PRACTICA 2 Identificación de Enterobacterias en EDA (1) (2)

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
Guía N°2. Identificación de Enterobacterias en EDA
Universidad de Córdoba
Facultad de ciencias de la salud
Programa de Bacteriología
Asignatura bacteriología 2
Docente Mayra Ligia Raciny Alemán
Integrantes de la unidad
Daniel Andrés Jaraba Segura
María José Herrera Ariza
Valeria Izquierdo Agamez
Montería-Córdoba 2021-2
Introducción.
En el presente informe de prácticas de laboratorio que acontece a la guía n°2 de la identificación de Enterobacterias en EDA, tiene el fin de presentar las bacterias asociadas a procesos infecciosos a nivel del tracto gastrointestinal, las cuales pertenecen a la familia Enterobactriaceae, ya que, tienen una serie de características en común este grupo de bacterias. 
Existen muchos casos en los cuales el agente causante de EDA no logra determinarse pueden estar asociados a virus que no son visibles microscópicamente, el grupo de los rotavirus que son los responsables del mayor porcentaje de cuadros de gastroenteritis de patologías infantiles, otro grupo el tercer último se encuentra conformado por parásitos (amebas, Giardia lamblia y helmintos) capaces de desarrollar, al igual que las bacterias y los virus, patología específica en tracto gastrointestinal.
La gran mayoría de las infecciones gastrointestinales resultan de la ingestión de una dosis suficiente del agente etiológico que permita atravesar las barreras protectoras del organismo tales como la barrera ácida del estómago, mucosa intestinal, motilidad intestinal, microbiota normal, los sistemas inmunes celulares y humorales, y los tejidos linfáticos asociados. Las patologías asociadas a estos microorganismos son disentería, diarrea con sangre, deposiciones como agua de arroz, colitis hemorrágicas, síndromes apendiculares, diarreas.
Objetivos.
• Identificar las enterobacterias relacionadas con EDA.
 • Conocer y diferenciar los procedimientos para realizar un coprocultivo como examen diagnóstico de EDA 
• Analizar los resultados obtenidos y elaborar un informe escrito.
Materiales requeridos para la práctica.
➢ Marcador de vidrio o marcador permanente delgado
➢ Encendedor
➢ Cinta de enmascarar
➢ Agares entéricos: EMB, Hecktoen, XLD, MacConkey, SS, Bismuto-sulfito 
➢ Agar no selectivo: Agar Sangre
➢ Caldo Selenite o Tetrationato
➢ Pruebas bioquímicas: SIM, Urea, Citrato, TSI, MR, VP, LIA.
➢ Tirillas de Oxidasa
➢ Cepas bacterianas (E. coli, Salmonella, Shigella) sembradas en Agar Nutritivo y BHI.
➢ Colorantes para Gram
➢ Asas bacteriológicas
➢ Incubadora 
➢ Láminas porta objetos 
➢ Microscopios
➢ Palillos
➢ Aceite de Inmersión
➢ Reactivos: Kovacs, Rojo de Metilo, Alfa naftol al 5% y KOH al 40%
➢ Papel kraft
➢ Descartadores
Resultado
Muestra de materia fecal 
1. Examen macroscópico: se observa el aspecto, color, consistencia (heces liquidas o diarreicas).
Leucocitos en heces (elevados): inflamación del intestino producida por agentes infecciosos invasores (Salmonella, Shigella o E. coli enteroinvasivo).
No se observan leucocitos: se sospecha etiología virásica o una bacteria que produzca la toxina de V. cholearae.
2. Examen microscópico (fresco): se mezcla en un portaobjetos una pequeña porción de heces con una gota de azul de metileno y se tapa con un cubreobjetos. 
A) Shigella las colonias rojas, es decir del color del medio.
B) Salmonella colonias rojas con centro negro o colonias completamente negras. 
Escherichia coli se espera que sea inhibida total o parcialmente; si crece
 las colonias son amarillas. 
3. Siembra directa por agotamiento quemando asa en agar sangre y XLD: para obtener colonias aisladas, incubamos a 37°C por 24 a 48 horas en aerobiosis.
2. Pre- enriquecimiento selectivo: 
- Se toma un gramo de heces, preferiblemente la parte de la muestra diarreica con sangre y moco. 
-Agregamos la muestra en un tubo con caldo Selenite y se incuba de 6 a 12 horas a 37°C en atmósfera de aerobiosis.
El patógeno esta en menor cantidad y se enriquece la muestra para brindar al patógeno los nutrientes necesarios para que se reproduzca más.
La turbidez en el tubo indica la presencia de algún microorganismo.
3. Siembra de subcultivos: Sembrar en las cajas de agar entérico previamente marcadas con los datos del paciente, a partir del caldo de pre-enriquecimiento. En cada caja se siembra por agotamiento quemando asa.
Medio entéricos como: XLD, Mac Conkey, SS, EMB, Sulfito bismuto.
Mínimo se siembra en: Mac Conkey- SS o EMB – SS
Se incuban las cajas a 37°C de 24 a 48 horas en atmósfera de aerobiosis.
Pruebas de identificación: 
➢ Observación de las colonias aisladas: si fermentan o no la lactosa. Se busca primero las no fermentadoras (ya que estas no pertenecen a la microbiota intestinal).
