Resumen QA

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Técnicas de centrifugación:
Sirve para: separar partículas en suspensión de un líquido
Sedimentación: cuando la partícula llega a la pared
- V de sedimentación: depende de;
- densidad del medio
- viscosidad del medio
- temperatura
- Coeficiente de sedimentación: característico de partícula en medio determinado
Aceleración de la centrífuga
Rotores:
1. de ángulo fijo: los tubos quedan en la misma posición
2. basculante: se van moviendo
Tipos:
➔ Cent diferencial
◆ fraccionamiento subcelular
◆ separación de diferentes tipos c
➔ Cent analitica
➔ Precipitación fraccionada
DIFERENCIAL:
Depende la partícula, se van a ubicar en diferentes partes del tubo
- primero bajan las part mas grandes
- > tiempo de cent y > fuerza de cent = bajan las más chicas
Fraccionamiento subc:
1. fracción de tejido en buffer
2. homogeneizar → rompo c
3. filtrar
4. primera cent (N y citoesq)
5. segunda cent (mitocondria, lisosomas, peroxisomas, cloroplastos)
6. tercer cent (memb plasm, RE, vesículas, microsomas)
7. cuarta cent (ribosomas, virus, macromoléculas)
cent en gradiente de densidad:
tengo una sl de sacarosa de dif densidades, las partículas que ponga van a ir hasta donde
encuentren su misma densidad → gradiente de sacarosa
- ←grad discontinuo
- grad continuo
Para ver que mi muestra no esté contaminada puedo buscar proteínas que haya en c/
organela → reacciones inmunológicas: Ab de proteínas
ANALITICA:
Determinado coeficiente de sedimentación, PM y cambio
conformacional (cuando una molécula por interactuar con
otra durante cent cambia su coef de sed).
Con rotor basculante →
PRECIPITACIÓN FRACCIONADA:
Se basa en la diferencia de solubilidad
Separo y luego centrífugo
Se usa mucho en moléculas inorgánicas
Hay un eq de solubilidad entre sustancias
1. Tengo que hacer que mi sustancia precipite;
- cambio de pH: a veces cambia solubilidad (sales inorg, hidróxidos)
- proteínas: en punto isoeléctrico precipitan
- fuerza iónica: [ ] total de sales → los iones hacen que los residuos de prot se
separen → salting out (> fuerza iónica = > precipitación)
Cálculo para precipitar:
(ej quiero llegar a 40% de saturación desde una sust 100% saturada)
v . 100% = ( v + v ) . 40%
v = ?
2. centrifugo
3. lavamos precipitado
4. dializamos precipitado (ppdo) y sobrenadante:
me saco de encima la sal
5. Buscamos proteína de
interés en ppdo y
sobrenadante
6. Sv orgánico miscible
(etanol/cetona) → poder medir
en función de tiempo
Prop coligativas: dependen del n total de partículas en solución independientemente de la
naturaleza de la partícula.
- Desc de la presión de vapor
- Asc ebulloscópico
- Desc crioscópico
Presión osmótica
Electroforesis:
fund: movimiento de las partículas cargadas en un campo eléctrico
→ separa partículas aprovechando su carga y tamaño (SDS)
→ materiales:
- fuente de poder
- cuba
- soporte
- papel
- acetato de celulosa
- gel
- algarosa
- poliacrilamida
Elect de proteínas:
1. Hago gel (poliacrilamida PAGE)
2. Pongo gel en cassette (c peine → agujeritos) y gelifica (≠pH↴)
a. gel concentrados: para que las muestras entren al mismo tiempo
b. gel separador
3. Pongo cassette en cuba (c buffer)
4. Siembro (c sacarosa → aumenta δ) muestras c pipeta
a. azul de bromofenol → molécula pequeña y cargada dejo que corra hasta el
final y se que la proteínas están atrás → medio básico
5. Tiño con colorante de proteínas
6. Saco el gel del colorante y lo decoloro (la tinción de las prot no se va)
EN FUNCIÓN DE SU MASA
La elect se corre en SDS
(detergente) → las prot se
separan sólo por su PM
EN FUNCIÓN DE SU CARGA: Isoelectroenfoque
→ sl c distintos ac/bases débiles → anfolitos → mol cargadas (cuando aplico un E generan
un gradiente de pH en el gel)
1. pongo sl en gel (acrilamida)
2. pongo las proteínas (corren hasta que encuentren su pto isoeléctrico)
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL:
- Corro por SDS
- Gel redondo separo x cargas
- Beneficioso cuando no se las propiedades de mis proteínas
Técnicas espectroscópicas:
Interacción con la radiación electromagnética con la materia (camp elect + camp magn)
para determinar estructuras, no técnica para separar
Espectro de absorción y de emisión
↓
Estado fundamental → Estado excitado
- menos E E = hv - depende de la E que hago incidir- tiende a volver a su est fund
h = cte ←
E´ = hv´
Espectro: gráfico (curva) de intensidad que puede absorber/emitir en función de λ → “huella
digital” de sustancia → sirve p identificar
- de líneas: a sencillo
- de bandas: moléculas complejas
¿Qué pasa al producirse la interacción de la radiación electromagnética con la materia?
