INFORME DE LABORATORIO. MEDIOS DE CULTIVO

Vista previa del material en texto

PRÁCTICA 03
MEDIOS DE CULTIVO
I. INTRODUCCIÓN
En la actualidad se pueden cultivar, fuera de su hábitat normal, la mayoría de microorganismos heterótrofos (a cuyo grupo pertenecen los gérmenes patógenos). Por eso hay que destacar la importancia de la preparación y selección adecuada de los medios de cultivo.
Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes, en la que crecen y se multiplican los organismos en el laboratorio, con el objetivo de aislar las diferentes especies bacterianas, para luego proceder con su identificación y llevar a cabo con una serie de estudios complementarios.
Los medios de cultivos empleados para el desarrollo de microorganismos, deben prevalecer en condiciones adecuadas de humedad para un buen crecimiento de las células vegetativas.
De igual manera, el pH del cultivo es extremadamente importante para el crecimiento de los organismos. La mayoría de éstos se desarrollan en medios que sean aproximadamente neutros, mientras que otros prefieren un medio que sea más o menos ácido.
La temperatura normalmente adecuada para le crecimiento de microorganismos mesófilos está entre los 15 y 43 °C. En cambio, los organismos, psicrófilos se desarrollan a 0°C, y otros, como los termófilos, pueden crecer a 80°C. Los microorganismos, patógenos en general, están limitados por una escala de temperatura, comparativamente estrecha, alrededor de los 37°C, mientras que los saprófitos la tienen mucho más amplia.
Medios de cultivo granulados:
Los medios de cultivo deshidratado se preparan, salvo excepciones, como granulados.
A partir de las correspondientes materias primas, y mediante molienda y mezclado, se prepara en primer lugar una mezcla homogénea, finalmente pulverizada. Esta mezcla se somete después a procesos de granulación. Ello supone aglutinar la mezcla polvorienta en pequeños grumos, consiguiendo simultáneamente reducción de un gran contenido de humedad.
Los medios de cultivo de forma granulada ofrecen una serie de ventajas frente a los tradicionales medios de polvo:
· La escasísima liberación de partículas (producción de polvo) durante la manipulación, reduciendo considerablemente a la alergenización o respiración de sustancias tóxicas.
· La mayor fluidez del producto impide su adherencia a las paredes del recipiente o aparatos. La pesada resulta más fácil.
· Buena humectabilidad del gránulo con agua, lo cual acelera el proceso de humectación o disolución. No se forman gránulos difícilmente solubles.
· La distribución física homogénea de los componentes de la fórmula y el mantenimiento de dicha distribución en el granulo también es valiosa cuando el almacenamiento haya de ser prolongado. Gracias a ellos no se producen en ellos efectos indeseables de “desmezclamiento”.
· Mejor conservación, favorecida por:
· El escaso contenido de humedad
· El envase de vidrio como protección frente a la entrada de vapor de agua.
· La distribución uniforme y constante de componentes de la formula.
Debido a su particular composición, algunos medios de cultivo se presentan como granulado muy fino. También para estos medios de cultivo se aplican las ventajas ya citadas en especial las relativas a la fluidez y distribución homogénea de sus componentes.
 
Almacenamiento:
Dentro de los posible, los medios de cultivo deshidratado deberán conservarse en lugar seco, protegido contra la luz, a una temperatura de entre 15 – 30°C, y en envases siempre bien cerrados. Inmediatamente después de haber retirado de los envases la cantidad de medio de cultivo que se necesite, deberán cerrarse éstos de nuevo. Bajo condiciones óptimas de almacenamiento, los medios de cultivo deshidratados – mantenidos cerrados en sus envases originales- conservan sus cualidades durante cinco años, como mínimo a partir de su fabricación.
Si tras periodos de almacenamiento más prolongados se presenta una alteración del pH, puede ajustarse su valor.
