la separación puede basarse en procesos de absorción, penetración, filtración 
en gel o intercambio iónico, o en niencia, rapidez y resolución elevada de este tipo de 
cromatografía han conducido a que se emplee rutinariamente en el análisis de moléculas 
orgánicas. 
 
● Cromatografía en fase reversa (RPC) 
Separa sustancias no polares y constituye una forma de cromatografía de partición líquido-
líquido en la que el carácter polar de las fases se invierte respecto al de la cromatografía en 
papel. La fase estacionaria está constituida está constituida por un líquido no polar 
inmovilizado sobre un sólido relativamente inerte y la fase reversa se desarrolló, en principio, 
para separar mezclas de sustancias no polares, como los lípidos, pero se ha encontrado que 
es eficaz en la separación de sustancias polares como los oligonucleótidos. 
 
● Cromatografía líquida de resolución elevada (HPLC) 
Ha permitido efectuar separaciones mucho mejores, puede basarse en la absorción, el 
intercambio iónico, la exclusión por tamaños o en la fase reversa tal como se describió 
previamente. Las columnas estrechas y relativamente largas se empaquetan con gránulos de 
vidrio o de plásticos finos, recubiertos con una capa fina de las fases estacionarias. La fase 
móvil fluye a través de la columna estrechamente empaquetada, obligada por presiones de 
hasta 700atm, lo que conduce a tiempos de análisis muy reducidos. Los eluidos se identifican 
cuando abandonan la columna por métodos de absorción UV, índice de refracción y medidas 
de fluorescencia. 
Las ventajas de HPLC son las siguientes: 
○ Su resolución elevada, que permite la purificación de rutina de mezclas que 
han desafiado la separación por otras técnicas. 
○ Su velocidad, que permite que la mayor parte de las separaciones se consigan 
significativamente en tiempos menores de 1h. 
○ Su sensibilidad elevada, que, en los casos favorables, permite la valoración 
cuantitativa de cantidades de material menores del picomol. 
○ Su capacidad de automatización. 
Su desventaja reside en su pequeña capacidad, que limita su empleo en purificaciones en 
gran escala, y el gasto elevado de la instrumentación para HPLC. 
Pocos laboratorios bioquímicos pueden funcionar en la actualidad sin disponer de un sistema 
de HPLC. 
 
● Cromatografía gas-líquido (GLC) 
Las sustancias sometidas a análisis por GLC deben ser volátiles y estables a temperaturas 
altas. Este hecho limita las aplicaciones bioquímicas de la GLC a compuestos de masa 
molecular relativamente pequeña. La posibilidad de adecuar los compuestos a la GLC puede 
mejorarse mucho formando derivados suyos más volátiles. 
La fase estacionaria es un sólido inerte como la tierra de diatomeas o ladrillo refractario 
pulverizado, que se han impregnado con un líquido de volatilidad baja (aceite de silicona o 
polietilenglicol). El sólido se empaqueta en una columna larga y relativamente estrecha, que 
se mantiene a una temperatura elevada (aproximadamente a 200ºC) qué puede hacerse 
variar sistemáticamente durante un análisis. La fase móvil es una corriente de gas inerte como 
𝐴𝑟, 𝐻𝑒 𝑜 𝑁2 en la que se evapora instantáneamente la mezcla que se va a analizar. La 
velocidad de emigración de un compuesto se determina por su diferente solubilidad entre el 
gas portador y el líquido inmovilizado. 
 
● Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) 
En condiciones apropiadas, las proteínas interaccionan con los grupos apolares de una matriz 
inmovilizada. La fase estacionaria tiene un carácter de una sustancia hidrofílica, tal como un 
gel de agarosa, sólo sustituida en parte por grupos hidrofóbicos, generalmente restos octilo o 
fenilo. Las interacciones hidrofóbicas son relativamente débiles con lo que las proteínas 
conservan sus estructuras nativas. 
Los gradientes deben reducir progresivamente estas interacciones hidrofóbicas débiles. Con 
la ayuda de los eluyentes, la HIC separa proteínas nativas según su grado de hidrofobicidad 
superficial, criterio que difiere de los que constituyen la base de otros tipos de cromatografía. 
 
 
Aplicaciones 
 
● Determinación del porcentaje de formación de una molécula de síntesis, en una planta 
de síntesis orgánica. 
● Determinación del porcentaje de solvente en un producto. 
● Determinación de la concentración de producto activo. 
● Control de calidad de pureza de solventes. 
● Determinación del contenido de principio activo de un medicamento. 
● Control de calidad de la pureza de materias primas entrantes a bodega de una fábrica 
 
 
Conclusión 
 
Es de gran importancia la cromatografía para nuestra formación profesional, ya que nos 
ayudará a la identificación de moléculas en los fluidos corporales (sangre, orina, líquido 
cerebroespinal), indica una predisposición a la enfermedad; ayuda a revelación de drogas 
que es seguro y de manera efectiva para la enfermedad específica condiciona, separación 
quiral de los enantiómeros de una molécula, purificación de cada uno de los enantiómeros en 
las suficientes cantidades para permiso un estudio de las propiedades farmacocinéticas y 
metabólicas del enantiómero, identificación del enantiómero de la opción como agente 
terapéutico posible y purificación en escalas más altas (de la producción). 
 
 
Comentario video 
 
Como se menciona en elvideo, todos los métodos para separar mezclas requieren de algún 
tipo de cromatografía, la cual es usada para la separación de una mezcla formada por dos o 
más compuestos diferentes ya sean sintéticos o de origen natural. 
La cromatografía en columna es una técnica para separar una mezcla de dos o más 
compuestos de polaridad diferente por distribución del soluto entre dos fases, una 
estacionaria y otra móvil. Este tipo de cromatografía es del tipo sólido-líquido y está basada 
en la adsorción y solubilidad llegando a un equilibrio. Dentro de la adsorción se llevan a cabo 
diferentes tipos de fuerzas en las moléculas. 
El proceso consta de 4 etapas: empaque, adición, elución y recuperación. 
Es de suma importancia conocer como se lleva a cabo este proceso debido a que se utiliza 
con fines preparativos, es decir, es uno de los métodos más generales para la separación y 
purificación de compuestos orgánicos tanto sólidos como líquidos; además de que tiene un 
gran uso dentro de la industria.