EJERCICIOS RESUELTOS DE MACROMOLÉCULAS-BIOQUIMICA (11)

Vista previa del material en texto

Enzimas. Cinética enzimática
Las enzimas son catalizadores biológicos. Biomoléculas (proteínas, aunque ribozimas) que aceleran reacciones químicas. Disminuyen la energía de activación.
Las enzimas no alteran el equilibrio químico de la reacción entre sustrato (reactivo) y producto.
Presentan cinética de saturación.
Bibliografía de la biblioteca virtual UNL
Principios de Bioquímica (4ª Edición) Capítulo 5, pág. 129
Bioquímica (3ª Edición) Capítulo 11, pág. 403
Bioquímica: libro de texto con aplicaciones clínicas (4ª Edición) Capítulo 10, pág. 413
Para medir actividad enzimática hay que determinar aparición de producto (o desaparición de sustrato) en función del tiempo y calcular la velocidad de la reacción en condiciones de velocidad inicial.
Métodos de medida de actividad enzimática.
Continuos.
Directos.
Reacciones acopladas.
Discontinuos.
Importancia de determinar velocidad inicial y en condiciones donde la enzima es limitante.
Unidad de actividad enzimática (U) = µmol/min En las condiciones especificadas
Diferencia en condiciones para cuantificar una enzima
≠ para cuantificar un sustrato o producto por un método enzimático. Ver Biochemical Education (1997) 25, 106-9.
Figura 1
Tiempo
0
2
4
6
8
10
P
0
2
4
6
8
Figura 2
Tiempo
0
1
2
3
4
5
P
0
1
s1
s3
s2
Cinética de Michaelis-Menten
Modelo cinético-matemático que describe la dependencia de la velocidad de reacción de una enzima con la concentración inicial de sustrato.
La concentración inicial del sustrato es mucho mayor que la concentración total de enzima.
Cinética de Michaelis-Menten
Características generales
Las enzimas son funcionales a muy bajas concentraciones; [enzima] ~ nM
La velocidad inicial es lineal con la [enzima]
La velocidad inicial aumenta con la [sustrato] a [sustrato] bajas.
La velocidad inicial se aproxima a un máximo a [sustrato] altas.
Ecuación de Michaelis-Menten
El concepto de la formación del complejo ES es clave para entender el comportamiento cinético de las enzimas.
En 1903, este comportamiento cinético condujo a Victor Henry a proponer que la enzima se combina con la molécula de sustrato para formar el complejo ES, como paso necesario para la catálisis.
En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten expandieron la idea de Henry en una teoría general sobre la acción de las enzimas. Michaelis y Menten propusieron que:
la enzima primero se combina reversiblemente con su sustrato para formar un complejo ES. Esta etapa es relativamente rápida y reversible.
Luego, el complejo ES se rompe, en una segunda etapa lenta (etapa limitante de la velocidad) para dar el producto y regenerar la enzima libre.
Michaelis-Menten plantean así el modelo del equilibrio rápido. Otra forma es realizar el planteo de Briggs y Haldane, que plantea el modelo del estado estacionario.
https://www.youtube.com/watch?v=6cGdWi_DSGk
Sitio de interés para afianzar conceptos
-Modelo del equilibrio rápido
k2 << k-1
- Modelo del estado estacionario
Sistema de un sustrato
El modelo planteado supone que la enzima interactúa con el S para formar un complejo. Esta situación fue analizada por Leonor Michaelis y Maud Menten, con base en postulados previos de Brown y Henri, para formar la primera teoría de la cinética enzimática, perfeccionada luego por Briggs y Haldane.
Aproximación al equilibrio rápido de Michaelis y Menten
(1)
k-1	k-2
k1	k2	k3
E + S	 ES  EP	 E + P
k-3
ES y EP se denominan complejos centrales y las constantes k son las constantes de velocidad para cada reacción hacia la derecha o izquierda. Para simplificar, se considera como un solo complejo (ES) y se que la velocidad inversa de descomposición del complejo (k-2) es insignificante, [P] = 0. El equilibrio se alcanza rápidamente, dado que k2 es limitante de velocidad.
	k1	k2			
	E + S 	ES 	E + P	(2)	k2 << k1 y k-1
k-1
v = k2 [ES] (3); k2 se denomina constante catalítica de velocidad o kcat
[E]t = [E] + [ES]	(4); dividiendo ambos términos de la ecuación (3) por [E]t
t
 v	k2 ES
E	E ES

(5)
ES
E
S
Ks
K
ES	k - 1
s  ES 	k
1
(6)
El reemplazo se realiza teniendo en cuenta que:
v+1 = k1 [E][S]
v-1 = k-1 [ES]
Sustituyendo en (5) [ES] por su equivalente según (6):
(7)
Eliminando [E] por simplificación y pasando k2 al primer miembro
(8)
Si v = k2 [ES] (3) => la velocidad está limitada por [ES], => el límite máximo de velocidad se encontrará cuando toda la enzima esté formando parte del complejo
ES ([ES] = [E]t), por tanto k2 [E]t = Vmax
(9)
(10)
(11)
E
SE
k
Ks
2 Ks
E SE
v
t