- ej: un e– salta de un nivel a otro, los enlaces vibran …
- depende de la energía de la radiación;
Espectrofotometría: medición intensidad → curva de calibración
- me permite saber [ ] de muestra incógnita
- λ única
Fluorescencia: absorber a UV
- fluorocromos
- fluorimetro
e. fund → e. excitado → e. excitado inferior
→ (> λ, <É) →
2 fluorocromos:
1. λ a la cual se excita
2. λ que nec p ver el color
FRET: ver si 2 mol
interaccionan entre sí
(visualizar)
a 1 mol le pongo GFP (prot
fluorescente)
Biosensores: permite detectar, monitorear
1. detectar algo en una muestra
2. uso elemento biológico
3. transductor: el cambio q se genera lo traduzco a algo que me permita lograr un
resultado
4. resultado
Cristalografía de rayos X: Determinación estructuras moleculares, difracción de rayos X
Espectroscopía IR (infra rojo)
Resonancia Magnética: Análisis estructural orgánico → campo eléctrico gigantesco
Espectrometría de Masa: NO involucra interacción radiación-materia
- análisis est orgánico (mol mas chicas)
- análisis estructural de proteínas MALDI-TOF
Técnicas inmunológicas:
Fundamento: reacción antígeno(Ag) -anticuerpo(Ab) → alta especificidad y afinidad
Inmunogenicidad:
- tipo de molécula
- tamaño
- dist filogenética: mientras + alejado evolutivamente está el huésped del antígeno, >
capacidad de rsp inm.
Ag: sustancia capaz de generar reso inmune
Ab: proteína con funciones inmunológicas
- G: interviene en cualq resp inm
- M: interviene en cualq resp inm
- E: proc alérgicos
- A: secreciones
Ext variable: paratope
Síntesis:
- en el cuerpo los linfocitos b fabrican anticuerpos (sec
codificada por varios genes)
- cada linfocito genera una Ig distinta
- para 1 Ag nec varias Ig que reconozcan todos los det antigénicos
Policlonales: Ab con muchas Ig distintas, dirigidas contra distintos determinantes
antigénicos.
1. le doy Ag a animal (alejado evolutivamente de mi Ab)
2. genera resp inmunológica
3. genera Ig
4. le saco sangre → suero inmune
5. purifico
Puedo inyectarlo dos veces para generar una respuesta secundaria que será más rápida y
sostenida en el tiempo
Monoclonales: Ab con 1 solo tipo de Ig dirigidas a 1 solo Ag (no naturaleza)
Siempre se hace en ratón (con tumor de médula ósea → no enzima para via de salvataje de
purina)
1. se inyecta y tiene repuestos policlonal
2. tomo c del bazo del ratón y c tumorales (INMORTALES)
3. fusiono las c → hibridomas → capacidad de multiplicación → fuente de Ab
permanente
a. no es al 100%: tengo c linfocitos + c cancerígenas + c fusionadas
4. en medio HAT (solo sobreviven c fusionadas)
a. linfocitos b= mueren naturalmente
b. c cancerígenas = A (aminopterina) = antibiótico que inhibe la síntesis de
purinas → no se sintetizan ac nucleicos → no hay vía de salvataje para
purinas
5. dilución ∞: separo c fusionadas
a. diluyo lo suficiente como para que si yo tomo x uL de suspensión me
aparezca 1 sola c
b. previamente tengo q contar cuantas c tengo (si tengo 10c / uL tengo que
diluir 10 veces)
i. cámara de Neubauer
ii. cámara de Makler
c. siembro alícuota en otro lado (toda slas c derivadas de esa van a ser clones
6. testeo todas las c para ver cuáles reacciones frente a mi Ag (visualizar unión)
a. reacción = las guardo
b. no reaccionan = las tiro
7. multiplicación
a. in.vivo: inyecto a raton y le saco liquido ascitico (peritoneo=
b. in.vitro: cultivo en biorreactor
8. purifico
Técnicas:
- Inmunoprecipitación
- ELISA
- RIA
- Inmunoblot- Inmunohisto/citoquímica
ELISA: ensayo inmunoabsorbente linkeado con enzima
- cualitativo
- cuantitativo (curva de calibración)
1. De 1 sitio:
-sl con Ag en placa de petri
-las proteínas se pegan en el fondo → saco sobrenadante → lavo
-pongo Ab que reconoce Ag → saco sobrenadante → lavo
