INFORME 5 TINCIONES BASICAS EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA JCLM

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PRACTICA 5
TINCIONES BASICAS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
I. INTRODUCCIÓN: 
En la microbiología se utiliza constantemente el microscopio como parte de su análisis, de una muestra objetivo, donde proporciona algún tipo de identificación temprana y definitiva de los microorganismos. En su valoración de las muestras es determinante conocer la resolución del microscopio, ya que es el responsable de la calidad, claridad y nitidez de una imagen. Para su aprovechamiento su ventaja, a lo largo del tiempo se ha ido desarrollando técnicas tintoriales que destacan las características morfológicas de los microorganismos 
La tinción se define como el proceso y resultado de teñir, pero en el área de la Microbiología se refiere a la coloración que se les da a las células o microorganismos, con el fin de optimizar la visión de aquello que se observa en el microscopio, por ello, es que se aplica un colorante al material de estudio para que resulte mas simple detectar determinados microorganismos en la muestra de estudio.
Los microorganismos poseen mecanismos de coloración como las células y la de tejidos, están se dan por una combinación de fenómenos físicos como la capilaridad, ósmosis y químicos de absorción. La coloración básica son los tejidos ácidos y viceversa indican que existe una reacción química, estos colorantes contienen radicales cromófobos que producen color y grupo de anxocromos que forman sales de grupo nitrito (-NO2) y los radicales como hidroxilo (-OH) y amino (-NH2) son grupos anxocromos que permiten que el colorante sea de una fibra o tejido, mientas que los cromófobos imparten una propiedad cromógena al colorante.
Para una tinción neutra se da cuando un frotis se fija en vidrio del portaobjeto para aplicar métodos habituales de tinción que permiten la observación del microscopio de las bacterias, esta fijación permite una extensión bacteriana que queden inactivadas y adheridas alterando su morfología bacteriana. En el frotis, las células son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas. En la tinción Gram requiere de un proceso antes de su fijación con la finalidad de preservar la arquitectura estructural y química de las células.
Esta presente práctica se realiza en el laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional Autónoma de Tayacaja Daniel Hernández Morillo, donde realiza el tema principal de la tinción básica en el laboratorio para la observación de los microorganismos y las bacterias que se encuentran en las muestras de estudio.	
II. OBJETIVOS:
· Realizar correctamente una tinción neutra y la tinción Gram
III. MATERIAL Y MÉTODO
2.1 MATERIAL
· Portaobjetos
· Cubreobjetos
· Lanceta descartable
· Mondadientes
· Algodón
· Alcohol etílico 96°
· Pinza de madera
· Microscopio
· Reactivo Wright
· Reactivo Cristal Violeta
· Reactivo Lugol
· Reactivo Alcohol Acetona
· Reactivo Sufranina
· Agua destilada
· Muestras biológicas
· Mecheros
2.2 PROCEDIMIENTO
a) Tinción neutra
· Realizar un frotis sanguíneo en un portaobjeto
· Agregar 5 gotas aproximadamente, en todo el frotis por 5 minutos
· Luego agregar, gota a gota de agua destilada sin dejar caer colorante hasta la aparición de una tonalidad mecánica y dejar por 1 minuto.
· Lavar con agua destilada y secar con aireación
· Observar con microscopio con objetivo de inmersión.
b) Tinción Gram
· Realizar una extensión delgada y uniforme de la muestra biológica (sarro dental) y secar a llama de mechero
· Cubrir con Cristal Violeta, de 3 a 5 gotas, la extensión y dejar por 1 minuto
· Eliminar el exceso de colorante con agua destilada y secar por aireación
· Cubrir con Lugol, de 3 a 5 gotas, la extensión y dejar por 1 minuto
· Eliminar el exceso de colorante con agua destilada y secar por aireación
· Decolorar con Alcohol acetona
· Eliminar el exceso de colorante con agua destilada y secar por aireación
· Cubrir con Safranina, de 3 a 5 gotas, la extensión y dejar por 1 minuto
· Eliminar el exceso de colorante con agua destilada y secar por aireación
· Observar con objetivo de inmersión
IV. RESULTADOS
a) Tinción neutra
El procedimiento de la tinción neutra trata de obtener un frotis sanguíneo como primer punto, y esto se puede realizar por punción del dedo y colocar en un Portaobjeto cuando se requiera hacer la tinción, si es que esta muestra quiere conservarse, es necesario que se mantenga a 4 grados en reserva con un agente anticoagulante (López, Hernández, Colín, & Silvestre, 2014). 