S

Ks
Ks
1 	S
t
k2 E
	v	 
S
S
Ks
Ks
max
1 
	v	 
V
Ks  S
	v	  	S	
Vmax
Ks  S
v  S* Vmax
En el modelo basado en el estado estacionario de Briggs y Haldane la descomposición de ES es rápida en comparación con la interconversión entre E + S y ES, de forma que no se alcanza el equilibrio químico.
Como [S] >> [E] al combinarse E y S se alcanza el estado estacionario, como se muestra en la figura.
Comparación entre las dos aproximaciones
1
K '
k
 	1
k
S
Km  [S ]
Vm [S ]
v 
Vm  k 2 [E0 ]
k1
	k1  k2
m
K
Michaelis-Menten
k1[E][S]k1[ES]
Si k2 << k-1,
2
1
k1
k	 k
Km	 KS 
 [S ]
Vm [S ]
m
K '
v 
m
2
V	 k	[E]T
Briggs-Haldane
d[ES]/dt ≈ 0
Postulado:
Ecuación:
Velocidad máxima de la reacción:
Constante:
No recambio
Eficiencia catalítica
Vmax
kcat = Vmax/[E]T
Significado de Km
Km es un parámetro cinético que está relacionado con
Ks = [E][S]/[ES], pero Km	= (k-1 + k2)/k1. La medida de Km no depende del grado de pureza de la enzima (*).
Km guarda relación con la constante de disociación del complejo ES. Es una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato; pero es la recíproca de tal afinidad.
En el caso que k1, k-1 >> k2, resulta que Km = Ks.
Km es la concentración de sustrato que se requiere para alcanzar la mitad de la velocidad máxima. (Vmax/2). Que Km sea pequeña significa que el sustrato satura a la enzima a concentraciones menores.
Significado de Vmax
Vmax es la velocidad cuando toda la enzima está como ES. Matemáticamente es una asíntota, de modo que experimentalmente Vmax se estima, pero no se puede “medir”. Se expresa en U/mg. Es un parámetro que debe determinarse sobre la enzima pura (*).
Comparar esto con la actividad específica en las tablas de purificación.
Al igual que Km, la Vmax es una constante que depende de la temperatura, del pH, de la fuerza iónica y demás condiciones del medio. Estos parámetros cinéticos deben expresarse con las unidades correspondientes y se deben especificar todas las condiciones de la determinación de los mismos.
Isoenzimas
Proteínas distintas (difieren
en estructura primaria)
que catalizan la
misma reacción. Se pueden encontrar isoenzimas dentro de un mismo tejido.
(*)
Significado de kcat
Vmax = kcat [E]T
kcat = k2, es la constante de velocidad de primer orden de la etapa catalítica. Tiene unidades de recíproca de tiempo.
kcat es el número de recambio “turnover number”, que indica la velocidad a la cual la enzima recambia sustrato. Es el número de moléculas de sustrato que son convertidas por sitio catalítico por unidad de tiempo.
También es un parámetro que depende de la temperatura, el pH, la fuerza iónica y demás condiciones del medio.
Significado de kcat/Km
kcat/Km es la eficiencia catalítica. Sirve para establecer cuán buen catalizador es una enzima. Si kcat/Km es elevada significa que la enzima tiene relativamente alta afinidad para unir sustrato y que la reacción de formación de producto a partir del complejo ES es rápida.
•
kcat/Km
es una constante aparente de velocidad de
segundo orden. Tiene unidades de recíprocas de tiempo por concentración
•
kcat/Km
es una constante de especificidad que puede
utilizarse para distinguir con qué grado de eficiencia una enzima puede utilizar distintos sustratos.
Parámetros cinéticos
E
 Vmax
k
cat
Constante Michaeliana: (relacionado a la etapa de unión del sustrato)
Constante Catalítica: (relacionado a la etapa catalítica)
EficienciaCatalítica:
(relacionado a ambas etapas)
Cinética de Michaelis-Menten
v  Vm	(orden cero)
(orden intermedio)
(orden uno)
Km  S
v 	Vm  S
Km
v  Vm  S
Derivaciones lineales de la ecuación de Michaelis- Menten.
Gráfico de Lineweaver–Burk:
Tiene el inconveniente que la recta es altamente dependiente de los valores de velocidad a bajas concentraciones de sustrato, donde hay mayor error experimental.
Eadie-Hofstee	Otra forma de linelización: Reordenando la ecuación de MM
Gráfico
v0	versus	v0/[S]
v
0
v0 /[S]
Vmax
slope = -Km
Vmax/Km
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
Valores de Km y kcat para algunas enzimas
Determinar la eficiencia catalítica es particularmente útil para enzimas con promiscuidad para el uso de sustratos
Cooperatividad positiva o negativa
La unión de una molécula de sustrato afecta la interacción de una segunda.
Si la unión de la segunda se favorece hay cooperatividad positiva.
Si la unión de la segunda se entorpece hay cooperatividad negativa.
log (V/Vmax) vs.	log [S]
Cinética enzimática.
Parámetros cinéticos.
Cinéticas hiperbólicas o “michaelianas”
Significado de Ks Km Vmax
kcat kcat/Km
Número de recambio Eficiencia catalítica
Cinéticas sigmoideas, cooperatividad, alosterismo.
S0,5
nH
Valores de Km y kcat para algunas enzimas
Determinar la eficiencia catalítica es particularmente útil para enzimas con promiscuidad para el uso de sustratos
Activadores. Ligandos de una enzima, que no son modificados durante la catálisis y que incrementan la actividad de la misma. Pueden ser:
- Esenciales. En su ausencia no hay actividad catalítica. Cinéticamente son tratados como sustratos.
- No-esenciales. En su ausencia la enzima es activa.
Pueden ser de tipo V, K o V/K. Cinéticamente se analizan considerando el incremento de velocidad a distintas concentraciones del activador.
Inhibidores. Compuestos que inhiben la actividad de una enzima. Pueden ser:
Irreversibles. Cuando se unen covalentemente (o muy fuertemente) a la proteína (en este caso se habla de inactivación). Importantes para modificación química.