PREPARACIÓN
Disolución del medio de cultivo deshidratado
Para la preparación de medios de cultivo se utiliza agua limpia, recién destilada o desmineralizada y cuya reacción sea lo más cercana posible al pH neutro.
Los recipientes destinados a la preparación (por lo general, matraces Erlenmeyer) se limpiarán escrupulosamente con el agua que se ha descrito en el párrafo anterior, con el fin de eliminar totalmente residuos eventuales de otras sustancias. Los recipientes destinados a la preparación de los medios de cultivo deben ser suficientemente grandes para que el medio de cultivo que se prepara pueda ser agitado con facilidad y concienzudamente. A ser posible no se preparan más de 1 o 2 litros por recipiente. Al medio de cultivo deshidratado y pesado se añade aproximadamente la mitad de la cantidad necesaria de agua y se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea. Después se incorpora la cantidad de agua restante, aprovechando esta adición, para desprender e incorporar el conjunto de partículas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente.
Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento, por este motivo, no debe calentarse más de lo estrictamente necesario.
Los medios nutritivos que no contienen agar ni gelatina se pueden disolver ya, por lo general; en agua fría o ligero calentamiento. A fin de obtener una preparación adecuada se recomienda hacer uso de estos indicadores.
Los medios de cultivo que contiene agar o gelatina deben ser calentados para conseguir su disolución. Este calentamiento se realiza en baño María o en marmita de vapor (por ejemplo, autoclave sin sobrepresión). En casos de medios de cultivo que no deban ser sometidos a ulterior esterilización en autoclave es imprescindible prestar atención a su disolución completa. Puede reconocerse que ha alcanzado ese grado cuando al agitar, no se adhiere a la pared interna del recipiente, partícula alguna de agar y la solución viscosa, resbala libremente.
Algunos medios de cultivo muestran una turbidez inevitable (entre otros, por ejemplo, el agar bismuto sulfito). Para estos medios hay que procurar una turbidez homogénea, distribuyendo lo mejor posible las partes insolubles.
Si es imprescindible la preparación de más de 2 litros, es necesario proseguir de acuerdo a la siguiente norma:
· Diluir el medio de cultivo en 1/10 aproximadamente de a cantidad de agua y dejarlo remojar durante 15 minutos.
· Calentar a ebullición el agua restante.
· Reunir esta agua hirviente, bajo constante agitación, con el medio de cultivo remojado.
· Calentar adicionalmente hasta su completa disolución.
Ajuste del pH
Cuando se usa agua neutra para su preparación, los medios de cultivo deshidratados muestran el valor del pH indicado para cada uno de ellos, a la temperatura de incubación prescrita para cada caso. A pesar de todo, se recomienda comprobarlo, sobre todo en casos de lotes no recientes, y proceder a su corrección en caso de ser necesario.
El valor del pH depende mucho de la composición del medio de cultivo, de la temperatura que tenga el medio de cultivo en el momento de su medición y al tratamiento que se haya sometido dicho medio de cultivo para su obtención (disolverlo, esterilizarlo). Por este motivo la medición del pH se hace después de la esterilización. Para realizar esta medida, lo mejor es utilizar un aparato medidor de pH (“peachímetro”) (sin olvidar la compensación de la temperatura en el aforo del electrodo), o bien utilizar el indicador especial en varillas de pH 4,0 – 7,0 y el de pH 6,5 – 10,0.
En los medios de cultivo sólidos, la medición del pH (y eventualmente la corrección que fuese precisa) se realiza a 45 – 50°C (medio de cultivo líquido) y en los medios nutritivos líquidos se hace a temperatura ambiente.
El pH se ajusta al valor indicado para cada medio de cultivo. A la temperatura de incubación, el valor del pH quedará dentro de los límites de oscilación previstos. La corrección se logra por adición de solución 1N o 1/10N de HCl o de NaOH, a una muestra de medio de cultivo exactamente medido. La cantidad e solución correctora necesaria para latotalidad del producto preparado se calcula fácilmente a partir de la cantidad de solución correctora empleada para la muestra del medio de cultivo.