Al realizar el frotis se coloca una gota de sangre en el extremo del Portaobjeto, donde no se requiere que sea muy grande porque dificultara su visualización en el microscopio, luego en ángulo de 45° estirar la sangre donde por capilaridad se distribuye por el canto, donde se desliza el Cubreobjeto estirando el frotis de manera rápida y uniforme, posteriormente se deja secar al aire. La figura 1 muestra evidencia como realizar un correcto frotis (Sánchez, 2017).
Figura 1. Frotis de sangre para su tinción
En la figura 01 indica que se distingue a la parte cabeza, cuerpo y cola; en la parte cabeza se coloca la gota de sangre que posee gran concentración de eritrocitos que se encuentran atinados en el cuerpo, donde no se observa la presencia de eritrocitos y es un buen lugar para la observación por medio del microscopio, y la zona terminal que es la zona final de la extensión, en esta zona se observa la presencia de leucocitos muy grandes, eritrocidos formados y abundancia de plaquetas.
En la figura 02 se muestra un frotis sanguíneo que no es el óptimo para la obtención de muestra objetivo, asimismo se observa en la presente imagen gran presencia de estrías que es debido a la velocidad y presión uniforme que se ha formado al realizar el frotis con el Portaobjeto.
Figura 2. Frotis sanguíneos no óptimos.
Luego se agrega 5 gotas de Reactivo de Wright, unos cinco minutos, posteriormente se agregará gota a gota de agua destilada sin dejar caer colorantes, hasta una aparición de tonalidad mecánica donde se deja repasando 01 minuto.
Esta debe tener una apariencia uniforme porque se va a fijar que es un proceso de conservación y estructuración interna del material a estudiar en un estado lo más próximo posible al estado vivo y esta consiste en una muerte rápida de los microorganismos, debida a la coagulación de albúminas protoplasmáticas. En general, provoca un despliegue de proteínas globulares con un aumento en la exposición de grupos reactivos (Corrales & Caycedo, 2019).
Adquiere coloración que es el proceso de tinción de los microorganismos, el lavado que se realiza con agua destilada con el fin de eliminar el exceso de colorante, teniendo en cuenta de no dirigir el agua destilada en el frotis. Posteriormente se observa en el microscopio como indica la Figura 3 que observa la presencia de eritrocitos en su estructura.
Figura 3. Muestra observada de sangre con presencia de eritrocitos.
b) Tinción Gram
En bacteriología la tinción de Gram es una herramienta fundamental para diferenciar distintos tipos de bacterias según su coloración, morfología y asociación. La pared bacteriana, corresponde a la estructura que da forma a la célula y la protege de lisis osmótica, acción de sustancias tóxicas y es el lugar sobre el cual actúan varios antibióticos (Sánchez, 2017). Ante ello, en la Tabla 01 indica las diferencias entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Tabla 01
Diferencias entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Fuente: Guzmán (2001). Las tinciones básicas en el Laboratorio de Microbiología: Un enfoque gráfico.
En el laboratorio de Microbiología realizar una extensión delgada y uniforme de una muestra biológica; en este caso es el sarro dental donde luego se seca con la llama de mechero para obtener su fijación de la muestra en el Portaobjeto y se pueda observar mejor en el microscopio.
Se tuvo que cubrir con Cristal Violeta, entre 3 a 5 gotas para la extensión uniforme y esperar por un minuto, la cual este reactivo tuvo por finalidad la coloración del peptidoglicano de la pared celular externa en el caso de las bacteriasGram negativas, mientras que las bacterias Gram positivas, poseen también una capa fina de péptidoglucanos, pero no cuentan con membrana celular externa. Ante ello, los colorantes secundarios o de contratinción tiñe las bacterias que no logra retener el complejo cristal, violeta – yodo (Sánchez, 2017).
Figura 4. Estructura molecular de cristal violeta
Asimismo, se agregó agua destilada para el lavado que se realiza con el fin de eliminar el exceso de colorante, teniendo en cuenta de no dirigir el agua destilada a la muestra de estudio.
Posteriormente, se colocó Lugol, el cual cumple la función de impedir la salida del cristal violeta por la formación de un complejo de cristal violeta-yodo, esto satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. La función del Lugol parte precisamente a una mezcla homogénea y en solución acuosa de yoduro de Potasio (KI) y Yodo (I2) (Corrales & Caycedo, 2019).
El denominado Lugol fue utilizado por el Dr. Jean Auguste Lugol que motivo de tratar la escrófula, comúnmente llamado la enfermedad de las paperas, este proceso infeccioso es causado por el Mycobacterium tuberculosis. El Dr. Mencionó que este tratamiento para la enfermedad utiliza una solución de Yodo (I) y Yoduro de potasio (KI), donde posteriormente se implementó su uso del elemento yodo para tratamiento de enfermedad del bocio (Rodriguez & Arenas, 2018). 