Reversibles. Cuando se unen de tal forma a la proteína (pueden
separarse por diálisis). Pueden ser de 4 tipos principales: competitivos, no-competitivos, mixtos o acompetitivos.
Se determina Ka o A0,5 (en forma análoga a lo referente a sustrato).
También veces de activación, determinando
el valor de Vmax (o Km) en presencia y ausencia del
activador.
Cuando es esencial se puede obtener considerando variación de v en función de [A].
Cuando es no esencial hay que utilizar ∆v.
Inhibidores Reversibles (interacción no-covalente) útiles para estudiar mecanismos, regulación y desarrollar fármacos
Irreversibles (interacción covalente o muy fuerte) útiles para modificación química, identificación de dominios estructurales y desarrollar fármacos
Inhibidores reversibles.
Competitivo No-competitivo Mixto
Acompetitivo
Biochem. Mol. Biol. Educ. (2000) 28, 332-337
Parámetros cinéticos.
I0,5
KI
Inhibidores reversibles
JNK-ATP Noncompetitive Inhibitors
Inhibidor competitivo
Igual Vmax	Aumenta Km	K´m= Km (1 + [I]/KI) Disminuye la afinidad aparente de la enzima por el sustrato
Inhibidor no-competitivo
Igual Km	Disminuye Vmax	V´max = Vmax / (1 + [I]/KI) No cambia la afinidad aparente de la enzima por el sustrato
Inhibidor mixto
mezcla de competitivo y no- competitivo, disminuye Vmax y aumenta Km
Inhibidor acompetitivo
Disminuye Vmax	V´max = Vmax/ (1 + [I]/KI) Disminuye Km	K´m= Km / (1 + [I]/KI)
Aumenta la afinidad aparente de la enzima por el sustrato. Disminuye ambos parámetros en la misma proporción.
Modelo de acción de un activador (reversible)
Tipo K/V
Tipo V
Tipo K
Cuando la inhibición es reversible, excepto en algunos casos especiales, generalmente se llega a un equilibrio rápido entre el inhibidor y la enzima, y si se determina la velocidad	de la reacción inhibida a distintos tiempos, no varía.
En cambio cuando la inhibición es irreversible, el inhibidor inactiva progresivamente la enzima, pudiendo llegar a la inactivación completa. La velocidad de la enzima inhibida varía con el tiempo.
-
El estudio no se hace poniendo inhibidor irreversible en el medio de ensayo de actividad, sino preincubando la enzima con el inhibidor y sacando alícuotas a distintos tiempos para ensayar la actividad de la enzima. Se realiza la cinética de modificación covalente de la enzima.
La caracterización de estos inhibidores se realiza asumiendo distintos modelos. Uno de ellos :
Si se representa	ln	Ea / E0 vs t: la pendiente es :
pend = k2 / [1+ (KI / [I])]
Para calcular cada parámetro individualmente	se efectúa una segunda representación , la inversa de la pendiente en función de la inversa de [I]:
1/pend = 1 / k2 + KI / k2 [I]
de cuya ordenada y pendiente se pueden obtener k2 y Ki
Inhibidores irreversibles que son análogos de sustrato
Inhibidores irreversibles que son análogos de sustrato
Inhibidor “suicida” Basado en el mecanismo de reacción
Uso de la modificación química (con inhibidores irreversibles) como herramienta de identificación de dominios de actividad. Activity- Based Protein Profiling (ABPP)
Mecanismos de regulación de la actividad enzimática
Algunas enzimas se sintetizan en forma inactiva (zimógenos) y luego experimentas proteólisis específica para tornarse activas. Ej. tripsina.
En algunos casos se controla el nivel de la enzima por inducción o represión de su síntesis proteica. Regulación relativamente lenta y grosera.
Modulación por metabolitos que activan o inhiben la enzima. Hay ejemplos de regulación de tipo alostérica. Mecanismo relativamente rápido y fino.
Por modificación covalente de la enzima que producen su activación o inhibición. Las respuestas de acción hormonal cursan en general por estos mecanismos. En general la regulación es de tipo todo o nada. Ej. fosforilación, oxido-reducción de –SH. En algunos casos la modificación es también señal para cambiar la estabilidad de la proteína.
Las enzimas regulatorias generalmente son las involucradas en el primer paso de una vía metabólica.
La regulación es más efectiva, en términos de economía celular, si se regula el primer paso exclusivo de la ruta metabólica.
Algunas enzimas se sintetizan en forma inactiva (zimógenos) y luego experimentan proteólisis específica para tornarse activas. Ej. quimotripsina.
Modulación por metabolitos que activan o inhiben la enzima. Hay ejemplos de regulación de tipo alostérica. Mecanismo relativamente rápido y fino. Ej. Aspartato transcarbamoilasa
Por modificación covalente (post-traducción) de la enzima que producen su activación o inhibición. Las respuestas de acción hormonal cursan en general por estos mecanismos. En general la regulación es de tipo todo o nada.
Ej. fosforilación.
También hay regulación por interacción con proteínas específicas. Esta última puede darse en forma directa o después que la enzima ha sido modificada post- traducción. En general participan también cationes divalentes
En algunos casos la modificación es también señal para cambiar la estabilidad de la proteína.
Dependencia de la velocidad con el pH
La velocidad de reacción en general varía con el pH de acuerdo a una curva en campana, como la que se observa en la figura para la glucosa 6-fosfatasa
Este comportamiento se debe a:
Efectos (en muchos casos irreversibles) de los pHs extremos sobre la estructura de la enzima.
Efectos sobre la disociación del sustrato.
Efectos sobre la disociación de residuos de la enzima y su reactividad en la catálisis