Realización de un ajuste de pH:
a) Esterilizar el medio de cultivo
b) Extraer estérilmente una muestra
c) Medir el pH de esta muestra, y si fuera necesario, ajustar por titulación el pH al valor correcto.
d) Si procede a hacer la corrección, añadir al medio de cultivo preparado la cantidad calculada de solución de HCl o de NaOH según el caso; estos líquidos han de ser lógicamente estériles. (Las soluciones de HCl y de NaOH pueden hacerse estériles por filtración, haciéndole pasar a través de filtros adecuados de vidrio o de filtros especiales de membrana).
Esterilización:
Antes de su esterilización y dentro de lo posible, es conveniente repartir el medio de cultivo en porciones más pequeñas, por ejemplo, en los recipientes definitivos o en el que ulteriormente se lleve a cabo el trabajo de investigación de que se trate (excepto placas de Petri).
Si las normas de preparación no indican otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en autoclave, a 121°C, durante 15 minutos. Los periodos de calentamiento y enfriamiento, dependen del tipo del aparato y del volumen del preparado a esterilizar, no se han tenido en cuenta al indicar la cifra anterior. La esterilidad sólo se consigue con seguridad cuando se han desalojado correctamente el aire de la cámara de vaporización de la autoclave y de los recipientes en ellos contenidos. Con este fin se deja fluir ampliamente la corriente de vapor manteniendo abierta la válvula de purga durante el comienzo de la fase de calentamiento de la autoclave. Tras la esterilización y después de haber alcanzado el equilibrio de presiones (entre el interior y exterior de la autoclave) y para evitar la sobrecarga térmica del medio de cultivo, deben sacarse enseguida de la autoclave los recipientes enfriarlos rápidamente, por ejemplo, a la temperatura de “vertido”. Se recomienda para ello bañar los recipientes con agua corriente fría.
Temperaturas más altas y calentamiento más prolongado de lo previsto, perjudican la calidad del medio de cultivo.
La autoclave es la forma de esterilización más segura para los medios de cultivo. Si no se dispone de autoclave, se puede utilizar una olla grande de cocina.
Vertidos en placas:
Para evitar considerablemente la formación de gotitas de condensación de agua en la tapa de las placas Petri, deben verterse en ellas los medios de cultivo a una temperatura de 45 -55°C., previamente hay que remover bien el medio de cultivo haciendo oscilar en sentido circular su recipiente, para garantizar el entremezclamiento uniforme de dicho medio de cultivo. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan abanicando brevemente la superficie con la llama no luminosa de un mechero Bunsen. Antes de sembrar las placas puede secarse la superficie húmeda del agar-agar (que podría favorecer el desplazamiento de organismos o el desmembramiento de las colonias) en estufa a 30 – 40°C. Para ello se coloca la parte inferior de la placa Petri con su cara interna hacia abajo, algo desplazada entre 20 y 30 minutos como mínimo. En estufas con circulación de aire se precisa menos tiempo.
Tubos de agar inclinados:
Para algunas aplicaciones microbiológicas se ha mostrado como muy interesantes, realizar siembras superficiales en tubos de cultivo (por ejemplo, conservación de cepas). Para ello se precisa una superficie grande de medios de cultivo, que se puede obtener mediante “agar inclinado”.
Los tubos llenos con medio de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en una posición inclinada, de tal forma que se forme una capa de aproximadamente 3 cm. y una superficie inclinada de iguales dimensiones. El medio de cultivo se deja solidificar en la posición lograda.
