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1 UNIDAD 1: SUBUNIDAD 1.1: Elementos básicos para la clasificación taxonómica microbiana. La MICROBIOLOGIA es la ciencia que se encarga del estudio de los microbios, microorg por su pequeño tamaño, para ser observados y se necesita de aparatos amplificadores o microscópicos. MICROBIOLOGIA puede ser general (microorg), medica (microorg + sistema inmune) y clínica (Enfermedad infecciosa). CAMPOS DE APLICACIÓN: Medica, farmacéutica, alimenticia, cosmobiologia, veterinaria, etc. MICROBIOLOGIA: 1. Ramas: a) Micología b) Parasitaria c) Bacteriológica d) Virologíaa 2. Ciencias: a) Química, física y biología b) Taxonomía c) Inmunológicas d) Matemáticas TERMINOLOGIA Microbiota comensal: Es alidada del sistema inmune, posee adhesinas para receptores celulares específicos que impiden la colonización de patógenos. Es la microbiota que hay que preservar. Los microorg que la conforman no atraviesan las primeras barreras físicas inmunológicas, no inducen a respuesta inmune. Infección: Simple colonización de un aérea determinada del cuerpo (ecosistema primario) compatible con el estado de salud. Enfermedad infecciosa: Alteración a simple vista de las funciones mediante signos y síntomas que determinan el estado de enfermedad. Enfermedad clásica: Han existido siempre, son cosmopolitas y muy difíciles de erradicar porque son multicausales y es imposible combatir todos los factores determinantes. Enfermedad emergente: No existían en un área determinada porque permanecían confinadas a un área geográfica determinada, pero se expandió a otras regiones. Por ej: VIH. Enfermedad reemergente: Existieron y fueron eliminadas, por ejemplo con vacunas, después de un tiempo esta medida preventiva se suprimió y se re instalaron. Por ej: cólera, malaria, tuberculosis. Hábitat: Sitio donde vive una especie. Nicho ecológico: Función que tiene un microorg dentro de una especie. Población: Conjuntos de organismos de una sola especie. Comunidad: Conjunto de poblaciones, de diferente especie. Saprofito: Organismo de vida libre. Vive en materia en descomposición, suelo, aire y se puede transformar en simbionte si ingresa al microorg. Estado vegetativo: Es la forma infecta y potencialmente patógena. Estado de resistencia: Forma infectante. Por ej: endosporas de bacterias. Colonización: Ocupación de un microorg en un área corporal del hospedador. Es un proceso que comienza con el nacimiento y dura para toda la vida. Todas las superficies corporales en contacto con el medio ambiente están colonizados por microorg comensales. RELACIONES INTRAESPECIFICAS: Se llevan a cabo entre individuos de una misma especie. RELACIONES INTERESPECIFICAS: Son relaciones entre individuos de diferente especie. Pueden ser positivas o negativas. Positivas: 1. Mutualismo: Es un relación donde ambos se benefician, no es obligada. Se puede dar entre el microorg y el hospedador o entre microorg solos. 2. Simbiosis: Es una relación obligada donde ambos se benefician. Se da entre microorg. Negativas: 1. Parasitismo: Una especie viva a expensas de otro. No es una relación obligada. 2 2. Antibiosis: Una especie inhibe o impide la vida de otra. 3. Sinergismo: Un microorg necesita de otro para hacer daño. Por ej: GUNA. RESEÑA HISTORICA: La microbiología tiene una antigüedad de 200 años. Siempre existieron enfermedades de etiología infecciosa, solo que al carecer de MO se curaba empíricamente usando terapias por método de prueba y error. Los ancestros bacterianos fueron las primeras células vivas que aparecieron en la tierra. HITOS: 1665 Robert Hooke: Padre de la biología molecular, descubre que las células son las unidades estructurales más pequeñas con vida. 1673-1723 Anton Van Leeuwenhoek: Padre de la microbiología descubre el microscopio por observar microorg. 1858 Rudolf Ludwig Karl Virchow: Desafío la teoría de la generación espontanea con la de la biogénesis, al afirmar que toda célula viva proviene de una célula viva preexistente. 1861 Louis Pateur: Destierra la teoría de la generación espontanea. Desarrollo la teoría germinal de las enfermedades infecciosas. La pasteurización es la desgerminacion a niveles no patógenos. 1882 Koch: Padre de la microbiología cuántica. Desarrollo los medios de cultivo sólidos que permitieron realizar cultivos puros y con ello sienta las bases de la microbiología cuantitativa. Década de 1860 Joseph Lister: Sienta las bases de la antisepsia. La taxonomía es un área de la ciencia biológica que comprende 3 disciplinas muy distintas, pero muy interrelacionadas. Incluye: 1. Clasificación: Clasificar a los microorg permite encuadrarlos en distintos taxones jerárquicos: Especie, genero, familia, orden, división y reinos. Comienza a tener criterio científico con el desarrollo de nuevas tecnologías y el avance científico. Antiguamente se clasificaban a los microorg de acuerdo a sus características fenotípicas, que son la expresión de genotipos que podían estar alterados y eso determinaba sesgos al momento de clasificar científicamente a los microorg. La ingeniería molecular permite dibujar el árbol genético general de la vida, que es la evolución de la misma. Los imperios comprenden las denominadas eurobacterias o bacterias verdaderas para diferenciarlas de las arqueobacterias. Incluye mycoplasmas, clamidias y rickettsias. El árbol filogenético se utiliza para la clasificación a una molécula muy estable, considerada cronometro molecular. Esta molécula es el ARN ribosomal 16s para células procariotas y 18s para células eucariotas. En base al ARN se organiza la clasificación filogenética y así se reconoció a la célula ancestral primitiva (CAP), de la cual surgen 3 dominios o imperios (durante la evolución se han mantenido estables la mayoría de las características filogenéticas, genotípicas y fenotípicas, ósea que a este nivel, no se produjo diversidad microbiana en relación a la CAP), de los cuales 2 grandes ramas o troncos pertenecen a células procariotas y solo una pequeña rama a eucariotas. El linaje filogenético es el que se encuentra más alejado de la CAP. Expresan la presión selectiva que sufrieron los microorg durante la evolución: marcadas diferencias evolutivas determinantes de la diversidad microbiana. Surgen 5 reinos: Procariotae (bacteria y archeae), Protista (parasitos), Animalia, Fungi (hongos) y Plantae. La molécula básica de clasificación filogenética (ARN ribosomal), considerada cronometro evolutivo o molecular, permite detectar las relaciones entre CAP y diversidad microbiana. Debido a que los ribosomas son críticos para la síntesis proteica en interacción (ARN r) con ARN m y ARN t, están altamente obligados a mantenerse conservados a través del tiempo y así poder ser usados como relojes evolutivos de la vida. Las condiciones son: Distribución universal. No debe estar sujeto a transmisión horizontal (ADN extracromosomico) Debe poseer una constancia funcional de modo que a presión selectiva que actué sobre la molécula sea mínima. La tasa de cambio al menos de una parte de la molécula debe ser suficientemente baja como para permitir detectar relaciones evolutivas lejanas. Los ribosomas de las células procariotas 70s están formados por 2 subunidades: 1. Subunidad menor 30s (ARN ribosomal 16s + 21 proteínas asociadas) 3 2. Subunidad mayor 50s (ARN ribosomal 23s + ARNr 5s + 31 proteínas asociadas) Criterios fenotípicos con el aporte a la clasificación - Morfología macroscópica: Características de los patrones de crecimiento microbiano en medios de cultivo artificial. Incluye tamaño, textura y pigmentación. - Morfología microscópica: Tamaño, forma, apetencia tintorial, ubicación intra o extracelular del patógeno. Todo esto es ayudado de aparatos amplificadores. - Características de tinción: Capacidad de un microorg de colorearse, con diferentes técnicas de tinción, de acuerdo a la composición de la pared celular. - Requerimientos medioambientales:Capacidad de un microorg para crecer a diferentes temperaturas, diferentes niveles de oxido reducción, presión osmótica y ph. - Requerimientos nutricionales: Capacidad de un microorg de utilizar diferentes fuentes de Carbono y Nitrogeno como sustratos cuando crecen en ambientes artificiales. - Perfiles de resistencia: Producción, de microorg de resistencia a antimicrobianos, codificada en el ADN propio o extracromosomico. - Propiedades antigénicas: Perfil de distintos microorg de expresar antígenos específicos que se establecen por métodos serológicos e inmunológicos para determinar relaciones especificas entre grupos microbianos. - Propiedades subcelulares: Enzimas y toxinas. NOMENCLATURA Contenido biológico que permite nombrar a los microorg en forma inequívoca, universal y científica. Es binominal: - 1° se escribe el género en letra itálica mayúscula. Es el único que se puede abreviar. - 2° se escribe la especia en letra itálica minúscula. IDENTIFICACION Identificar a un microorg implica ubicarlo en un taxón específico. El taxón básico, está conformado por microorg que comparten la mayoría de las características fenotípicas y genotípicas. La especie se identifica mediante pruebas bioquímicas. Mientras que, la subespecie, se identifica mediante pruebas serológicas y/o moleculares. SUBUNIDAD 1.2: Bacterias Complejidad estructural: Células procariotas Organización celular: Unicelulares Las BACTERIAS son los organismos unicelulares más pequeños con capacidad para crecer, hecho indispensable para perpetuar la vida y ser considerados microorg vivos. Morfología: Cocos: Coco, diplococo, diplococo encapsulado, tétrada, estreptococo, estafilococo y sarcina. Bacilo: Cocobacilo, bacilo, diplobacilo, estreptobacilo y empalizada. Otros: Barra alargada, vibrio, coma, bastón, hélice, sacacorchos, filamentos y espiroquetas. Agrupación: Cadenas y racimos Tamaño: 0,1 um de diámetro por 5 um de largo. La observación de un preparado en fresco (sin colorear) se realiza en un microscopio de campo oscuro y permite observar movilidad. ESTRUCTURA: Elementos comunes: Pared celular, membrana citoplasmática y citoplasma bacteriano (ribosomas, genoma bacteriano, inclusiones citoplasmáticas y mesosomas). Elementos NO comunes: ADN extracromosómico, flagelos, esporas, capsulas, y fimbrias y pili. 1. Pared celular: Las funciones son: Protección: Evita el estallido osmótico de la célula. Rigidez: La lleva a cabo el peptidoglicano. 