 E
EH	S 
EH
EH  S
EH 	
K
K
 S
ES
KS  S
a 2
a1
H	H
Ka1 	Ka 2 
k2 
EH  P
2
2
S 
Los efectos debido a disociación ácido /base de residuos importantes para la unión y/o catálisis, se pueden interpretar en base a un modelo cinético; en el mismo se asume por simplicidad que habría dosprotones ionizables que conducirían a que la enzima se presente en tres estados de ionización .
Las curvas en campana típicas se pueden interpretar en base a este modelo asumiendo que la forma intermedia de ionización es la que posee la mayor capacidad de unión y/o catálisis.
El comportamiento de ciertas enzimas. Como le de la pepsina se puede interpretar también en base a ese modelo, pero asumiendo que la forma activa es la totalmente protonada.
Efecto del pH y la temperatura sobre la estabilidad y la actividad de enzimas.
Q10: Parámetro semicuantitativo que mide el efecto de T sobre una enzima
Un Q10 de 2 es equivalente a una Ea de ~12.600 cal/mol para la zona de 25 ºC a 35 ºC
Salvo para el caso de las hidrolasas, casi todas las enzimas transforman más de un sustrato para dar más de un producto
William Wallace Cleland (1930-2013), often cited as W. W. Cleland, was a University of Wisconsin-Madison biochemistry professor. His research focused on enzyme reaction mechanism and enzyme kinetics, especially
multiple-substrate enzymes.
Las transaminasas usan fosfato de piridoxal (forma activa de la vitamina B6) como cofactor enzimático
Rapid equilibrium random Bi Bi
Rapid equilibrium random Bi Bi
Ordered Bi Bi
Ordered Bi Bi
Ordered Bi Bi
Ping-Pong Bi Bi
Ping-Pong Bi Bi
Increasing V; V/Km unchanged
Increasing V and V/Km
Effects of Substrate Concentration Distinguish Sequential
vs. Ping-Pong Kinetic Mechanisms in Multi-Substrate Enzymes
For further details we need to look at the effects of product inhibition…
Product Inhibition in Multi-Substrate Systems
The Random Sequential Mechanism
In a typical reaction of this type the two substrates are bound to the active site and a section of one substrate is transferred to the other to create the products:
Substrates bind in no specified order;
Products release in no specified order.
Not allowed:
EA + P <=> (EAP) EB + Q <=> (EBQ)
EB + P <=> (EPB) should form readily:
EA + Q <=> (EAQ) may or may not form depending on sterics of the transferred side group:
NO
YES, but weaker?
Product Inhibition Patterns for Ordered Sequential BiBi
	Variable Substrate	Product Inhibitor	Inhibition at
Normal Levels
of Fixed Substrate	Inhibition at
Saturating Levels of Fixed Substrate
	A	P	Non-competitive	Uncompetitive
	A	Q	Competitive	Competitive
	B	P	Non-competitive	Non-competitive
	B	Q	Non-competitive	None
Product Inhibition Patterns for Random Sequential BiBi
	Variable
Substrate	Product
Inhibitor	Inhibition Type
	A	P	Competitive
	A	Q	Competitive or
Non-competitive
	B	P	Non-competitive
	B	Q	Competitive
Product Inhibition Patterns for Ping-Pong BiBi
	Variable
Substrate	Product
Inhibitor	Inhibition Type
	A	P	Non-competitive
	A	Q	Competitive
	B	P	Competitive
	B	Q	Non-competitive
COMPARISON:	Product Inhibition Patterns for BiBi Mechanisms
	Variable
Substrate		Product
Inhibitor	Ordered
Sequential				Random
Sequential			Ping-Pong		
	-	-	-	-	-	-	-	--	-	-	--	--	-
A
P
Competitive
Non-competitive
Non-competitive
/Uncompetitive*
A
Q
Competitive
Competitive or
Non-competitive
Competitive
B
P
Non-competitive
Non-competitive
Competitive
B
Q
Non-competitive
/None*
Competitive	Non-competitive
* At very high concentrations of fixed substrate.
-	-	-	-	-	-	-	--	-	-	--	--	-
Patterns easily distinguish between ordered and random sequential mechanisms.
For ordered sequential, patterns establish binding order since the substrate/product pair showing competitive inhibition represent the first substrate to bind and the last
product to leave the enzyme.
With a random sequential mechanism the type of inhibition found with the A/Q pairing gives us some information about the physical interaction between ligands and enzyme.