-pongo Ab 2rio* (marcado → enzima) que reconoce a Ab 1rio → saco sobrenadante → lavo
-agregar sustrato que desarrolla color cuando se une a mi enzima → espectrofotómetro
- control -: pongo Ab 1rio y Ab 2rio* y veo si se pega a otra cosa que no sea mi Ag
- control +: poner mi Ag y se que tiene que reaccionar
2. De 2 sitios: sandwich (2 Ab 1rio)
-pego Ab 1rio de captura (monoclonal) → saco sob → lavo
-agrego Ag → los que van con mi Ab se pegan → saco sob → lavo
-Ab 1rio* (esp contra Ag - mono/policlonal) de reconocimiento → saco sob → lavo
-sustrato → color
3. Competitivo: el Ag es el que se marca (no puede ser indirecto)
-tengo Ab pegado
-agrego Ag y Ag* → compiten para unirse
- +Ag unido → menos color → + Ag en muestra
- + Ag* unido → más color → - Ag en muestra
Ventaja Desventaja
● tengo que tener Ag* ● menos chance de error
RIA: radioinmunoanálisis → isótopo radioactivo → mido cuánta radiactividad queda pegada
Ag → ≠ [ ]
Ag* → = [ ]
Ab → = [ ]
- Más fácil de detectar a menores concentraciones
→ Interpolación: ver a mi radioact cuanto [Ag] hay
Cómo detectar radioactividad:
isótopos radioactivos → inestables → buscan estabilizarse liberando radioactividad
Cómo se estabilizan
1. pérdida de e- (β-)
2. pérdida de positrones (β+)
3. pérdida de partícula Ⲁ
1. Geiger (veo radioact como pulso eléctrico, detecta radiación β)
↳ gas inerte que se ioniza con r y emite pulso elect
2. Centellador (al recibir radiación emite luz, lo detecta y me da un pulso
elect)
Técnica de Inmunoprecipitación:
1. Líquidos: (batch) purificar cant grandes de Ab/Ag
-Ab polivalentes (+ de 1 sitio de unión) → forman redes y
los puedo precipitar en sl
-Relación Ag-Ab tiene que estar en zona de equivalencia
-Centrífugo y precipita el Ag-Ab
2. Fase sólida:
-Gel de agar
-se forma banda en zona de equivalencia
-cualitativa
a. Doble Inmunodifusión:
-cualitativa
-forma banda cuando reconoce a Ag;
B= Ag
A= Ab
b. Inmunodifusión Radial:
-cuantitativa
-gel + Ab en misma sl → bandas circulares
-curva de calibración → diámetro - [Ag]
-gasta mucha Ab
 
c. Inmunoelectroforesis:
-combina 2 técnicas
-gasto mucho Ab para llenar banda
1ro electroforesis en agar (no tan discriminatoria) → separa componentes de Ag (+ -)
2do coloco Ab → inmunodifusión → se forman bandas
d. Immunoblotting (western blot): más sensible que inmunoelectroforesis
1ro electroforesis (gel de poliacrilamida)
2do transfiero proteína a membrana con electricidad (- gel → transferente → memb +)
↳ me da caract de la prot que estoy buscando
3ro reacción inmunológica: le pongo Ab* (directa/indirecta)
e. Dot blot: más sensible que inmunodifusión (variante sin electroforesis
previa)
-cualitativa
1ro siembro muestra en memb
2do pongo Ab arriba
3ro reacción inmunológica (primer Ab y segundo Ab* → me permite amplificar la señal
CROMATOGRAFÍA:
Distribución componente entre 2 fases a causa de su diferente afinidad por ellas
↳≠ Kd: cte de partición (como se distribuye una molécula entre 2 fases)
- fase móvil (liq, gas)
- fase fija (sol, liq, gel, sol + liq)
Eq Prop analito F. fija F. móvil
1. Adsorción Adhesión sol liq
2. Partición Solubilidad liq liq/gas
3. Int iónico Carga sol liq
4. Tamizaje molecular PM liq liq
5. Afinidad Especificidad sol liq
1. -Una vez hecha tengo que despegar;
-Absorbentes (que separa): silica (base), C activado (proteína),
alúmina (ácido), HO-apatita (ac nucleico-prot)
2.
a. Directa:
-F.F.= polar / F.M.= menos polar
-salen primero las menos polares
-F.F. tiene que tener agua como componente propio (papel/silica)
b. Fase reversa:
-F.F.= no polar / F.M.= más polar
-salen primero las más polares
-F.F. sílica sin OH → se reemplazan por grupos carbonados
3. -F.F.= cargada
-intercambiadores aniónicos y catiónicos→ según carga de iones (F.M.)
con los cuales interactúa.