4 Antigenicidad (Ag. “O” somático) Apetencia tintorial (composición química) Sitio blanco de antimicrobianos mediante los Beta lactámicos: penincilina y cefalosporinas. Las propiedades son: - Antigenicidad: Presencia de diversos componentes como las proteínas. - Poder toxigénico. - Apetencia tintorial: Depende de la composición química de las paredes celulares. - La membrana externa es semipermeable, las sustancias hidrofobicas pasan sin problemas pero las que son hidrofilícas necesitan de porinas para poder llegar a la célula. CELULA GRAM POSITIVA Componentes: Peptidoglicano y acidos teicoicos y lipoteicoicos. 1. Peptidoglicano: Es el componente más abundante de la pared celular. La unidad estructural está compuesta por el N-acetil murámico (NAM) y N-acetil glucosamina (NAG); estos se repiten unas 80 veces, otorgándole gran rigidez. Tiene 2 porciones a) Glucosidica: Formada por unidades alteradas de amino azucares, NAM se une a NAG mediante uniones B1-4. b) Péptica: Representada por aa. Forman un tetrapeptido unido a NAM (D- Alanina, L-Alanina, Ac D- glutamico y L-Lisina). Síntesis: - La fase citoplasmática es la síntesis de precursores. - La fase de membrana citoplasmática es en la cual el precursor citoplasmático es modificado y transferido por un transportador liquido (Bactoprenol) a la pared celular, en este estadio se forma el monómero definitivo. - La fase parietal se divide en la elongación de las cadenas lineales (mediante una transglicolasas el liquido transportador se reintegra a la membrana) y en el entrecruzamiento de las cadenas lineales (unión de dos polímeros de diferente cadena mediante un pentapeptido de glicina). CELULA GRAM NEGATIVA Componentes: Peptidoglicano (otorga rigidez), espacio periplásmico (membrana citoplasmática + externa y peptidoglicano + enzimas degradativas) y membrana plasmática (hoja externa es la que se ancla al lipopolisacarido y la hoja interna se pliega hacia el interior de la célula). 1. Peptidoglicano: Incluido en el espacio periplásmico y la molécula de monómero se repite unas 20 veces. Tiene 2 porciones: - Glucosídica: Formada por unidades alteradas de amino azucares NAM y NAG unidos por enlace B 1-4. - Peptídica: Tetrapeptido unido a NAM (L-Alanina, Ac. D-glutamico, Ac. Mesodiaminopimelico y D-Alanina). La síntesis es la transcarboxilacion, una unión del polímero lineal. SITIO BLANCO DE ANTIBIOTICOS Citoplasma: Fosfomicina (inhibe el fosfoenol piruvato) y D-Cicloserina (inhibe la racemasa y sintetaza). Membrana citoplasmática: Bacitracina (inhibe al bactoprenol). Pared celular: Vancomicina (inhibe transglicolasa) y B-Lactamicos (inhibe transpeptidasa y transcarboxilasa). 2. Membrana citoplasmática Es una envoltura interna a la pared celular bacteriana, contiene al citoplasma. Las funciones son: Permeabilidad selectiva, actúa como una barrera osmótica (entrada de nutrientes y salida de metabolitos de desecho). Fosforilación oxidativa. Biosintética. 5 Sitio blancos de antimicrobianos. División celular. Salida de productos de excreción (toxinas y enzimas). Mesosomas laterales: Permiten eliminar desechos e hidratación en caso de esporas. Es el lugar de anclaje de fimbrias, pili y flagelos. Las propiedades son: - Mantiene intacto el medio interno. - Permeabilidad selectiva. - Da la forma a la bacteria. - Gran actividad enzimática, participando en la degradación de nutrientes. Composición: Formada por una bicapa lipídica (40% del total) y proteínas estructurales (60% del total). La estructura se ve representada por un mosaico fluido, como toda membrana plasmática. 3. Citoplasma bacteriano Al microscopio electrónico se pueden distinguir 2 zonas: - La zona periférica es granular y está compuesta por ribosomas. - La zona central es fibrilar y envuelve al genoma. Es un sistema coloidal formado por un 85% de agua, conteniendo además enzimas y minerales, también se pueden observar vacuolas, inclusiones y gránulos. 3.a) Ribosomas Se encuentran dispersos en la zona granular y se agrupan de a 3 o 4 unidos por una hebra de ARNm formando poliribosomas. Se pueden visualizar con el microscopio electrónico. Ocupan entre el 25 y 30% del peso bacteriano. El 80% se trata de ARN ribosomal del cual existen 3 tipos: 5s, 16s y 23s. Las células procariotas tienen una constante de sedimentación de 70s. El ribosoma es el encargado de llevar a cabo la síntesis de proteínas, traduciendo el código genético portado por el ARNm y complementado con el ARNr y ARNt. El ARNm, que carece de envoltura nuclear, es policistronico, tiene la capacidad de copiar varios segmentos de ADN a la vez. Composición: Bases nitrogenadas (puricas y pirimidicas), un azúcar ribosa, proteínas estructurales y ácido fosfórico. Función: Síntesis de proteínas. Sitio blanco de antibióticos. Traducción del código genético. 3.b) Genoma bacteriano Ubicado en la porción central o periférica del citoplasma. Constituido por ADN cromosómico o extracromosómico. El ADN propio es una molécula circular, de doble cadena, superenrollada que no contiene envoltura nuclear. Además, no tiene núcleo definido y carece de nucléolo e histonas. El ADN bacteriano conforma el 2 – 3% del peso seco bacteriano y en una célula en división el 20% del volumen celular. Composición: Bases nitrogenadas (púricas y pirimídicas), un azúcar desoxiribosa y ácido fosfórico. El ADN bacteriano es semiconservativo porquecada cadena sirve de molde para una complementaria, de tal forma que, la célula hija este formada por una cadena original y otra neosintetizada. Función: Posee la información genética propia. Sitio blanco de antimicrobianos. Permite establecer la clasificación taxonómica. Permite el diagnostico bacteriológico a nivel de subespecie mediante técnicas de pruebas moleculares. 6 Codifica entre 500 a 5000 genes. 3.c) Inclusiones citoplasmáticas Incluyen vacuolas y gránulos. Estos últimos están compuestos por glucógeno, azufre, polifosfatos, lípidos y glucosa. 3.d) Mesosomas Son invaginaciones de la membrana citoplasmática. Existen 2 tipos: Septales: División celular. Laterales: Eliminan productos de excreción e hidratación. 4. ADN extracromosómico Plásmidos: Es una molécula de ADN extracromosómico circular o lineal, que se replica y se transcribe independientemente del ADN cromosómico, mediante pili sexual (célula aceptora). Se transcribe por conjugación. Bacteriofagos: Son virus que infectan a las bacterias. Aportan a la biología molecular para insertar experimentalmente ADN en las bacterias. Se transmiten por traducción. ADN libre: Es el ADN de una bacteria lisada donante que se encuentra libre en el medio circundante y que se incluye en otra bacteria aceptora, es mediante pili sexual. Se transmite por transformación. 5. Cápsula Estructura: Bien definida y fuertemente adherida a la pared celular. Naturaleza química: Polisacarido. Tinción: Difícil de teñir, se tiñe con técnicas negativas. Ubicación: Cubierta externa de la pared celular. Diagnostico: Mediante técnicas serológicas directas. Vacunas: Elaboradas con polisacáridos capsulares. Función: Factor de virulencia: Antifagocitico. Antigenicidad. Clasificación taxonómica. Las cepas capsuladas son más patógenas. 6. Flagelos Estructura: Filamentos largos, finos y más comunes en los bacilos gram negativos. Tinción: Difícil de teñir, se usan técnicas negativas. Naturaleza química: Proteica. Ubicación: Fijados a la membrana citoplasmática y pared celular mediante pares de anillos. Diagnostico: Mediante técnicas serológicas directas. Disposición: Atrica, monoatrica, anfitrica, lofotrica y peritrica. Función: Clasificación taxonómica. Factor de virulencia: Quimiotactismo. Antigenicidad. Movilidad: Quimiotactismo. 7. Fimbrias /Pili Estructura: Filamentos rígidos mucho más cortos y finos que los flagelos. Naturaleza química: Proteica. Ubicación: Cubierta externa de la pared celular. Diagnostico: Reacciones serológicas directas. Vacunas: Fabricadas con pilina. Función: 7 Fimbrias: Adherencia y antigénicas. Pili: Intervienen en la transferencia de ADN extracromosómico y actúan en células gram negativas que son codificadas por plásmidos. 8. Esporas Estructura: Es la forma infectante y saprofita. La endospora es la forma lactante (inactiva) y no se reproduce. El pasaje de la forma vegetativa a la esporulada se llama esporulación y el proceso inverso, es la germinación. Naturaleza química: Dipicolinato de calcio, otorga resistencia. Tinción: Dificil de teñir, se usan técnicas negativas. Ubicación: La espora puede deformar o no el citoplasma bacteriano. Función: Antigenicidad. Clasificación taxonómica. Resistencia bacteriana a medios adversos. Proceso de esporulación 1) Se duplica el material genético mediante mitosis. 2) Comienza a formarse el septo de la espora y se va aislando el ADN recién duplicado junto con el citoplasma. 3) La membrana plasmática comienza a rodear al ADN, citoplasma y membrana aislada. 4) El septo de la espora rodea la porción aislada y forma la forespora. 5) Se forma una capa de peptidoglicano entre las membranas. Donde aparece como un cuerpo refractario rico en dipocolinato. 