The pattern with a ping-pong enzyme is similar to one of the possibilities with a
random sequential enzyme (two competitive and two non-competitive). However, these mechanisms are easily distinguished by substrate concentration studies.
Equilibrios de Uniones Múltiples
Bioquímica Básica de Macromoléculas
Ligando: se refiere a alguna molécula que se une a otra molécula.
–	En bioquímica el término ligando se refiere a una pequeña molécula (baja masa molecular), tal como un compuesto orgánico, el cual se une a una macromolécula (como una proteína).
La macromolécula en muchos casos se refiere como el receptor del ligando.
Reconocimiento molecular.
Ejemplos de interacciones no covalentes.
Funciones de las proteínas
Catálisis (enzimas):
–enolasa (glicólisis)
–DNA polimerasa (replicación del DNA)
Transporte:
–hemoglobina (transporte de O2)
–lactosa permeasa (transporte de lactosa)
Estructura:
–colageno (tejido conectivo)
–queratina (pelo, uñas, plumas, cuernos)
Movimiento:
–miosina (tejido muscular)
–actina (tejido muscular, movilidad celular)
Defensa:
-inmunoglobulinas
-citoquinas
Nutrientes y de almacenamiento
-ovoalbúmina
-caseína
Reconocimiento y señalización:
–insulina (regulación de glucosa en sangre)
–Proteina G (transducción de señales)
–Inmunoglobulina G (anticuerpo)
–Proteínas de unión a ADN/ARN
Afinidad y especificidad en las interacciones moleculares
La afinidad de una interacción molecular refiere a su fuerza. Cuanto menor sea el ∆G° resultante del proceso de unión, mayor va a ser la afinidad de la misma.
La especificidad de una interacción refiere a la fuerza relativa de la interacción entre una macromolécula y ligandos alternativos.
En una interacción altamente específica el ∆G° de unión es mucho más negativo que para una menos específica.
Las interacciones biológicamente relevantes son usualmente altamente específicas.
Proteínas funcionales
Reconocen y unen ligandos	específicos
FUNCIÓN
Pero… en muchas ocasiones una misma macromolécula puede reconocer y unir más de un ligando de una misma clase, y a la vez múltiples ligandos de distinta clase.
 Cambios en su funcionalidad
Equilibrio de unión múltiple: Existencia de más de un sitio de unión
Muchos sitios iguales semejantes para un mismo tipo o distintos tipos de ligando (5 o más)
Pocos sitios iguales para un mismo ligando o distintos ligandos (entre 2 y 5)
Especificidad de grupo (detergentes, colorantes,etc)
Unión bioespecífica
Interacciones alostéricas
Equilibrio de unión múltiple
P + n L  PLn
Cuando se estudia un sistema de equilibrio de unión,	se desea conocer:
La constante de equilibrio de unión.
El número de sitios de unión, si son iguales o distintos.
Si existen fenómenos alostéricos en la unión.
Si la afinidad por un ligando se modifica con el grado de saturación con el mismo ligando o con un ligando diferente (cooperativismo).
Si los efectos alostéricos presenta efecto cooperativo.
Si	para	un	ligando	“A”	hay	“n”	sitios	de	unión	existirían	n constantes de equilibrio macroscópicas.
“A”	es	el	ligando	y	las	Kn	son	constantes	macroscópicas	de equilibrio de disociación	de cada unión.
Unión múltiple de ligandos idénticos
Relación entre constantes macro y microscópicas
Por ejemplo, si n = 4 , existirá el siguiente número de especies microscópicas diferentes de acuerdo al número total de sitios ocupados por molécula:
4 cuando hay un ligando unido.
6 cuando hay dos ligandos
4 cuando hay tres ligandos unidos
1 cuando hay cuatro ligandos unidos
Cada	constante		microscópica	es	función	de		las concentraciones	de	las	especies	microscópicas	y		las
respectivas constantes
macroscópicas	son	función	de	las	concentraciones
totales
correspondientes a cada grado de saturación. Por ejemplo:
k 1=	[EA]1 / [E][A]
1
K1= ([EA]1+[EA]2+[EA]3 +[EA]4) / [E][A]
Si los sitios son iguales, la relación entre Ki (macro) y ki (micro):
Ki = ki (n - i +1)	(constantes de asociación) i
¿Qué se puede determinar?
¿Cómo se pueden obtener los datos experimentales?
¿Cómo se pueden utilizar para conocer lo que deseamos?