Medios de cultivo ácidos
Los medios de cultivo a base de agar y que tienen pH inferior a 5,0 deben prepararse con sumo cuidado pues el agar- agar se hidroliza al ser calentado en medio ácido y, por tanto, disminuye la estabilidad del gel del medio de cultivo. Por ese motivo, debe evitarse lo más posible el tener que volver a fundirlo de nuevo. Si no fuera posible la forma de preparación oportuna o si fuera inevitable una nueva fusión con la consiguiente reducción de la estabilidad del gel, puede añadirse eventualmente agar- agar al medio de cultivo antes de proceder a disolverlo. Por lo general es suficiente aproximadamente 5,0 g/l.
Composición de los medios de cultivo:
Algunas sustancias nutritivas muestran ciertas oscilaciones en sus propiedades, en función del lote de fabricación.
Estas oscilaciones tienen que equilibrarse en los medios de cultivo deshidratados, modificando eventualmente las cantidades para obtener resultados reproducibles en el cultivo de microrganismos. Para ellos se declaran composiciones típicas para los medios de cultivo deshidratados.
POSIBLES DEFECTOS EN LA PREPARACIÓN Y MANIPULACIÓN
Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados
· Conservación en atmósfera excesivamente húmeda
· El envase ha permanecido abierto demasiado tiempo.
· El envase no quedó lo suficientemente bien cerrado después de su uso.
· El medio de cultivo deshidratado está muy pasado de fecha (viejo).
Desviación del valor de pH
· Agua no neutra
· Envase no suficiente bien lavado
· Medio de cultivo sobrecalentado duran su preparación
· Medio de cultivo deshidratado, muy pasado de fecha (viejo)
Turbidez, precipitación
· Una turbidez en el medio de cultivo preparado, hay que considerarlo como defecto, si en los recipientes (placas de Petri, tubos, etc.) provocan observaciones deficientes. Una turbidez que aparezca como consecuencia de un mayor espesor de capa del medio de cultivo, hay que considerarlo como un defecto.
· Las precipitaciones que forman posos hay que considerarlas, por lo tanto, como defectos de preparación.
· Excepciones: algunos medios de cultivo son inevitablemente turbios. Ejm: Caldo Tetrationato de Kauffman, Caldo Selenito Cistina.
· Agua insuficientemente desionizada.
· Los recipientes en los que se hizo la preparación no estaban lo suficientemente limpios.
· pH incorrecto o desajustado (véase deviación del valor pH)
· Sobrecalentamiento del medio de cultivo durante la preparación.
· Si los medios de cultivo han sido confeccionados por el usuario las(s) sustancia(s) empleada(s) contiene(n) impurezas formadoras de precipitado.
· Ocasionalmente por el material de muestra.
· Pérdida de agua por evaporación en el medio de cultivo preparado.
Punto de solidificación demasiado elevado.
De importancia, sobre todo, cuando hay que mezclar material de ensayo o sustancias en el medio de cultivo todavía líquido.
· Excesiva preparación de medio de cultivo deshidratado
· Agar - agar deshidratado.
Escasa estabilidad del gel
· Preparación demasiado pequeña del medio de cultivo deshidratado.
· Medio de cultivo deshidratado no disuelto completamente.
· Medio de cultivo sobrecalentado durante su preparación; eventualmente, en los casos de pH demasiado bajo (véase desviación del valor del pH).
· El medio de cultivo no se agitó, o lo fue insuficientemente, en su recipiente de preparación, cuando fue vertido en las placas.
· En el caso de medios de cultivo, confeccionados por el propio usuario agar- agar, demasiado escaso o inadecuado.
· Medios de cultivo ácidos (véase medios de cultivo ácidos) preparados sin suficiente cuidado.
Desviación del color
· Valor erróneo del pH, en el caso de medios de cultivo que contenga indicador del pH (véase desviación del valor de pH).
· Sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparación, lo que da lugar a:
· Medio de cultivo oscuro.
· Pigmentos alterados
· Azúcar caramelizado
· El recipiente en que se hizo la preparación no está lo suficientemente limpio.
Medios de cultivo (listos para el uso) contaminados
· Esterilización insuficiente
· Contaminación accidental ulterior a la esterilización. Por ejemplo, impericia en el vertido en placas; placas Petri no estériles o contaminadas.