6) La espora se recubre de una cubierta de resistencia. 7) La esporulación es la liberación de la célula del medio por lisis celular. 8) Durante el proceso, se llevan a cabo cambios físicos y químicos que dan lugar a cambios morfológicos en la espora. Mycoplasmas Carecen de pared celular, esto las hace frágiles, flexibles y polimorfas. Son vulnerables a la lisis celular. El tamaño es de 0,2 um de diámetro por 0,3 um de largo. Se deben observar con el microscopio electrónico. El genoma está compuesto por ADN y ARN. No se pueden teñir con coloraciones diferentes usadas para bacterias con pared celular. Clámidas Son similares a las bacterias gram negativos. Presentan un ciclo de vida de 2 formas: Estado de multiplicación intracelular. Libre o extracelular infeccioso y no proliferante. Realizan síntesis proteica y biosíntesis. Son parásitos celulares obligados, dependen de las células eucariotas para obtener energía porque carecen de las vías EXOSPORO MEMBRANA EXTERNA CUBIERTA PROTEICA CORTEZA PARED DE LA ESPORA MEMBRANA INTERNA CORO 8 catabólicas para obtener ATP. El tamaño es de 0,2 um de diámetro por 0,5 um de largo. Se deben ver mediante ME. Se tiñen con técnicas giemsa, gram negativo y técnicas histológicas. Rickettsias Según la morfología son gram negativas. Son anaerobias y se pueden definir como parásitos celulares obligados. El tamaño es de 0,2 um por 2 um de largo. Presentan una localización geográfica generalmente localizada. CARACTERISTICAS PROCARIOTAS EUCARIOTAS Tamaño 0,2 um a 2 um de diámetro 10 um a 100 um de diámetro Núcleo Ausencia de envoltura nuclear y nucléolo Núcleo verdadero, presenta membrana nuclear y nucléolo. Organélas Ausentes Lisosomas, REL, RER, mitocondrias, aparato de golgi Flagelos Compuestos por estructuras proteínicas. Complejos compuestos por múltiples microtúbulos. Pared celular Presentan salvo los mycoplasmas que contienen peptidoglucano. No presentan pared celular salvo hongos con complejidad química diferente. Membrana plasmática No posee glúcidos ni esterol. Contiene glúcidos y esteroles que actúan como receptores celulares. Citoplasma Ausencia de flujo citoplasmático y esqueleto. Compuesto por ARN y ADN. Presenta citoesqueleto y flujo citoplasmático. Ribosomas Menor tamaño (70s) Mayor tamaño (80s) y menor tamaño (70s) en orgánulos. Cromosomas Único cromosoma circular que no contiene histonas. Múltiples cromosomas lineales con histonas División celular Fisión binaria Mitosis Recombinación sexual Ninguna: transferencia de fragmentos de ADN exclusivamente. Posee recombinación: mediante meiosis. Nutrición bacteriana a) Catabolismo: Obtención de energía química. b) Anabolismo: A partir de ATP se generan elementos y estructuras no estructurales como enzimas y toxinas. Categorías nutricionales 1. Fuente de carbono a) Autótrofos: La fuente de C proviene de materia inorgánica (CO2) b) Heterótrofos: La fuente de C proviene de materia orgánica como glúcidos y proteínas. 2. Fuente de energía a) Fototrofos: La energía proviene de la luz solar. b) Quimiotrofos: la energía proviene de procesos de oxido-reducción de compuestos orgánicos e inorgánicos. 3. Forma de ingestión a) Osmotrofos: Soluciones provenientes de hongos y bacterias. b) Fagotrofos: Fagocitosis. GRUPOS NUTRICIONALES FUENTE DE CARBONO FUENTE DE ENERGIA Fotoautotrofos CO2 Luz solar 9 Fotoheterotrofos Compuesto orgánico Luz solar Quimioautotrofos CO2 Sales inorgánicas Quimioheterotrofos Compuesto orgánico Compuesto orgánico Tipos de nutrientes: Básicos: Previa acción de exoenzimas que son asimiladas directamente por el medio, mediante difusión o transporte activo. Por ej: agua, carbono, hierro, cobre, etc. Metabolitos esenciales: Productos intermedios de procesos catabólicos bacterianos como el Acetil-CoA y el acido pirúvico. Factores de crecimiento: Son vitaminas, bases púricas y pirimídicas y aminoácidos. Pueden ser: a) Prototrofos: Fabrican sus propios factores de crecimiento.b) Auxotrofos: No sintetizan factores de crecimiento. Requerimientos nutricionales: - Macronutrientes: Carbono, Nitrógeno, Oxigeno, Magnesio, Hierro, Flour, Azufre, Potasio y agua. - Micronutrientes: Cobalto, Zinc, Manganeso y Cobre. - Factores de crecimiento: Vitaminas, bases nitrogenadas y aminoácidos. Condiciones físico-químicas: 1. Presión osmótica a) No halófilas: La mayoría se desarrollan a una concentración de 0,1 a 1%. b) Halófilas: Necesitan para desarrollar una concentración de 3,5 a 10%. 2. Temperatura a) Psicofilas: De 5 a 35 grados. La óptima es 20°C. b) Mesofilas: De 20 a 40 grados. La óptima es 37°C. c) Termófilas: De 40 a 80 grados. La óptima es 45°C. 3. Potencial redox a) Anaerobias estrictas: 0% de oxigeno. b) Anaerobias facultativas: No necesitan oxigeno pero si esta presente en bajas concentraciones (5 a 10% de CO2). c) Anaerobias aerotolerantes: Toleran 02 por cortos periodos porque no lo usan metabólicamente. d) Aerobias obligados: Necesitan oxigeno para la presión atmosférica (21%). 4. Ph: El margen varía de 3 a 9. a) Bacterias: Neutro (6,8 – 7,2). b) Hongos: Acido (5 – 6). c) Protozoarios: Básico (8 a 9) La superoxidomutasa (SOD) es producida por bacterias como factor de evasión a los mecanismos de oxigeno. Es producida por los macrófagos. TIPO DE BACTERIAS CRECIMIENTO AEROBIO CRECIMIENTO ANAEROBIO SUPEROXIDOMUTASA VIA METABOLICA Aerobia estricta + - + Respiración Anaerobia estricta - + - Fermentación Anaerobia facultativa + + + Respiración y fermentación Aerotolerante + + + Fermentación Microaerofilo (+) + (+) Fermentación 10 Relación hospedante – bacteria: Entre los microorg de virulencia de los microorg y respuesta inmune del hospedador se establece una relación que dará como resultado el mantenimiento del estado de salud ganaron los mecanismos del sistema inmune) o de enfermedad (ganaron los mecanismos de virulencia de bacterias). Condicionantes: Ingreso: Vía adecuada y cantidad suficiente. Colonización: Mecanismos de adhesión y evasión de la respuesta inmune. Diseminación: Mediante difusión local (enzimas) o difusión sistemática (toxinas) Daño: Sistémico (generalizado) o local (circunscripto). Multiplicación: Es positiva o negativa dependiendo de: Disponibilidad de nutrientes. Producción de exoenzimas. Capacidad de adaptación de nutrientes. Producción suficiente de ATP. Transmisión: Puede ser directa o indirecta. Resistencia inmune: - Proteasas: Degradam proteínas del sistema de complemento o hidrolizan Anticuerpos. - Leucotoxinas: Lisan globulos blancos (neutrofilos, macrófagos y linfocitos) - Capsula. - Penetracion del citoesqueleto: Virus o bacterias. - Coagulasa. - Evadir la fagocitosis. - Inhibir el peristaltismo. - Destrucción del moco (mucinas): Exponen receptores celulares. Relación bacterias – células eucariotas: Una vez infectado el hospedador podrán darse las siguientes situacones clínicas: - Portador asintomático: Colonizado sano (constituye un problema epidemiológico). - Enfermedad aguda/crónica. - Enfermedad crónica. - Muerte. SUBUNIDAD 1-3: Virus Los virus son estructuras subcelulares que no encuadran en ningún reino. Son parasitos celulares obligados porque carecen de metabolismo propio y se multiplican dentro de las células vivas usando maquinaria biosintética de las células blanco. Producen proteínas endógenas (producida por la celula hospedante) pero heterologas (codificadas por el genoma viral). El tamaño es inferior a la bacteria mas pequeña, se miden en nanómetros. Espectro de hospedantes Invertebrados, vertebrados, plantas, hongos, bacterias y parasitos. La mayoría solo pueden infectar tipos específicos de células (tropismo) y de una sola especia del hospedador. En casos especiales, cruzan la barrera de especie en donde expresan su agresividad y a la vez, se expanden. No obstante, prefieren la simbiosis. Estructura: Genoma viral: ADN o ARN. Puede ser: Lineal, circular, segmentados, monocatenarios dimericos y genoma con enzimas Capsómero: Proteínas que en conjunto constituyen la Capside. Envoltura: La poseen algunos virus animales. Los virus ARN monocatenarios pueden ser de polaridad positiva o negativa (es positiva cuando la secuencia de nucleótidos virales es la misma que la del ARN m que sintetiza proteínas virales). Clasificación: Tamaño: Se determina por el Microscopio Electronico. Simetría de la cápside: Icosaedrica o cubica; helicoidal; compleja. Lugar de replicación: ADN en el nucleo y ARN en el citoplasma. 11 Peso molecular: Se determina por ultra centrifugación. Sensibilidad al éter y al cloroformo. Virus ADN Cadena doble - Con envoltura: Viruela, Herpes simplex - Sin envoltura: Adenovirus, Polioma. Cadena simple - Sin envoltura: Parvovirus ARN Cadena doble - Con envoltura: Fago O6 - Sin envoltura: Reovirus Cadena simple - Con envoltura: Influenza, Paotidis, Rabia - Sin envoltura: Poliovirus Nomenclatura Orden: Virales. Familia: Viridae. Por ej: Herpes viridae. Subfamilia: Virinae. Por ej: Herped virinae. Género: Virus. Por ej: Papiloma virus. Especie: Castellanizado. Por ej: Herpes virus humano tipo I o Herpes siemple I. Otros términos: Virusoide: Virus defectuoso, incompleto y satélite de otros. Virusoide: Virus defectuoso, incompleto y satélite de otros. Viroide: ARN sin cápside. Priones: Proteínas sin genoma. Transfección: Células no vulnerables, en las cuales el virus ingresa mediante fagos. Permisividad: La célula blanco es posibilitadora de replicación viral. Vulnerabilidad: Células con receptores virales. Virón: Unidad vírica. Virus: Colonia de virones. Infectivo: Cuando el virus esta completo en todas sus estructuras. Espícula: Adhesina viral a la célula hospedadora. Cápside: Conjunto de capsómero que envuelven al genoma viral. Capsómero: Proteínas que en conjunto constituyen la cápside. Lítico: Efecto de muerte de la célula hospedadora, producto de la replicación viral. Polaridad positiva: Cuando la secuencia de nucleótidos del genoma viral es igual al ARN mensajero. Transformante: Efecto tumoral. Tipos de infección La simple vulnerabilidad no garantiza a la replicación viral, sino que debe ser además permisiva, surgen diferentes tipos de replicación. a) Infección restrictiva: Células vulnerables y transitoriamente permisivas. Si en el momento de la replicación no es permisiva, no hay replicación y el virus muere. b) Infección abortiva: Ocurre cuando la célula blanco posee interferon alfa (inhibe la transcripción del genoma viral). No hay replicación y la célula blanco sobrevive. 