Figura 5. Solución de Yodo (I2) y Yoduro de Potasio (KI)
Posteriormente, se aplicó una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma. También destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas, debido a que esta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de alcohol-acetona. Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglucanos, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por poseer menos cantidad de peptidoglucano (Rodriguez & Arenas, 2018). 
Estos dos compuestos actúan juntos y en solución, que posee propiedades que deshidratan en primera instancia las moléculas de agua de la membrana, debido a la formación de dipolos en las moléculas. Es por ello, que se logra el fundamento de la decoloración de las paredes de las bacterias gram negativas, teniendo en cuenta que la presente solución separa las membranas constituidas por lipoproteínas y los lipopolisacáridos lo que permite la decoloración del cristal violeta (Sánchez, 2017). 
Luego de añadir la solución de alcohol – acetona se realizó una limpieza con agua destilada y secar por aireación sin ir directamente a la muestra.
Por último, se añadió un colorante de contraste, utilizando el Safranina como solución entre 3 o 5 gotas en toda la extensión de forma uniforme y dejar un minuto secando.
Su fundamento consiste en que tras la tinción del primer colorante Cristal Violeta se efectúa un lavado donde al realizarlo, se quedan solo las Gram negativas, mientras que en las Gram positivas el colorante queda retenido y las células permanecerán Azul – púrpuras. Las células Gram negativas se teñirán después de agregar el colorante de contraste, en este caso utilizamos la Safranina en la que, al observar se quedan de color rojizo como se observa el proceso de coloración Gram en la Figura 6 (López et all, 2014).
Figura 6. Adición de coloración Gram
Luego de que se observó una coloración rojiza en la muestra de sarro, se eliminó con agua destilada el exceso de colorante y se dejó secar por aireación.
Finalmente se pudo observar la muestra del portaobjeto en el microscopio donde se evidencia la muestra de caries en la Figura 7 con objetivo de inmersión donde se muestra las bacterias Gram negativas de color rojizo y las Gram positivas de color Azul.
Figura 7. Muestra observada de sarro dental con presencia de caries.
V. DISCUSIÓN
En el presente informe de laboratorio da a conocer la importancia la tinción de muestras para luego su observación en el microscopio, tener en cuenta los factores críticos como como su estructura, pH, concentración de electrolitos en la célula cuando existen bacterias de un mismo género en la muestra de estudio, para llevar el proceso de coloración Gram se utilizó la solución de safranina para observar la coloración de las bacterias Gram negativas, teniendo buena eficacia, 
Sin embargo, Guzmán (2001) menciona que para el proceso de coloración de las bacterias Gram negativas que es mas eficiente el uso de Fucsina básica para una mejor observación de este tipo de bacterias. 
En la tinción neutra con muestra sanguínea, se requiere un buen cuidado sin alterar la muestra con agua destilada, es por ello que menciona Sánchez (2017), que hay que tener mucho cuidado para en las muestras para una tinción y debe lavar con agua destilada a mucho cuidado, esto va diferente lo que menciona Guzmán (2001), que no requiere agua destilada para limpiar y solamente usa la aireación como medida de eficacia.
Esto es un poco confuso por la cantidad de fuentes bibliográficas que apoyan a Guzmán, pero al realizar nuestra practica de laboratorio se utilizó de la manera tradicional y efectiva con el uso de agua destilada para su lavado y elimina la coloración excedente y esto trajo resultados favorables donde se evidencia de los eritrocitos y las bacterias Gram negativas al obsevar por laboratorio.
VI. CONCLUSIONES
Se realizó correctamente la tinción neutra y se obtuvo conocimientos acerca de la observación en el microscopio tras el uso de la muestra sanguínea y la presencia de eritrocitos; así también se realizó correctamente la tinción Gram que nos da a conocer la diferencia entre las bacterias de coloración Gram positivos y negativos, mediante el uso de diferentes coloraciones, al observar por microscopio se observa la coloración rojiza de bacterias Gram negativas y la coloración Azul para la observación de bacterias Gram positivas.
VII. BIBLIOGRAFIA
Corrales, L., & Caycedo, L. (2019). Principios fisicoquímicos de los colorantes utilizados en microbiología. 
Guzmán, J. (2001). Las tinciones básicas en el Laboratorio de Microbiología: Un enfoque gráfico. 
López, L., Hernández, M., Colín, C., & Silvestre, O. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de Microbiologia. 
Rodriguez, P., & Arenas, R. (2018). Hans Christian Gram y su tensión. 
Sánchez, L. (2017). Estudio microscópico de microorganismos. 
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