Crecimiento demasiadopobre en gérmenes
· Residuos de sustancias inhibidoras de crecimiento:
· En los recipientes de preparación o medio de cultivo (por ejemplo, detergentes),
· En el agua de preparación
· En el material de ensayo
· Gérmenes ya alterados en el material de ensayo.
· pH incorrecto.
· En el caso de medios de cultivo mezclados. Adición de la muestra defectuosa a temperatura elevada.
Crecimiento demasiado intenso de gérmenes
· Medio de cultivo sobrecargado durante su preparación con la consiguiente destruc ción de sustancias inhibidoras selectivas.
· En el caso de medios de cultivo basales; aditivos defectuosamente dosificados.
· Medio de cultivo sembrado con demasiado material de ensayo.
Colonias incorrectas o desleídas
· Superficie del medio de cultivo demasiado húmedo.
· Superficie del medio de cultivo sembrado con demasiado material de ensayo.
· Medio de cultivo sobrecalentado durante su preparación, con la consiguiente destrucción de sustancias inhibidoras.
Crecimiento atípico
· Medio de cultivo erróneo, o defectuosamente preparado.
· Medio de cultivo deshidratado muy pasado de fecha (viejo).
· El medio de cultivo utilizado ha permanecido almacenado durante tiempo excesivo, envejeciendo o deteriorándose.
· Condiciones de cultivo no conforme con las normas.
· Residuos de sustancias extrañas en los recipientes de preparación o de cultivo (por ejemplo, detergentes), en el agua o en el material de ensayo.
II. OBJETIVOS
· Lograr el adiestramiento de los estudiantes en la preparación de los medios de cultivo.
· Capacitar al estudiante en la selección del medio de cultivo especifico según la necesidad: aislamiento, cuantificación o diferenciación bioquímica.
III. FUNDAMENTO TEÓRICO
Los microrganismos de acuerdo sus requerimientos nutricionales, en general se clasifican en Autótrofos y Heterótrofos.
A. Microorganismos Autótrofos:	Son aquellos que obtienen su energía de la oxidación de sustancias inorgánicas simples como: C, CO2, N y S; dentro de este grupo tenemos a los microorganismos,
· Litoautótrofos, quimioautótrofos o quimiosintético y;
· Autótrofos o fotosintéticos:	Los que obtiene su energía de reacciones fotoquímicas o reacciones químicas de óxido-reducción.
B. Microorganismos Heterótrofos: Son aquellos que requieren de compuestos “orgánicos” más completos como fuente de carbono y nitrógeno, requieren del suministro de proteínas, carbohidratos, lípidos, vitaminas, sales inorgánicas y otros factores de crecimiento para la síntesis de sus compuestos estructurales y citoplasmáticos en su desarrollo.
Pueden ser: Lito-organotróficos, y quimio- organotróficos
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
A. DE ACUERDO A SU NATURALEZA:
Puede ser:
a) De origen animal
b) De origen vegetal (orgánicos)
c) De origen mineral (inorgánicos)
B. SEGÚN SU COMPOSICIÓN Y OBJETIVOS:
Se clasifican en:
a) Medios Comunes:
Son aquellos que contiene los mínimos componentes nutricionales para organismos heterótrofos no exigentes. Estos pueden ser:
· Líquidos: 	Aquellos que tienen nutrientes disueltos en solución acuosa. Ejm. 