12 c) Infección latente: Solo hay replicación en estadios de permisividad. El virus queda acantonado en los ganglios sensitivos de los pares craneales. Por ej: Herpes virus en el ganglio de Gasser del V par (Trigémino). La célula infectada no muere. d) Infección productiva: la célula es vulnerable y permisiva. La replicación no tiene límite y produce lisis de la célula blanco. Efectos 1. Citopatico: La célula blanco replica el virus hasta agotar su maquinaria enzimática y termina con la lisis de la célula hospedante. 2. Inflamatorio: La célula blanco replica al virus dentro de una vacuola y en forma limitada expulsando la progenie viral. Sin lisis celular. 3. Tumoral: Lo producen los virus oncogenos. Cuando una célula carece de restricciones en su proliferación, lo hace sin control, produciendo una masa tumoral o neoplasia, que puede ser benigna o maligna según su capacidad de invasión, crecimiento, irrigación, etc. Por ej: Papiloma virus (Tipo 6 y 11 son benignos y tipo 16 y 18 son malignos) Modelos La infección puede ser: a) Aguda: Con síntomas: Enfermo. Sin síntomas: Portador asintomático. b) Persistente (portador asintomático): Crónica: En virus ARN y obedece a defectos en los mecanismos de resistenciadel hospedador. Latente: En virus ADN y retrovirus. Se produce en células vulnerables pero no permisivas. Hay equilibrio entre la relación virus – hospedador. Lenta – Activa: La activa implica alto grado de replicación viral. La virosis son generalmente graves. Transformante: En células tumorales. Replicación 1. Periodo inicial a) Fase temprana: Fijación o adsorción. Penetración. SP Tempranas: Decapsidacion. Síntesis del genoma viral b) Fase tardia: Síntesis de proteínas tardias. Ensamblaje. Maduración Liberación. 2. Periodo de incremento a) Fase temprana: Fijación o adsorción. Penetración. SP Tempranas: Decapsidacion. Síntesis del genoma viral b) Fase tardía: 13 Síntesis de proteínas tardías. Ensamblaje. Maduración Liberación. La síntesis de proteínas tardías se forma las proteínas que conforman la cápside. Son proteínas endógenas pero heterólogas (endógenas porque las produce la célula blanco del hospedador y heterólogas porque esas proteínas fueron codificadas por el código genético). También, son las que van a reemplazar a las proteinas estructurales de membrana en caso de virus envuelto. A diferencia de la curva de crecimiento bacteriano, en la cual tras la infección hay un periodo de adaptación (meseta), seguida de crecimiento exponencial o logarítmico, en la cual, la curva de crecimiento viral, tras la infección se produce un descenso de la carga viral pudiendo llegar a niveles indetectables de virus, lo que corresponde a la etapa de eclipse (la curva decrece luego de la infección). Hay más infecciones virales (simple colonización) que enfermedades virales o virosis. Existen millones de virus pero la mayoría no nos enferman y si lo hacen, son enfermedades autolimitantes y leves, salvo cuando se produce un salto de especie (Por ej: gripe avaria y su transpolacion mortal a humanos). Esto se logra gracias a la cantidad de mecanismos inmunológicos naturales y adquiridos que poseemos contra los virus. Modelo de relación virus – hospedante Inmunidad 1. Natural a) Externos: Piel y mucosas ADN asas y ARN asas (Enzimas que lisan el ADN y/o ARN viral) b) Internos: Interferon alfa. Sistema del complemento (C3b: Opsonizacion y fagocitosis; C5a: Quimiotactico; C9: Complejo lítico de ataque de membranas). Fagocitos Inflamación Células NK: Producen perforinas, gramzinas y citoquinas. 2. Adquirida a) Respuesta inmune celular (LTc): Mediante perforinas de la celula blanco o gramzinas (muerte celular programada). b) Respuesta inmune humoral (Ig- Anticuerpos): Acción de los LB que producen Ig opsonizante, neutralizantes, activadores del Sistema del complemento. Los LT cooperan con los LB transformándolos en plasmocitos productores de anticuerpos. Bacteriofagos Los bacteriófagos son virus que infectan a bacterias. Según sus características del ciclo de replicación a los bacteriófagos se los clasifica en: a) Virulentos: La replicación implica ciclos líticos, con lisis de la célula hospedante al liberar la progenie viral (bacteriófagos). b) Temperados: La replicación implica ciclos lisogenicos, sin lisis celular, con integración del ADN viral al ADN bacteriano. No hay lisis de la célula hospedante, pero si inducción a formar mecanismos de virulencia tales como toxinas. Por ej: El bacilo diftérico es lisigenisado por un bacteriófago. SUBUNIDAD 1-4: Hongos Siempre se considero a los hongos agentes responsables de descomposición de alimentos y enfermedades micoticas. Hoy Salud – enfermedad Virus: Capacidad de mantenerse, diseminarse y reproducirse Hospedante: Respuesta inmune 14 se los utiliza en la industria alimentaria (levadura de pan, cerveza, queso, etc), industria farmacológica (Antibióticos: La penicilina fue el primer antibiótico conocido, obtenido de hongos), vitaminas sustitutas del plasma, anticancerigenos, aceleradores de la cicatrización, entre otros. Se comportan como saprofitos, comensales o parásitos. Producen micetismo por ingesta de hongos tóxicos (toxico infección) y microtoxicos por ingesta de alimentos con toxinas fúngicas (intoxicación). Generalidades. Reino: Fungí. Complejidad estructural: Células eucariotas. Organización celular: Pluricelulares (Por ej: Hifis a temperatura ambiente), Unicelulares (Por ej: Levaduras) y Dimorfos (Solo algunos patógenos). Poseen pared celular rígida. Los ribosomas son 80s : 60 s y 40s. La reproducción es mediante esporas sexuales o asexuales. Son inmóviles y quimioheterotrofos. Se nutren por absorción (osmotrofos). Diversidad: Se conocen más de 1 000 000 especies, menos de 500 se relacionan con el hombre y unos pocos lo enferman. Estructura: Núcleo verdadero: Con envoltura nuclear y nucléolo. Mitocondrias RER y REL: Síntesis de proteínas. Aparato de Golgi: Empaquetamiento y traslado o expulsión. Pared: Compuesto por quitina, mananos, glucanos y celulosa. Poseen proteínas asociadas a un polisacárido y lípidos constituyendo antígenos. La mayoría de los antígenos fúngicos se localizan en la pared, siendo los mananos y glucanos estructurales, los principales Ig. Membrana citoplasmática: Ergosterol. Capsula: Algunos poseen capsula con capacidad inmnogena y antifagocitaria. Es de naturaleza del polisacárido. Morfología Los hongos unicelulares son levaduras: Células asiladas, ovales, de 3 a 10 um de diámetro. Los hongos pluricelulares están constituidos por estructuras filamentosas denominadas hifas. El conjunto de las mismas forma un micelo; células alargadas, cilíndricas, de 3 a 12 um de diámetro, dispuestas linealmente pudiendo alcanzar varios centímetros de longitud. Cuando estas hifas crecen y se entrecruzan desordenadamente alcanzan un tamaño macroscópico, se conoce como mohos. El micelo se diferencia en: Vegetativo: Penetra en los sustratos nutritivos. Aéreo: Se dispone en la superficie y contiene estructuras reproductoras. Reproducción Los hongos se reproducen por esporas sexuales o asexuales. Las levaduras se reproducen por brotes o germinación. Los hongos filamentosos se elongan y tabican en los extremos (no se separan de la célula hija). Existe un tipo especial de espora que constituyen la forma de reproducción y resistencia llamadas clamidosporas. Metabolismo Casi todos los hongos son aerobios, existineod algunos anaerobios facultativos y estrictos. Son osmotrofos (obtienen los nutrientes por absorción) y quimioheterotrofos (obtienen la energía por catabolismo y necesitan una fuente de carbono organico). Algunos hongos patógenos son saprofitos de vida libre, favorecidos por materia organica en descomposcion y compuestos nitrogenados. Toleran variaciones de pH, siendo el acido el optimo para su desarrollo. La temperatura en la que viven varía de 10 a 40°C. Relación hongo – hospedador La mayoría de los hongos se comportan como patógenos oportunistas: 1. Alergias: Respuest inmune exagerada a Antigenos fúngicos. 2. Toxicidad: Efecto sistematico por producción y liberación de toxinas. 