Se puede determinar:
la función de unión (ν) el promedio de ligandos asociados (o promediode sitios ocupados) por macromolécula)
Alternativamente, la función θ (o f), el grado de saturación o fracción de saturación: promedio de sitios ocupados
Si se parte de una [total de macromolécula] y una [total de ligando] conocidas, se deja que el sistema llegue al equilibrio y en ese momento se puede determinar, ya sea el ligando libre en equilibrio o el ligando asociado, sabiendo que [L]total = [L]libre + [PL]
Si se conoce el número de sitios de unión, n:
ya que concentración de ligando asociado = concentración de sitios ocupados y concentración de sitios totales = n x concentración de macromolécula. El grado (o fracción) de saturación es la proporción de sitios totales ocupados por ligandos.
Isoterma de unión
Son una serie de mediciones de la función de unión () o del grado de saturación ( o f) en función de la concentración de ligando (L).
Estas mediciones pueden ser utilizadas para estimar la constante de disociación (KD) solo si las mediciones de equilibrio de unión son realizadas a la misma temperatura.
–	En vista de esto es por lo que se llama isoterma.
¿Cómo	se	puede	medir	la	concentración	de ligando asociado o libre en equilibrio?
Métodos inmunoquímicos
ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
Equilibrio de diálisis
Filtración por geles
Electroforesis capilar de afinidad
Espectroscopía de absorción o de fluorescencia
Cromatografia	de	filtración	por	geles,	de	afinidad,	o similares
Algunos métodos permiten medir, sin separar físicamente, la concentración de ligando libre o asociado respectivamente.
Por ejemplo electroforesis de afinidad, intensidad de emisión de fluorescencia.
Cuando se cuenta con un método de determinación del ligando, que generalmente no discrimina lo libre de lo asociado, es necesario separarlos por alguna metodología y luego evaluar uno u otro.
Se pueden separar por ultrafiltración, filtración por geles, o por inmovilización de uno de los componentes en una fase sólida (ELISA, cromatografía de afinidad).
Equilibrio de diálisis
10
20	30
40
50
60
tiempo (min)
Conc FBP=0uM
Conc FBP=10uM Conc FBP=20uM
Conc FBP=40uM Conc FBP=250uM
Conc FBP=500uM
Electroforesis capilar de afinidad:
unión de un ligando a la enzima
Geles de retardo:
unión de proteínas a ADN (electroforesis nativa)
Emisión de fluorescencia: unión de un compuesto fluorescente a una proteína.
280
350
420
490
0
35
70
105
Ex = 280 nm (~25 °C)
TcPICOT10034N 5 M
F
	(nm)
Em
+ DTT 1 mM
+ GSH 1 mM
+ GSSG 0,5 mM
+ DTT 0,1 mM + GSSG 1 mM
0
200
800	1000
42
43
44
45
46
47
Red
TcPICOT10034N	1 M
TRIS-HCl 100 pH 7,5
EDTA 1 mM
Ex
	= 280 nm (25 °C)
kd = 80 ± 14 mM
n = 0.9 ± 0.1
F
350 nm
400	600
[GSH] (M)
Emisión de fluorescencia: cambio de fluorescencia	intrínseca de la proteína por unión de un compuesto no fluorescente.
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
Es una técnica experimental calorimétrica que permite determinar cuantitativamente de manera directa la entalpía de unión de una molécula o de un complejo molecular mediante la medición del calor liberado o absorbido a presión constante durante una reacción diseñada específicamente para la experiencia.
Mediante ITC se puede determinar la constante de afinidad (Ka), los cambios de entalpía (ΔH) y la estequiometría de enlace (n) de la interacción entre dos o más moléculas en solución. A partir de esto se puede determinar el cambio de energía libre de Gibbs (ΔG) y el cambio de entropía (ΔS) a temperatura y presión constante.
H
Es necesario plantear modelos de unión simplificados.
Se asume que los ligandos son iguales, y	se pueden unir a la macromolécula a través de:
Sitios	iguales	(o	equivalentes)	y	sin	interacción (o independientes).
Sitios	iguales	con	efectos	cooperativos	(con interacción).
Sitios distintos sin interacción.
¿Cómo se procesan y analizan los datos experimentales?
Modelo sencillo: uniones homotrópicas, dos sitios.
L 2
1	2
1
2
1	1	2
L	 K K		
1 K 	
K L 2K K	L
	