· Caldo nutritivo
· Caldo peptonado
· Caldo triptosa
· Caldo de carne
· Sólidos: Los que tiene como base un medio líquido, al que se agrega sustancias de escaso o poco valor nutritivo, como agar-agar o gelatina, para darle al medio consistencia de gel. Ejm:
· Agar nutritivo o común
· Medio de gelatina
· Agar almidón
· Semisólidos: Aquellos medios líquidos a los que se le agrega una concentración de agar suficiente para obtener un estado de gel blando (0,5%). Generalmente se usa para estudio de motilidad macroscópica en columna.
b) Medios Enriquecidos o Suplementados:
Preparados para reunir los requerimientos nutricionales de bacterias exigentes, se compone de un medio basal común suplementado con factores de crecimiento como: sangre, suero, líquido ascítico, extracto de levadura, bases nitrogenadas, sales minerales, carbohidratos, vitaminas, líquido pleural, etc.; estos medios pueden ser líquidos o sólidos. ejemplos:
			 
Curso: Microbiología Ambiental			Dr. César Julio Cáceda Quiroz
Medios líquidos
· Caldo Cerebro Corazón
· Caldo Extracto de Levadura
· Caldo Triptosa Soya
· Caldo Suero
· Caldo Ascítico
Medios sólidos:
· Agar Sangre
· Agar Chocolate
· Suero coagulado de Loeffer
· Agar Cerebro Corazón
· Agar Extracto de Levadura
c) Métodos Sintéticos Definidos o Químicamente Definidos
Preparados exclusivamente de sustancias químicas:
· Medios sintéticos simples:	Contiene Carbono como fuente de energía (glucosa o lactosa); una fuente “inorgánica de nitrógeno (CINH4)”, fosfato o sulfato y varias trazas de sales inorgánicas, sustancias tampón y agentes quelantes como el citrato. Ejm:
· Medio Mínimo de Falkow
· Medio Mínimo de Davis
· Medios especiales o selectivos indicadores:	Incorporan aminoácidos, purinas, pirimidinas y otros factores de crecimiento para sepas exigentes.
d) Medios Sintéticos Complejos:
Son aquellos que además de contener los requerimientos nutricionales básicos, llevan en su composición “sustancias inhibidoras” como carácter “selectivo” y compuestos específicos o “indicadores” para poner de manifiesto los principales caracteres bioquímicos esenciales para el diagnóstico especifico.
Entre las “sustancias inhibidoras” se pueden contener los medios de cultivo, encuentran:
· Sales biliares
· Antibióticos
· Colorantes
Estas sustancias pueden afectar el metabolismo o sistema enzimático con carácter de selección. Comprende:
a) Medios de enriquecimiento: Que favorecen el crecimiento de uno un grupo de microorganismos en particular, e inhiben, en lo posible, otros de la microflora acompañante. Ejm:
· Agua peptonada alcalina (A.P.A.) *
· Caldo selenito de Leiffson*
· Caldo Tetrationado de Kauffman*
* Estos medios no se autoclavan
b) Medios selectivos: Que favorece al aislamiento de un determinado grupo de microorganismos, mediante la obtención de colonias (cepas puras). Todas son utilizadas en condiciones sólidas. Ejemplos:
· Agar Chapman
· Agar Cetrimide
· Agar Mac Conkey
· Agar Eosina Azul de Metileno (E.M.B.)
· Agar Endo
· Agar Salmonella – Shigella (S.S.)
· Agar Verde Brillante
· Agar Sulfito de Bismuto
c) Medios diferenciales: Empleados para detectar reacciones bioquímicas, con carácter “diferencial” de grupos de géneros o especies microbianas, a veces en un solo medio diferencial, se pueden interpretar dos o más pruebas bioquímicas. Ejemplos:
· Agar Triple Azúcar Hierro (TSI)
· Agar Lisina Hierro (LIA)
· Agar Citrato de Simmons
· Caldo de Cianuro de Potasio (KCN)
· Caldo de Malonato
· Medio de Hugh Lifson
IV. MATERIALES Y REACTIVOS:
· Tubos 25 x 125 mm
· Tubos 13 x 100 mm
· Placas Petri estériles
· Matraces
· Balones
· Bagueta
· Probetas
· Pipetas 7 ml, 5 ml, 20 ml
· Mecheros
· Balanza
· Espátula
· Pizeta
· Cinta pH
· Papel Kraft
· Pabilo
· Algodón
· Marcador de vidrio
· Franela
V. PROCEDIMIENTO:
· Los ingredientes de un medio de cultivo deberán ser medidos y pesados en forma exacta, de acuerdo a las indicaciones que se encuentren en la etiqueta del medio de cultivo, en recipientes limpios y adecuados. Teniendo cuidado de utilizar espátulas perfectamente limpias. Siempre comenzar pesando los ingredientes menos higroscópicos.