15 3. Micosis: Enfermedad por invasión (las enzimas son un mecanismo directo de agresión y la respuesta inmune, mecanismo indirecto) Poder patogénico Dimorfismo: Durante la infección ciertos hongos patógenos infectan como pluricelulares y parasitan como unicelulares, resistiendo a la fagocitosis. Pared del hongo: Inhibe la activación del sistema del complemento. Adhesinas Capsula: Antifagocitica Enzimas: Favorecen la diseminación. Toxinas: Efecto sistemático. Tigmotropismo: Facilidad de ingreso por pequeñas efracciones en los tejidos. Formación de biopeliculas: El biofilm es un mecanismo protector cuando vive en una comunidad con otros microorg. Desarrollo intracelular: La penetración del citoesqueleto los resguarda de todo mecanismo inmunológico. Clasificación de las micosis Superficiales: Afectan a la piel, mucosas y faneras (uñas y pelo). La transmisión es por contacto directo. No dejaninmunidad y son muy frecuentes. Son fácilmente curables. Cutáneas: Contienen tiñas en diferente localización. Subcutáneas: Afectan dermis, Tejido celular subcutáneo, músculo, huesos y articulaciones. No son transmisibles. Son producidad por hongos saprofitos en suelo y vegetales. Se encuentran en zonas rurales. Tienen una evolución lenta y son de difícil curación. Profundas: a) Primarias No se transmiten de persona a persona. La diseminación es lematica y/o linfática. Penetran por una via inhalatoria produciendo una primoinfeccion pulmonar, salvo en pacientes inmunodeprimidos, en los que se expesa secundariamente en boca con ulceras crónicas. b) Secundarias Es frecuente en pacientes inmunodeprimidos. La fuente de infección es endógena o exógena. El agente etiológico son hongos de la microbiota comensal. Por ej: Candidiasis. La infección es por contacto directo, inhalación o traumatismos cutáneos. SUBUNIDAD 1-5: Parásitos Generalidades Dominio: Eukayra. Reino: Protista. Complejidad estructural: Células procariotas. Organización celular: Unicelulares. Tamaño: De 3 a 10 um de diámetro. Reproducción: Sexual: Mediante meiosis. 16 Asexual: División binaria: el trofozoito se divide en 2 mediante mitosis. División múltiple: El trofozoito divide respectivamente el núcleo y los orgánulos, finalmente los cubre de una membrana gruesa y los libera. Carecen de pared celular y presentan una membrana citoplasmática gruesa. El metabolismo es heterótrofo. Se pueden observar mediante microscopio óptico en fresco o con tinciones especificas. La absorción de nutrientes es mediante fagotrofos o osmotrofos. Son muy antigénicos pero evaden la respuesta inmune por diversos mecanismos. Clasificación Según los órganos o tejidos que afectan: Superficiales: Parásitos de piel o mucosas. Profundos: Parásitos de la sangre y órganos internos. Según su relación con las células: Pueden ser intra o extracelular. Según su movilidad: Phylum sarcomastigophora: Subphylum mastigophora: Presentan flagelos y/o membrana ondulante. Por ej: Trichomonas vaginalis. Subphylum sarcodina: Emiten pseudoporas. Por ej: Entamoeba gingivalis. Pylum ciliophora: Presentan cilios. Por ej: Balantidium coli. Pylum Apicomplexa (inmóvil): Posee un complejo viral. Por ej: Taxoplasma gondi. Estadios evolutivos Los protozoarios se caracterizan por tener un ciclo biológico complejo, formado por un conjunto de etapas y transformaciones que experimenta el parasito durante su desarrollo. El trofozoito es la forma parasitaria y lábil, metabólicamente activa y es la forma como se multiplica y generalmente en algún momento del ciclo vital es móvil. El mecanismo de transmisión es directo. El quiste es la forma de resistencia, es metabólicamente inactivo, no multiplicativo e inmóvil. El mecanismo de transmisión es directo e indirecto. Reproducción La reproducción de los protozoarios puede ser sexual o asexual (pudiendo algunos hospedadores alternarse ambos). En el hospedador donde el parasito se reproduce sexualmente se conoce como hospedador definitivo. En el hospedador en donde el parasito se reproduce asexualmente se conoce como hospedador intermediario. Se entiende por ciclo biológico o ciclo de vida de un protozoario a la sucesión de estadios que permiten que el parasito llegue al hospedador, se multiplique y alcance la forma infectante. Mecanismos patogénicos de los protozoarios Acción mecánica: Cuando la multiplicación produce obstrucción de un conducto. Traumática: Perdida de continuidad tisular. Expoliatriz: Por sustracción (utilización de nutrientes del hospedador). Toxica: Mediante producción de toxinas. Citopatogena: Alternan la función celular. Reacciones inmunológicas: Fundamentalmente relacionadas a las alergias. Variación antigénica. Relación hospedador – parasito Determina que la infección se transforme en enfermedad infecciosa (parasitosis). Está determinada por: Inoculo infectante: Numero de parásitos. Mecanismos evasivos del sistema inmune que poseen impedinas. Resistencia inmune del hospedador: Condiciones previas a la infección. Los parásitos son más frecuentes en zonas tropicales, en grupos humanos con condiciones socioeconómicas y sanitarias desprotegidas. Por ej: sin agua potable, sin un buen servicio de eliminación de excretas, con falta de educación para la salud. 17 Los parásitos son crónicos porque tienen una evolución lenta. Pueden ingresar al hospedador por diferentes vías: cutáneas, digestiva, respiratoria, transplacentaria y transfuncional. Si la resistencia del hospedador está equilibrada con la virulencia del parasito pueden darse infecciones asintomáticas o subclinicas. Cuando disminuyen las defensas del hospedador por oportunismos se producen parasitemias graves por distintos mecanismos. Por ej: toxicidad, acción mecánica, traumática, citopatogenicidad y reacciones de hipersensibilidad. SUBUNIDAD 1 – 6: Pilares de diagnostico etiológico El diagnostico de certeza de las enfermedades infecciosas se basa en 3 pilares precedentes. Cada uno de ellos por separado constituye un diagnostico presuntivo, solo los 3 juntos conforman el diagnostico de certeza. Pilares: Diagnostico clínico. Diagnostico de laboratorio. Información epidemiológica. Funciones del laboratorio de enfermedades infecciosas - Identificar el agente causal: A partir del aislamiento del material patológico en medios de cultivo y obtención de un cultivo puro. - Evaluar la sensibilidad del agente infeccioso a los antimicrobianos. - Brindar información epidemiológica: Permite definir fuentes comunes de infección, aplicar programas preventivos o terapéuticos eficaces para eliminar al patógeno. - Informar enfermedades de notificación obligada tales como cólera, botulismo, tetanos, diftera, meningitis, fiebres hemorrágicas virales, E. Coli entero hemorrágica (ECEH), gongorrea, sífilis, tuberculosis, etc. Terminología empleada en la epidemiologia Brotes: Cuando se presenta una cantidad mayor de la normal de individuos enfermos o infecciosos que surgen en un periodo de tiempo relativamente corto. Fuente común: Cuando el agente etiológico responsable de una epidemia o de un brote se origina de una sola fuente o reservorio. Incidencia: Porcentaje de personas enfermas en una población dada en un momento particular. Tipificación de cepa: Caracterización de agentes etiológicos basados en pruebas de laboratorio y destinadas a establecer relaciones entre si, durante un brote o epidemia. Las pruebas de laboratorio destinadas a tipificar cepas, reciben el nombre según la técnica empleada, asi tenemos: - Serotipificacion: Por pruebas serológicas. - Biotipificacion: Por pruebas bioquímicas. - Fagotipificacion: Por fagos. Vector: Una entidad viva (animal, insecto o vegetal) que transmite el agente etiológico. Vehículo: Entidad no viva que está contaminada con un agente etiológico y como tal es el medio de transmisión de ese agente. Morbilidad: Estado de enfermedad y sus efectos asociados al hospedador. Mortalidad: Muerte por resultado de una enfermedad. Tasa de morbilidad: Relación entre la cantidad de personas que se infectan y las que se enferman. Tasa de mortalidad: Relación entre la cantidad de personas enfermas y las que se mueren por ella. Etapas del diagnostico de laboratorio bacteriológico Fase pre analítica 1. Decisión de efectuar el estudio. Si se justifica debe realizarse lo más precoz posible. Solicitud de análisis: - Debe contener datos personales del paciente de la muestra que se envía. - Tipo de análisis: Búsqueda de bacterias o sus anticuerpos específicos. - Información relevante (viajes, profesión, etc). - Tratamiento previo de antimicrobianos. 18 2. Obtención de la muestra clínica - Que muestra debo tomar: Representativa, en cantidad suficiente y evitar contaminación. - Como debo obtener la muestra: Conmateriales estériles, con envases hermeticos, siguiendo normas de bioseguridad y con técnicas especificas según la sospecha clínica. - Cuando obtener la muestra depende de: Periodo evolutivo de la enfermedad, historia natural y suspender el tratamiento con antimicriobianos. 3. Transporte y conservación de la muestra. Fundamental: - Mínima demora para transportar hasta el laboratorio. - Mantener la viabilidad de los microorg. (refrigeración, anaerobiosis, etc) - Seguir normas de bioseguridad - Acompañar de solicitud con datos del paciente. Rechazo de la muestra clínica por el laboratorio: - Cuando la información en el rotulado no coincide con la información de la solicitud (difiere el nombre del paciente o el origen de la muestra) - La muestra no se transporto a una temperatura adecuada. - La muestra no se transporto en un medio adecuado (muestra para tipificar bacterias anaerobias remitidas en medio de transporte aerobios) - L a cantidad de muestra es insuficiente para las pruebas que se deben realizar. - El tiempo de transporte excede las 2 hs y la muestra no se envió en medio de transporte. - La muestra se seco. - La muestra se derramo en el contenedor de transporte. Fase analítica Implica todo procedimiento que se realiza en el laboratorio para identificar al patógeno, determinar su sensibilidad a los antibióticos y obtener información epidemiológica. 