Para n sitios:
n	i
iLi  Kj
i1	j 1
	
1
	
i
i
L	Kj
j 1
n
	
i1
En función de las constantes macroscópicas (Ki):
M  L  ML ML  L  ML2
macromoléculatotal
 	ligando.asociado 
ML 2ML2 
M  ML ML2 
M L
ML
1
K	
MLL
	ML2 
K
2
2kL
	
1 kL
nkL
1 kL
	
2
1	1	2
2
1	2
1
L k k	L
1 k 
2k L 2k k	L
	
En función de las constantes microscópicas de asociación (ki):
Si los sitios son iguales, las constantes microscópicas lo son :
1	2
k1 = k1	= k1
1	2
y	k2	= k2	= k2
y además teniendo en cuenta la relación de las constantes macro y micro: como
K1= 2k1	y	K2 =	k2/2
La función queda:
Si, además de ser iguales, son independientes:
k1 =	k2 = k
y se obtiene la función :
Nótese que las constantes son de asociación.
Forma general 
		nkL
1 kL
Representaciones para obtener parámetros
Representación directa
Dobles recíprocos
Tener en cuenta que:
Scatchard
disociación
asociación
k
1
k	
Si la representación directa no es una hipérbola rectangular, o las otras representaciones no son lineales en todo el rango, significa que:
o los sitios no son iguales
o no son independientes
Si no hay efectos cooperativos, las constantes	intrínsecas	de asociación correspondientes a sucesivos grados de saturación, son iguales
(k1= k2 =….= kn)
Si hay efectos cooperativos positivos:
k1 < k2 < …. < kn
Si hay efectos cooperativos negativos:
k1 > k2 > …. > kn
Unión a sitios distintos sin interacción
n sitios distintos
Si se puede definir una constante de afinidad intrínseca promedio (k):
a, índice de heterogeneidad
Si a = 1 no existe heterogeneidad
Si a < 1 existe heterogeneidad en torno a k
La ecuación presenta la misma forma que la de Hill. Por lo tanto el ajuste de lo datos experimentales es similar y no se puede diferenciar del caso de sitios iguales con interacción negativa. Pero en este caso el coeficiente al que se eleva la concentración tiene un significado distinto al nH, si es < 1 indica que hay heterogeneidad.
La unión antígeno-anticuerpo
La	unión	Ag-Ac	de	anticuerpos	policlonales	se	puede	estudiar como un modelo equivalente de sitios distintos sin interacción.
La unión Ag-Ac de anticuerpos monoclonales se corresponde a un modelo de sitios iguales e independientes (sin interacción).
Gráficos de Scatchard típicos para anticuerpos policlonales (heterogéneos) y monoclonales (homogéneos).
Alosterismo
El alosterismo (de griego ἄλλως, allos: otro y στερεός, stereós: forma) es un fenómeno por el que la unión de una molécula en una ubicación (sitio alostérico) modifica las condiciones de unión de otro ligando, en otra ubicación (por ejemplo, el sitio activo) de la proteína distante del primero.
Este concepto	lo	plantearon Jacques	Monod,	Jeffries	Wyman y	Jean- Pierre Changeux en 1965.
Interacciones alostéricas
Interacciones entre ligandos unidos en sitios distantes, mediadas por cambios dinámicos-conformacionales reversibles.
Los ligandos en general se unen en forma bioespecífica.
Para un mismo tipo de ligando o ligandos de distinto tipo, la unión alostérica podría ocurrir en un sitio (o sitios) para cada ligando diferente al de referencia (por ejemplo, el sitio activo de una enzima)
No todas las proteínas oligoméricas que presentan múltiples sitios de unión, necesariamente poseen efectos cooperativos.
–	Las proteínas que presentan efecto cooperativo, sobre un mismo tipo de sitio de unión, generalmente son oligoméricas. Las interacciones se transmiten de una subunidad a otra.
Unión con efectos cooperativos
Efectos homotrópicos
la unión de x afecta la unión de x en otro sitio.
Generalmente	se	manifiestan	en	forma	cooperativa subunidades.
entre
Efectos heterotrópicos
la unión de y afecta la unión de x en otro sitio.
Ambos pueden ser positivos o negativos.
Los efectos heterotrópicos	están “ligados”, o sea son recíprocos:
si y es cooperativo positivo de x, x es cooperativo positivo de y.
Efecto homotrópicocooperativo
Las curvas sigmoidales son indicativas efectos cooperativos.
El ligando ejerce un efecto cooperativo homotrópico promoviendo la unión (aumento de la afinidad) de otra molécula del mismo ligando en otro sitio de unión presente en la misma proteína.
M
MX	kYX
MXY
kX
kY
kXY
MY
El ∆G de la reacción completa no depende del camino, por lo que:
kX.kYX = kY.kXY. o lo que es lo mismo:
kYX/kY = kXY/kX
Si la constante de unión de X no se modifica por la unión previa de Y, lo recíproco también se cumple, en este caso no hay efectos cooperativos.
Si la unión previa de Y aumenta o disminuye la constante de unión de X (lo recíproco ocurre para Y), esto es un efecto cooperativo heterotrópico.
Para entender por qué decimos que los efectos cooperativos heterotrópicos están ligados se puede analizar el siguiente modelo:
M es la macromolécula libre, que posee un sitio de unión para cada ligando X e Y; kx y ky son las constantes de unión de X e Y a M libre, respectivamente; kxy y kyx son las constantes de unión de X e Y, respectivamente cuando ya está el otro ligando asociado.
La ecuación de Hill
nknH LnH
	
1 k nH LnH
Describe la fracción de la macromolécula saturada por el ligando como una función de la concentración de ligando; se utiliza en la determinación del grado de cooperatividad de la unión a la enzima o receptor ligando.
Fue formulada por Archibald Hill en 1910 para describir la curva de unión de O2 de la hemoglobina.
nH
nLnH
 L
nH d
k
	