-Interc cationico →
4. -F.F.= fabricado como una microesfera (con poros), suspendidas en gel
-F.M.=
-part pequeñas: ingresan x poros → tardan más en llegar
-part grandes: no recorren mucho → tardan menos en llegar
5. -Interaccionan por su funcionalidad (muy específica)
-F.F.= matriz + ligando
-F.M.= algo que se quiere pegar a ligando + basura
-una vez que se pega lavo y descarto basura
-tengo que despegar partícula de interés;
a. agrego + ligandos y lavo (luego veo como los separo)
b. pongo otra proteína que tenga + afinidad → competencia (no se suele hacer
xq es dificil encontrar algo con más afinidad)
Cromatografía:
- capa delgada → no sirve para crom de proteínas
- columna → se corren a 4oC (aparato colector de fracciones).
1- Arma la columna
2- Siembro
3- Paso liq (eluyente) para que corra → elución
4- Detección analito en eluido*
5- Grafico*
↳cada componente queda en un tubo distinto
*Identificar analito:
1. inmunodifusión
2. act enzimática (mucho trabajo)❌
3. medir abs a 280 nm✅
↳absorben aa aromáticos
*Gráfico= perfil de elución
Resolución (entre 2 picos) depende de:
- caract físicas de columna (ancho-largo)
- condiciones de corrida
Cuanti: área bajo la curva (% que corresponde a pico)
Cuali: ml de elución en eje y
Defectos:
- Fronting peak: sobrecarga de columna, sl saturada → sigue de largo
- Tailing peak: se quedan interactuando con columna → cuando mi F.F. no es tan
inerte
Cromatografía de int iónico en columna:
Elución:
isocrático o gradiente
- NaCl → agrego iones que compiten con lo asociados en la
matriz
↳ gradiente (+ poder separativo)
- Cambio pH: isocrático o gradiente
- int catiónico:
- - pH → prot más positivas❌
- +pH → prot más negativas → se despegan✅
- int aniónico:
- - pH → prot más positivas → se despegan✅
- +pH → prot más negativas❌
Cromatografía de tamizaje molecular en columna:
- Primero salen partículas más grandes y luego las más pequeñas
- Elución= mismo buffer donde se encuentran
- Importante para determinar PM
↳ Hago curva de calibración con proteínas de PM que conozca
- Vo : vl muerto (hasta q sale algo)
- V total : desp de q sale todo
Cromatografía de afinidad en columna:
1. siembro en columna con ligando de proteína de interés
2. paso eluyente → periodo de lavado, depende lo que tenga
adentro
↳lavo las proteínas que no quiero
3. corro con exceso de ligando
Optimización condiciones experimentales:
➔ Muestra limpia
➔ Características físicas columna: h, ø
➔ Matriz de la fase fija
➔ Fases fija y móvil
➔ Empaquetamiento columna
➔ Aplicación muestra
➔ Elución: flujo, P, T, isocrática o grad
➔ Recolección fracciones
➔ Detección analito en eluido
—
Cromatografía de partición CGL:
- para separar e identificar no tanto para prot
- F.M.: liq/gas F.F.: liq
- F.F.: alto grado de ebullición (p permanecer líquido)
- F.M.: resistente al calor (p no destruirse)
- separar moléculas complejas
- tiempo de retención: tiempo de analito en columna
Cromatografía en placa delgada (TLC): de partición o adsorción
- se usa una hoja de papel o silicona para molec más peq (no prot)
1. H2O embebido en silicona (F.F.)
2. papel/silicona se colocan en una cuba cromatográfica
3. elución (con algo menos polar que el H2O → los sv orgánicos se
evaporan a ≠ t )
4. utilizamos cuba para mantener eq liq-gas y mantener composición de
muestra (cerrado)
5. ←identificación: relación entre lo que corrió el analito y lo que corrió el sv
TLC bidimensional:
- F.M.: 1ra dimensión
- F.M.: 2ra dimensión
-se usa para cuando las moléculas a analizar son muy parecidas entre sí
1. pongo F.M. en cuba
2. lo dejo saturar (esperar) → eq liq-gaseoso
3. pongo muestra → dejo correr