4. Procesamiento de la muestra a) Métodos directos: Observación macroscópica: Pus, moco, sangre, saliva. Para ver pigmentación, viscosidad, etc. Observación microscópica: El uso del microscopio es esencial para el diagnostico de enfermedades infecciosas. Para aumentos entre 100 y 2000 x se emplean los MO, en los cuales la luz es la fuente de iluminación. Estos microscopios no son útiles para mayores aumentos debido a su escaso poder de resolución (Es la capacidad de un microscopio para diferenciar 2 puntos muy cercanos. Los MO son incapaces de distinguir entre 2 puntos separados por medio de 0,23 um) Para poderes de resolución mayores se requiere el uso de ME, que sustituyen la luz por haces de electrones y las lentes de vidrio de los MO por lentes electromagnéticas que enfocan el haz de electrones sobre el preparado a través de un tubo al vacio. Los electrones así dirigidos pueden atravesar la muestra y se denominan ME de transmisión o bien incidir sobre ella provocando la liberación de nuevos electrones y estos son los ME de barrido. En el ME el aumento supera los 200 000 x Los electrones tienen una longitud de onda 100 000 veces menor que la luz visible (por eso el gran incremento en el poder de resolución). Se usan para la observación de virus o estructuras internas de la célula. MICROSCOPIOS CARACTERISTICAS UTILIDAD Fondo claro Usa luz visible. El poder de resolución es hasta 0,23 um. Muestra sobre fondo brillante. Preparados teñidos. Fácil uso Fondo oscuro Usa luz visible difractada. Se observan los microorg brillantes sobre fondo oscuro. Observación de microorg de difícil tinción. Se observan movimientos. 19 Contraste de faces Usa luz visible difractada. El preparado se observa con diferentes grados de brillos y contrastes. Observación de estructuras en su preparado en fresco. Fluorescencia Usa luz UV. Los microorg se ven fluorescentes sobre un fondo no fluorescente. Observar microorg con estructuras fluorescentes o aplicando técnicas fluorescentes sobre el preparado. Electrónico Emplea haces de electrones en vez de luz. Permite observar estructuras menores a 0,23 um. Observación de virus. Ultraestructuras subcelulares. La imagen se ve proyectada en una pantalla. Características de un ME Poder de resolución: Mayor a 0,23 um. Longitud de onda de los electrones: 100 000 veces menor que la longitud de la luz. Fuente de iluminación: Haz de electrones. Lentes: Electromagneticas que enfocan el haz de electrones sobre el preparado a través de un tubo al vacio Los electrones pueden atravesar la muestra: Me de transferencia o impactar sobre la muestra generando dispersión de los ME de barrido Tipos de microscopios: - Óptico: Campo claro, campo oscuro, contraste de faces, interferencia, luz polarizada, fluorescencia y laser confocal. - Electrónico: ME de transmisión y ME de barrido Cultivo y aislamiento: Métodos de cultivo Son preparados que intentan, artificialmente, reproducir las condiciones del ambiente natural en que se desarrollan los agentes microbianos. Deben cubrir todas las necesidades nutricionales de las bacterias a identificar. Hay una gran cantidad de sustancias que se añaden a los medios de cultivo. Por ej: agua, peptonas (fuente de Nitrogeno), hidratos de carbono (fuente de energía y carbono), extracto de carne (aporta vitaminas, oligoelementos, acido láctico), extracto de levadura (fuente de aa, vitaminas y factores de crecimiento), pueden además agregarse agentes solidifícante como el agar. Preparación de medios de cultivo Para preparar un medio de cultivo, las sustancias que lo componen se disuelven en agua, se calientan para favorecer la disolución de la muestra y una vez obtenida una solución homogénea se ajusta el pH óptimo. Posteriormente, la mezcla se reparte en tubos o frascos para su esterilización en autoclave si el medio permite temperaturas altas, caso contrario, se esteriliza mediante la técnica de tindalización. Concluida la esterilización, los medios se conservan en refrigeración (4 a 6°C) hasta el momento de ser utilizados. Los medios que se usaran en forma inmediata se colocan en placas de Petri o tubos de ensayo. Clasificación: Según su origen: - Naturales: Por ej: Huevo embrionario para el desarrollo viral. - Sintético: La formula es totalmente conocida y no se debe modificar para obtener experimentalmente un resultado. - Semisintetico: Formula conocida y posible de variar para mejorar el desarrollo de microorg. Según su consistencia: - Líquidos: Los constituyentes del medio están disueltos en agua sin solidificantes. Sirven para mantener cultivos bacterianos. El desarrollo bacteriano se comprueba por enturbiamiento del medio (anaerobio facultativo), por precipitado del desarrollo en el fondo del tubo (anaerobio obligado) o por crecimiento en superficie en forma de nata (aerobio obligado). 20 - Sólidos: Se obtienen agregando agar al medio liquido en una proporción del 1,5 al 2%. El medio solido se puede distribuir en placas de Petri o tubos de ensayo. Los medios sólidos permite que las bacterias desarrollen formando colonias, lo cual fue un importante logro de la microbiología cuántica. - Semisólidos: Contiene agar en una concentración menor al 1% se usan por ejemplo para determinar movilidad bacteriana. Según su utilidad: - Básicos: Contienen los nutrientes mínimos para bacterias no exigentes y fundamentalmente se constituyen en la base para elaborar los otros medios. - Selectivos: Medio básico que se suplementa con sustancias que inhiben el desarrollo bacteriano de una microbiota acompañante. Por ej: Antibióticos, colorantes bacteriostáticos y sales biliares. - Enriquecidos: Medio násico que se suplementa con sustancias muy nutritivas para favorecer el desarrollo de bacterias exigentes. Por ej: Sangre, suero y hidratos de carbono. - Diferenciales: Medio básico al cual se le incorpora todo lo necesario para poner en evidencia una prueba bioquímica que se diferencia en 2 especies de un mismo género. Por ej: Sustrato (azúcar) + indicador de pH. MEDIO CC COMPONENTES OBJETIVO PRINCIPAL Agar sangre (enriquecido y diferencial) Medio básico enriquecido con sangre de carnero al 5% Cultivo de microorg con requerimientos especiales de nutrientes y determinación de reacciónes hemolíticas. Agar chocolate (enriquecido) Medio básico enriquecido con una solución de hemoglobina al 2% obtenida por calentamiento del agar sangre.Para lisar los glóbulos rojos y liberar la hemoglobina. Cc cultivo de especies patógenas de Neisseria. Agar Thayer Martin (enriquecido y selectivo) Agar sangre enriquecido con hemoglobina y suplementado con vancomisina, colistina y histadina. Para N. gonorrhoeae. Agar Macconkey (diferencia y selectiva) Medio básico con lactosa y sales biliares o cristal violeta como factores de inhibición y rojo neutro como indicador. Para la selección y diferenciación de entero bacterias en muestra de materia fecal. Agar eosina azul de metileno (EMB) Medio básico con lactosa y cristal violeta y sales biliares como inhibidores y rojo neutro como indicador. Diferencia de generos de bacilos entéricos fermentadores de lactosa. Agar sangre con cistina y telurito Agar nutritivo con 5% de sangre de carnero. Aislamiento de C. Diphtheriae. Crecimiento o desarrollo bacteriano Se denomina asi al desarrollo bacteriano en un medio de cultivo. Se logra sembrando las bacterias e incubándolas en estufas de incubación en las que se ajusta las condiciones físicas tales como temperatura, potencial redox, presión osmótica, humedad, pH, tiempo de desarrollo (todas estas son condiciones de cultivo). En los medios de cultivo liquido el desarrollo bacteriano no forma colonias solo produce enturbamiento, precipitado o una capa superficial de desarrollo según la bacteria sea anaerobia facultativa, anaerobia o aerobia respectivamente. En los medios de cultivo solido el desarrollo bacteriano forma colonias. Es importante destacar las características clave de una colonia bacteriana porque es un criterio utilizado con frecuencia para caracterizar el crecimiento bacteriano. Los criterios son: - Tamaño. - Formación de pigmento. - Forma de la colonia, elevación y bordes. - Aspecto de la superficie de la colonia. - Cambio en el medio como resultado del crecimiento bacteriano. - Olor. La forma de la colonia puede ser: - Puntiforme: Cabeza de alfiler. 21 - Circular. - Filamentosa: Circular con bordes desflecados. - Irregular. La elevación de la colonia: - Plana: Característica de bacterias anaerobias facultativas. - Elevada y convexa: Características de bacterias aerobias. - Encerradas: Característica de bacterias anaerobias. Los bordes de la colonia: - Lisos. - Irregular. Cultivo Es el desarrollo de una sola especie bacteriana en un medio de cultivo. En un medio de cultivo solido en placa, se siembra por agotamiento el material patológico en forma de estrías, se incuba y se observa el desarrollo de colonias. En la zona donde hubo menos bacterias inoculadas (últimas estrías) se observaran colonias aisladas. Tomo con el ansa la colonia cuyo morfotipo se corresponde con la bacteria en estudio y la inoculo en un medio de cultivo liquido y la incubo. Todo el desarrollo bacteriano se corresponderá a una sola especie bacteriana y esto es un cultivo puro. El aislamiento de una bacteria en cultivo puro es imprescindible para realizar pruebas bioquímicas y antibiograma. Identificación: a) Pruebas bioquímicas: Se realizan a partir de un cultivo puro. Son pruebas metabólicas en las que se trata de poner en manifiesto un producto metabólico intermedio o final mediante un sustrato adecuado y un reactivo o indicador de pH que al virar de color indicara si la prueba es positiva o negativa. Se identifica a nivel de especie. El total de pruebas bioquímicas a realizar esta determinado para cada especie. - Prueba de producción de indol: Fundamento: La prueba se usa para determinar la capacidad de un microorg para degradar el triptófano de las peptonas del medio de cultivo para formar indol. Se usa como indicador del reactivo Erlick. El resultado puede ser positivo (Se forma un anillo de color rosa sobre la superficie del medio, después de agregarle el reactivo) o negativo (no se forma el