El nH (coeficiente de Hill) es indicativo del tipo de interacción.
siempre es menor que n (números de sitios de unión).
si nH= 1, no hay efectos cooperativos
si nH > 1, hay efectos cooperativos positivos
si nH <1 hay efectos cooperativos negativos (o los sitios son distintos)
El	modelo	se	adecua	mejor	cuando	hay	fuertes	efectos	cooperativos positivos.
  nH log k  nH logL

log

 n  

  nH log k  nH logL
	
1 
log	
Deben considerarse los datos de la zona cercana al 50% de saturación.
La representación logarítmica de Hill es útil para evaluar el tipo de unión.
Modelos para proteínas alostéricas: el modelo concertado de Monod, Wyman y Changeaux.
Este modelo es útil para caracterizar proteínas con efectos cooperativos homotrópicos positivos (no para homotrópicos negativos) y efectos heterotrópicos positivos y negativos.
La proteína está constituida por un número par de subunidades idénticas denominadas protómeros, cada una con su sitio de unión.
La proteína puede existir en dos conformaciones distintas, la “R”, de alta afinidad por su ligando específico y la “T”, de baja afinidad.
kT asoc << kR asoc
En ausencia de ligando ambos estados simbolizados como T0 y R0 están en equilibrio y la macromolécula está preferentemente en el estado de menor afinidad:
T0  R0	y debe ser L = [T0]/[R0] >>1
Las formas R y T son inter-convertibles, pero la transición está concertada, o sea que siempre todas las subunidades deben estar en el mismo estado, y las formas mixtas no son permitidas. Si por simplicidad se considera un dímero:
Si se considera un dímero y una situación extrema de relación de las constantes de afinidad a los estados: kR/kT (no se une a T), la función queda:
Si L es pequeño, la función se hace más hiperbólica , con lo que se aproxima a sitios iguales sin efectos cooperativos; y viceversa, si L es grande, se torna más sigmoidal.
2
R
L  1 k	L
	 2kR L(1 kR L)
En	este	modelo,	los	efectores
heterotrópicos modifican el valor de L:
- Si son positivos, estabilizan el estado R y disminuyen L
-	Si	son	negativos,	estabilizan	T	y
aumentan L.
Si directamente no se une al estado T, c = 0, entonces:
Modelo concertado para un tetrámero que une al ligando “A”
aquí las kR y kT son constantes de disociación
L = [T0]/[R0]	>> 1
Lc 1 c n1   (1  )n1
L1 c n  1  n
	
kT
c  kR 1
kR
  [ A]
 (1  )n1
L  1  n
	
[ A]n1
k

	R	

[ A] n
L  1
k

	R		R 	
1 k
[ A] 
 
El modelo secuencial
se puede aplicar para sistemas con efectos homotrópicos	positivos o negativos
La hemoglobina y la mioglobina
Son proteínas de unión a oxígeno, pero con distintas funciones, y distintas características de unión. Ambas unen O2 en el grupo prostético hemo.
	Hemoglobina: transporte	Mioglobina:
reserva
	Tetrámero: n = 4	Monómero: n = 1
	Efecto homotrópico positivo con el oxígeno nH = 2.7	Sin efectos cooperativos
	Efectos heterotrópicos negativos:
ácido 2,3-bisfosfoglicérico, H+, CO2	
La Hb presenta un fuerte efecto cooperativo homotrópico en su unión con el O2
El efecto homotrópico con el O2 le permite a la hemoglobina cumplir más eficientemente la función de transporte
50	2
  nH log P	 nH log PO
	
 1 
log	
Cuando aumenta la PCO2, o disminuye el pH, disminuye la saturación con O2 (en los tejidos libera más oxígeno)
Los efectores heterotrópicos : H+, CO2 y BFG contribuyen a la función de transporte, de acuerdo a las variaciones fisiológicas de los mismos
El monóxido es un potente tóxico, que se une con más afinidad al mismo sitio que el O2 y actúa como un efector positivo, dificultando la liberación de oxígeno a bajas presiones (en los tejidos)
Ejemplos de proteínas reguladas alostéricamente
Hemoglobina
Aspartato transcarbamilasa
Aspartoquinasa
Fosfofructoquinasa
ADP-glucosa pirosfosforilasa
Glucógeno sintasa
Receptor de nicotínico/acetilcolina
Aspartato transcarbamilasa
Ejemplos de sitios web con descripción de la regulación alostérica de la enzima:
https://www.youtube.com/watch?v=PmDX52dA4hw
http://bioqss.byethost15.com/jmol2014/jsmol/ATCasa/ATCasajs.html?i=1
La existencia de sitios distintos (alostéricos) de unión de la Fru6P y del Pyr fue evidenciada por (entre otros) estudios de mutagénesis dirigida y cristalización en presencia de los efectores
REGULACIÓN DEL METABOLISMO
REGULACIÓN ACTIVIDAD FUNCIONAL
Control de la cantidad de sustratos/ligandos (regulación fina)
Cantidad/disponibilidad de la proteína (regulación lenta/gruesa)
Síntesis (expresión génica) Recambio (degradación) Localización celular/tisular
Alteración de la eficiencia funcional (regulación rápida)
Inhibición reversible por Sust./Prod./Inhib. (control de la cinética enzimática) Regulación alostérica (control de la unión de ligandos/cinética enzimática) Unión a proteínas regulatorias (switch on/off)
Modificación covalente (switch on/off)
Escisión proteolítica (switch on/off)
Por ejemplo, la inhibición por retroalimentación (feed-back)
La conversión de L-treonina a L-isoleucina es catalizada por una secuencia de cinco enzimas. La primera (treonina dehidratasa) es inhibida alostéricamente por la isoleucina, el último producto de la secuencia.
El triptofano, producto final inhibe alostéricamente la primer enzima (a) de la secuencia.