· El volumen de agua o diluyente a emplear, agregarlo en 2 partes: primero agregar la mitad para disolver los ingredientes. Luego agregar el resto. Únicamente emplear agua destilada o desmineralizada.
· Si el medio contiene agar, calentar en baño María, vapor de agua o sobre una rejilla de asbesto, hasta su total disolución. Debe evitarse la formación de espuma que conduzca a un derrame de medio de cultivo. Dejar enfriar y comprobar el pH final retirando con la bagueta una pequeña cantidad de medio colocándolo en una cinta de pH. De ser necesario corregir dicho pH, utilizando NaOH o HCL 1N, según sea el caso.
· Los medios de cultivo líquidos cuya formulación está completa, es decir, que no requieren de otros aditivos, dispersarlos en tubos de ensayo limpios, taponarlos y prepararlos para su esterilización. Realizar lo mismo para medios sólidos a sercontenidos en tubos de ensayo o en viales de antibiótico.
· Los medios de cultivo a ser empleados en placas de Petri y a aquellos, que requieren aditivos, llevar a esterilizar en matraz o balón en que fueron preparados, colocándoles tapón de algodón y cubierta de papel Kraft.
· En todo material a esterilizar, indicar el medio de cultivo, cantidad contenido, fecha de preparación.
· Esterilizar en autoclave a 121,1°C, 15 lb de presión por 15 minutos, salvo aquellos medios cuya especificación indica lo contrario u otro medio de esterilización.
· Enfriar los medios ya estériles a 45°C o 50 °C. Aquellos medios que requieren aditivos, agregar los mismos en condiciones asépticas. Servir o dispersar en tubos de ensayo o en placa Petri según la necesidad.
· Dejar enfriar y/o solidificar. Los tubos con medio sólidos dejar enfriar en forma perpendicular o con ligera inclinación para aquellos que se requieren con superficie inclinada. Una vez solidificados guardar en refrigeración. Las placas Petri con medio de cultivo guardarlas en posición invertida forradas y rotuladas.
AGAR COMÚN O AGAR NUTRITIVO:
· Extracto de carne 	...	 3,0 g.	...	 0,3 g.
· Peptona		…	 5,0 g. 	...	 0,5 g.
· Agar – Agar		...	15,0 g.	...	 1,5 g.
· Agua destilada		...	 1,0 L.	...	100,0 ml.
· pH = 7,2 – 7,3
Para ajustar el pH se le agrega NaOH (si está muy ácido) o HCL 1N (si está muy básico).
CALDO COMÚN O CALDO NUTRITIVO:
Son los mismos componentes que se usan para el agar común, excepto que no tiene agar.
AGUA PEPTONADA:
· Peptona		...	 1,0 g.
· NaCL		...	 0,5 g.
· Agua destilada	...	100,0 ml.
· pH 		...	 7,2 ± 0,1
MEZCLA SULFOCRÓMICA:	
· K2CrO4		...	 100,0 ml.
· H2SO4		...	 100,0 ml.
· Agua destilada	...	1 000,0	ml.
Disolver el primer componente en el segundo y a esto agregar lentamente el agua destilada, agitando o enfriando en forma continua (en agua helada).
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO:
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
· Manuel Mendo Rubio (1995) Lecciones de Microbiología y Medios de Cultivo. Manual de Laboratorio. Cuarta Edición. Editorial Laboradores SRL. Lima Perú.
· Merck. 2013. Manual de Medios de Cultivo. Alemania.