anillo) - Prueba de utilización de citrato Fundamento: Esta prueba se usa para determinar la capacidad de una bacteria para utilizar el citrato de sodio como única fuente de carbono y las sales inorgánicas de amonio como únicas fuentes de nitrógeno. Se usa como indicador el azul de bromotiol. El resultado puede ser positivo (por cambio del pH neutro a alcalino el indicador vira de verde a azul) o negativo (el medio permanece verde) - Prueba de hidrolisis de urea Fundamento: Se usa para determinar la capacidad de un microorg para producir la enzima ureasa, que hidroliza la urea con producción de NH3 y CO2. La formación de NH3 alcaliniza el medio y el cambio de pH se detecta porque el indicador usado (rojo de fenol) cambia de color naranja (pH neutro) a fucsia (pH alcalino). El resultado puede ser positivo (el medio de color fucsia por producción de ureasa) o negativo (el medio de color naranja). b) Pruebas bioquímicas: Se basan en la especificidad de la reacción antígeno – anticuerpo como parte del diagnostico directo, se trata de demostrar la presencia de un antígeno presente en el microorg. Ayuda a la clasificación taxonómica y tipifica a nivel de subespecie. Las pruebas serológicas pueden ser directas cuando se trata de determinar el antígeno mediante 22 anticuerpos marcados. Los anticuerpos empleados pueden ser: Policlonales: Son anticuerpos obtenidos a partir de antígenos polivalentes, es decir, con múltiples y distintos determinantes antigénicos o epitopes. Representa una población heterogénea de anticuerpos. La especificidad de un anticuerpo policlonal es el resultado de la suma de las especificidades de los distintos anticuerpos que forman la población total. Son los que determinan las reacciones serológicas de tamizaje (sensibles) Monoclonales: Son los anticuerpos obtenidos mediante biotecnología. Son monoespecificos en los cuales la especificidad de los anticuerpos la determina un solo antígeno, al que se marca en las reacciones serológicas directas para determinar un antígeno especifico. Son los que determinan las reacciones serológicas de tipificación (muy especificas). Atributos inmunológicos de las reacciones serológicas La sensibilidad es la capacidad de una prueba para detectar el mayor número de casos de infección. Las pruebas de tamizaje son 100% sensibles y 98% especificas, por eso dan un 2% de falsos positivos. La especificidad es la capacidad que tiene la prueba para excluir la enfermedad en caso de un resultado negativo. Las pruebas de tipificación son 100% específicas y 98% sensibles, por eso dan 2% de falsos negativos. En base a estos atributos se justifican las reacciones serológicas de tamizaje o tipificación, según se hayan empleado en la reacción anticuerpos policlonales o monoclonales. Por ej: Si un paciente se realiza una serología para detectar infección por VIH, primero le harán una ELISA (prueba de tamizaje), si le da positivo no se le informa al paciente el resultado, si no que se le pide una WESTERN BLOT (prueba de tipificación), si esta prueba da positivo, se le informa VIH positivo. En cambio si le da negativo, se debe repetir la prueba a los 30 días para permitir que el sistema inmune reaccione ante los antígenos del VIH y forme anticuerpos en cantidad suficiente para sensibilizar la prueba. Si le sigue dando negativo significa que en la prueba de tamizaje el resultado fue un falso positivo. Interpretación y valoración de la serología microbiana Conociendo la evolución natural en el desarrollo de la respuesta humoral de anticuerpos en una infección, la detección y cuantificación de las distintas clases de inmunoglobulinas específicas permite conocer la fase clínica de la infección o enfermedad. La primoinfeccion se diagnostica mediante la presencia de inmunoglobulina M. En tanto, la reactivación o reinfección es posible evaluarla mediante las variaciones de los títulos de IgG. El incremento de 4 veces el titulo de la Ig G entre la faz aguda y la convalecencia indican infección reciente. c) Pruebas moleculares: Se basan en la especificidad absoluta de la secuencia de bases en un segmento de ADN con sus bases complementarias. Para interpretar las pruebas moleculares debemos tener un claro concepto de los términos: - Gen: Una secuencia de ADN que codifica para un producto especifico (ARN o proteína). - Genoma: Totalidad de genes que posee el organismo. - Cromosoma: El genoma está organizado en elementos separados conocidos como cromosomas. La cantidad de genes por cromosoma es variable según el cromosoma especifico. Por ej: Células humanas 23 pares de cromosomas, en cambio, las bacterias contienen un único cromosoma impar (haploide) El fundamento de las pruebas moleculares se basa en la secuencia de pares de bases, para cada gen individual. Estas pb pueden estar muy conservadas en diferentes organismos o ser muy variables, constituyendo así el código genético propio de cada organismo. Estas similitudes o diferencias en el contenido de un gen y las secuencias de pb constituyen el fundamento para el desarrollo de pruebas moleculares usadas para detectar, identificar y caracterizar los microorg en base a pruebas moleculares (PCR, RT-PCR e hibridación). Son de gran utilidad para el diagnostico de microorg difíciles de caracterizar por métodos convencionales, ya sea por su lento crecimiento o por su dificultad para crecer en medios de cultivo. Por ej: Virus o bacteria fastidiosas (muy exigentes nutricionalmente o no se conocen sus características físicas 23 especiales de crecimiento), microorg medioambientales inocuos para pacientes inmunonormales y altamente patógenos y letales para inmunodeprimidos, enfermedades de alta mortalidad y evolución aguda (meningitis). Sensibilidad de antimicrobianos Métodos indirectos: Se busca la huella que dejo el microorg en el hospedador bajo la presencia de anticuerpos específicos (Ig M – Ig G). Se puede definir el termino seroconversión que hace referencia a la presencia de anticuerpos específicos para un antígeno concreto en el suero de un paciente, previamente negativo para dicha especificidad antigénica. También frente a un suero reactivo puede generarse un aumento de 4 veces o más en el titulo de un anticuerpo especifico entre 2 muestras obtenidas en el periodo agudo y convaleciente respectivamente. En este caso, es de utilidad para hacer un seguimiento del paciente. En la práctica de rutina, se aplican los métodos indirectos con mayor frecuencia al diagnostico virológico, ya que como recuerdan, de la generalidad del virus es muy difícil hacer directo (requieren de líneas celulares para su cultivo), por lo que se busca la presencia de anticuerpos la excepción de esto son las pruebas moleculares. 5. Informe e interpretación El laboratorio debe informar rápidamente, en forma precisa los resultados y el médico interpretarlos en relación con la clínica y los datos epidemiológicos. El diagnostico directo culmina con el informe que indicara si se produjo aislamiento de un determinado microorg (bacterias) y se acompaña de antibiograma (sensibilidad o resistencia a los antibióticos que presenta el patógeno tipificado, si es necesario). Ver, cultivar y aislar en cultivo puro un microorg y llegar a identificarlo carece de valor, sino se asocia al agente al cuadro clínico del paciente y a la epidemiologia. 6. Sensibilidad a los antimicrobianos SUBUNIDAD 1 -7: Mecanismo de control de los microorganismos Los microorg colonizan superficies inertes o T. vivos y en ambos casos las estrategias de control son diferentes. El control puede ser total, destruyendo toda forma de vida (formas de resistencia o vegetativa, en cuyos caso del objeto queda estéril), o solo destruir las formas lábiles y sensibles en cuyo caso se trata de desgerminacion, un estado no absoluto. Un objeto puede estar estéril o simplemente desgerminado por diferentes procedimientos físicos o químicos. Terminología usada en control de microorganismos Germicida: Sustancia química que mata gérmenes patógenos sobre objetos inanimados o T. vivos (generalmente no sobre esporas). Saneamiento: Es la reducción de microorg a concentraciones no patógenas. Desgerminación: Es la remoción mecánica de los microorg sobre las superficies corporales. No es un estado absoluto. Conceptos básicos Esterilización: Es el conjunto de operaciones destinadas a matar todo microorg presente, incluyendo las endosporas que son la forma de resistencia bacteriana. Es un estado absoluto. Se pueden usar procedimientos físicos y químicos y se realiza sobre objetos inanimados. Desinfección: Conjunto de operaciones destinadas a destruir o inhibir el desarrollo de microorg presentes en objetos inanimados. No es un proceso por el cual se logra un estado absoluto. Un objeto puede estar desinfectado pero contiene cierto tipo de microorg (no mata esporas) generalmente se usan procedimientos químicos (aunque también métodos físicos). Antisepsia: Conjunto de procedimientos destinados a destruir o inhibir los microorg presentes en T. vivos: piel y mucosas. Se usan procedimientos químicos. Control de microorganismos 1. Esterilización a) Métodos físicos Calor Seco: Incineración, Estufa, Bolillero a cuarzo Húmedo : Autoclave y Tindalización 24 Radiaciones gama o X b) Métodos químicos Oxido de etileno Glutaraldehido 2. Desinfección a) Métodos físicos Calor húmedo: Ebullición y Pasteurización Radiaciones UV b) Métodos químicos Fenoles y derivados Alcoholes Agentes tensoactivos Agentes oxidantes Métodos esterilizantes físicos Tindalización: Esterilización fraccionada. - Calentamiento intermitente 80°C durante 30 min. - Dejar incubar a 36°C a temperatura ambiente 12 hs, por lo menos. - El proceso se repite 3 veces. Radiaciones ionizantes: Rayos X e Y. Es un procedimiento que dura segundos debido al alto poder de penetración de los rayos. Bolillero a cuarzo: Se utiliza después de haber esterilizado en estufa pequeños instrumentos como los de endodoncia. Se esteriliza durante 8 a 10 segundos a 210°C. Solo se utiliza para esterilizar el instrumento empleado en un mismo paciente. Estufa u horno Pasteur: - 160°C durante 2 hs de exposición. - 170°C durante 1:30 hs de exposición. - 180°C durante 1 hs de exposición. - 190°C aire comprimido durante 10 min de exposición. El fundamento de este método de esterilización por calor seco es por deshidratación. Autoclave de Chamberland: - 121°C a una atmosfera de presión de 15 a 30 min de exposición. - 127°C a una atmosfera y media de presión durante 10 min de exposición. - 134°C a dos atmosfera de presión durante 7 min de exposición. El fundamento de este método de esterilización por calor húmedo a presión es por coagulación de las proteínas. Es un método mucho más penetrante. Tanto en calor seco como en húmedo, se debe realizar un ciclo completo de esterilización sin interrumpir el ciclo que comprende un primer periodo que es de calentamiento, el que dura hasta lograr la temperatura de esterilización. Ese es el momento cero a partir del cual se comienza a contar el segundo periodo que es el tiempo de esterilización propiamente dicho o periodo de mantenimiento, finalizado el cual tenemos el tercer periodo del ciclo que es el enfriado. Métodos esterilizantes químicos Oxido de etileno: Requiere 4 hs de exposición a 58°C con una humedad cercana al 40%. Después del proceso, al material esterilizado se lo debe dejar en cámaras de aireación durante 48 a 72 hs por ser altamente cancerígeno, y al personal entrenado y protegido. Métodos desinfectantes físicos Pasteurización: Es un método desinfectante físico por calor húmedo. Existe una técnica de pasteurización baja a 63°C, y el tiempo de exposición es de 30 min y una técnica de pasteurización alta queemplea 75°C y el tiempo de exposición es de 15 segundos. 25 Radiaciones UV: Es un método de desinfección físico de poco poder de penetración y el tiempo de exposición es muy largo, aproximadamente 12 hs. Métodos desinfectantes químicos Fenol y derivados: Son muy usados para desinfectar objetos inanimados y combinados con jabones o compuestos mercuriales, pueden ser usados como antisépticos. Resistencia Los microorg resisten de diferente manera a su destrucción, razón por la cual debe conocerse el grado de resistencia de cada uno para implementar la estrategia adecuada. Así tenemos de mayor a menos resistencia la siguiente escala: 1) Priones 2) Endosporas 3) Micobacterias 4) Quistes de protozoos 5) Formas vegetativas de protozoos 6) Bacterias gram negativas 7) Clamidosporas y formas vegetativas de hongos 8) Virus sin envoltura 9) Bacterias gram positivas 10) Virus con envoltura Niveles de desinfección Alto nivel: Mata endosporas - Oxido de etileno 4 hs a 58°C con una humedad cercana al 40% - Formaldehido al 8% en alcohol al 70% - Glutardehido 2% durante 10 hs o 5 min a 70°C - Peróxido de hidrogeno Nivel de intermedio: Mata M.Tuberculosis - Compuestos clorados: Hipoclorito de Na 0,1 – 0,5 durante 30 min. - Compuestos Iodados: Iodoforos y alcohol iodado. - Alcoholes - Clorhexidina Bajo nivel: Mata formas vegetativas de bacterias - Compuestos amonio catenarios - Compuestos nitrogenados Métodos de convalidación de la esterilización La bioseguridad indica que toda práctica clínica odontológica debe ser realizada con la certeza de que el instrumental empleado cumpla con las condiciones de esterilidad necesaria. Para eso cuenta con una serie de procedimientos a tal fin. Así tenemos: - Control físico: Termómetros, mamometros. - Control químico: Tiras termo sensibles solo indican pasaje por el sistema de esterilización. No esterilidad. - Control biológico: Esporas de género Bacillus estearothermophyillus en autoclave y B. subtilis para estufa y oxido de etileno. Antimicrobianos: Toda sustancia de origen natural, semisintetico o sintética que actúa inhibiendo o matando a los microorg de una dilución elevado (pequeñas concentraciones), que ejercen su acción a nivel molecular en un proceso metabólico o sobre una estructura especifica del microorg. Agentes microbianos químicos ANTIBIOTICOS DESINFECTANTES - ANTISEPTICOS 26 Pueden aplicarse sobre piel, mucosas o medio interno. No pueden utilizarse en el medio interno y los desinfectantes ni si quiera sobre piel o mucosas. Tienden a ser selectivos para las células procariotas, no actuando sobre eucariotas. No poseen selectividad, actuando sobre células procariotas y eucariotas, razón por la cual no pueden usarse sobre el método interno. Actuando sobre microorg en multiplicación activa, ya que, interfieren con algún proceso metabólico. Actúan sobre microorg en cualquier estado metabólico (multiplicación o no) Se necesitan pequeñas cantidades para obtener el efecto deseado (CIM – CBM) Se necesitan mayores concentraciones que los antibióticos para conseguir el efecto. Actúan específicamente sobre bacterias y no sobre otros microorg. Son tóxicos para muchos tipos de microorg. Por ej: Hongos y virus. Resistencia bacteriana Es la disminución o pérdida de la sensibilidad de una bacteria por un antibiótico. Clínicamente se expresa por persistencia de la sintomatología infecciosa y en el laboratorio por no inhibir la multiplicación bacteriana. El uso inapropiado de antibióticos es la razón más importante para la selección de cepas resistentes. Una bacteria es resistente cuando no puede alcanzar la concentración capaz de destruirla o detener su crecimiento en el foco infeccioso. Según esto la bacteria es resistente cuando la CIM del antibiótico es superior a la que se puede lograr en el foco infeccioso. Clasificación de la resistencia Cromosómicas: Mutación – selección, constitutiva, inducible. Extra cromosómicas: - Plásmidos – conjugación. - Bacteriogafo – transducción - ADN libre – transformación Mecanismos de resistencia bacteriana a los antibióticos Para que un antibiótico actue es necesario que atraviese las distintas envolturas de las bacterias hasta llegar al sitio blanco de acción del antibiótico. Por lo tanto, los mecanismos son: 1) Alteraciones de la permeabilidad o transporte - Modificación de las porinas es una mutación de origen cromosómico, que produce disminución del diamero de las porinas. - Menor tasa de ingreso del antibiótico a concentraciones subletales (no alcanza la CIM). - Alteración estructural de los sitios blancos. - Alteración en el transporte: Alteración de las proteínas transportadoras del antibiótico al sitio blanco, función que cumplen las permeasas. CROMOSOMICA E EXTRACROMOSOMICA M Mutación en el ADN constitutivo (propio) Mutación en el ADN extracromosómico Espontanea (natural) Adquirida Rara (una cada 10-8, 10-12 bacterias) Frecuente Un carácter (antibiótico o grupo relacionado) Múltiples y variados tipos de antibióticos Hereditario (transmisión vertical) Hereditaria o no (transmisión horizontal y ocasionalmente vertical) Transferible rara vez Transferible: Transducción, conjugación y/o transformación. Necesita contacto con antibiótico (selección) Sin contacto previo con el antibiótico (no necesita selección) No infecciosa Infecciosa o transmisible 27 - Producción de enzimas inactivantes del fármaco. Por ej: Producción de B-Lactamicos para los antibióticos. 2) Modificación de los sitios blancos 3) Producción de enzimas modificantes del antibiótico. Antibiograma: Es una técnica in vitro que se realiza en los laboratorios de diagnostico bacteriológico una vez obtenido el cultivo puro para determinar la sensibilidad o resistencia de las bacterias a los antibióticos. Existen 2 técnicas: 1. Antibiograma por difusión con discos: Técnica cualitativa Esta técnica ha sido y es la más empleada a fines de diagnostico en la microbiología clínica. Requisitos técnicos: Para la bacteria y el antibiótico a probar este estandarizado el halo de inhibición. Bacteria aislada en cultivo puro. Medios de cultivo con pocos nutrientes para que los mismos al ser metabolizados por las bacterias no produzcan metabolitos intermedios que alteren el tamaño del halo. Espesor del colchón del medio de cultivo debe ser de 4 mm para que el halo responda a la difusión normal. Temperatura y tiempo de incubación: 37°C durante 18 a 24 hs. Técnica de siembra: Debe ser uniforme ósea por diseminación con espátula de Drigalski o hisopo en todos los sentidos de la placa para lograr uniformidad de la siembra. Lectura del halo de inhibición. Método a utilizar Se prepara el inoculo de la bacteria problema en un caldo de tripticasa soja o Muller – Hilton. Dicho inoculo debe tener una turbidez determinada que corresponde al 0,5 de la escala del patrón de turbidez Mc Farland. Se sumerge un hisopo en la suspensión bacteriana y luego se siembra en la superficie del agar de Muller – Hilton contenido en una placa de Petri cubriendo toda la superficie del medio homogéneamente. Posteriormente se colocan los discos de papel de filtro impregnados con los antibióticos a probar. Se incuban las placas a 37°C durante 18 a 24 hs. El antibiótico difunde en el agar en todos los sentidos y los microorg se multiplican hasta donde la concentración del antibiótico difundido sea suficiente para inhibir el desarrollo bacteriano (CIM) formándose un halo de inhibición. Al finalizar el tiempo de incubación se realiza la lectura midiendo el diámetro de los halos de inhibición y los resultados se comparan con una tabla en la que esta estandarizado el halo para cada bacteria en relación a casa antibiótico. Se considera sensible
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