➢ Gram del cultivo: (se observan bacilos gram positivos)
➢ Prueba de oxidasa: prueba de identificación de género (Enterobacterias- negativa).
➢ Pruebas bioquímicas: se carga la batería de las 7(TSI, Citrato, Urea, MR/VP, LIA, SIM).
➢ Interpretación de los resultados: leemos los resultados de las pruebas bioquímicas para determinar cuál es el género y la especie de la Enterobacteria aislada. 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.
AGAR SS (Salmonella, Shigella, E. coli). AGAR MAC CONKEY
Salmonella y Shigella
E. coli
1. Salmonella:
-TSI: K/A (no fermenta lactosa, pero si glucosa), H2S +, Gas (poco). 
-Citrato: positivo (utiliza el citrato de sodio como única fuente de carbono y las sales de amonio como fuente de nitrógeno).
-Urea: negativo (no tiene la capacidad de utilizar la urea para producir amoniaco y CO2). 
- MR: positivo (utiliza vía acido-mixta). -VP: negativo (no utiliza vía butilenglicólica).
-LIA: K/K, H2S. (Descarboxila la lisina y produce ácido sulfhídrico). -SIM: H2S +, Indol - , Móvil.
Citrato
Positivo
SIM
H2S+, Indol –Móvil
LIA
K/K, H2S+
VP
Negativo
MR
Positivo
Urea 
Negativo
TSI
K/A
2. Shigella: 
-TSI: K/A (no fermenta lactosa, pero si glucosa), H2S -, Gas (poco). 
-Citrato: negativo (no utiliza el citrato de sodio como única fuente de carbono y las sales de amonio como fuente de nitrógeno).
-Urea: negativo (no tiene la capacidad de utilizar la urea para producir amoniaco y CO2).
- MR: positivo (utiliza vía acido-mixta). -VP: negativo (no utiliza vía butilenglicólica).
-LIA: K/A (no descarboxila la lisina y no produce ácido sulfhídrico). -SIM: H2S -, Indol - , inmóvil.Urea 
Negativo
Citrato
Negativo
SIM
H2S-, Indol –, inmóvil
LIA
K/A
VP
Negativo
MR
Positivo
TSI
K/A
3. E. coli
-TSI: A/A (fermenta lactosa, sacarosa y glucosa), H2S -, Gas + (presencia de burbujas o la ruptura del medio de cultivo).
-Citrato: negativo (no utiliza el citrato de sodio como única fuente de carbono y las sales de amonio como fuente de nitrógeno).
-Urea: negativo (no tiene la capacidad de utilizar la urea para producir amoniaco y CO2).
- MR: positivo (utiliza vía acido-mixta). -VP: negativo (no utiliza vía butilenglicólica).
-LIA: K/K (descarboxila la lisina y no produce H2S) -SIM: H2S -, Indol +, móvil.
SIM
H2S-, Indol +, Móvil
LIA
K/K
VP
Negativo
MR
Positivo
Urea 
Negativo
Citrato
Negativo
TSI
A/A, Gas +
PRE-LABORATORIO
1. Investigue acerca el fundamento del caldo Selenite, Tetrationato, Rappaport y caldo para 
Gramnegativos.
Selenite: En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el selenito de sodio inhibe flora Gram positiva y la mayoría de la flora entérica excepto Salmonella spp. Durante las primeras 8-12 horas de incubación. La L-cistina es el agente reductor y la FDA propuso que se agregue a la formulación del Selenito Caldo porque reduce la toxicidad del selenito de sodio llevando así a una mayor recuperación de especies de Salmonella.
Tetrationato. El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, y carbonato de calcio que neutraliza y adsorbe metabolitostóxicos. La selectividad está dada por la presencia de sales biliares y tetrationato (compuesto generado en el medio de cultivo al reaccionar el tiosulfato de sodio con la solución iodo-iodurada) que inhiben el desarrollo de microorganismos Gram positivos y algunas enterobacterias. Salmonella spp. Contiene la enzima tetrationato reductasa y puede crecer satisfactoriamente en el medio de cultivo debido a que no la afecta la toxicidad del tetrationato. Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se recomienda agregar 40 mg/l de Novobiocina previo al agregado de la solución iodo iodurada.
Rappaport. Es un medio de enriquecimiento selectivo utilizado después de un enriquecimiento preliminar de la muestra en un medio de enriquecimiento previo adecuado. Su uso se ha aprobado para el análisis de leche y productos lácteos, productos con carne vacuna cruda, alimentos con alto nivel de contaminación y alimentos para animales. La triptona es una fuente de carbono y nitrógeno para los requisitos generales de crecimiento. El cloruro de magnesio eleva la presión osmótica en el medio. El verde malaquita inhibe los organismos diferentes de Salmonella. El pH bajo del medio (5,1 ± 0,2), combinado con la presencia de verde malaquita y la alta concentración de cloruro de magnesio, que incrementa la presión osmótica, tiene carácter selectivo para Salmonella spp.
Caldo para Gram negativos. Se emplea como caldo selectivo para el cultivo de Salmonella y Shigella a partir de muestras de heces e hisopos rectales. Contiene citrato de sodio y desoxicolato sódico (una sal biliar) que destruyen los microorganismos Gram positivos e inhiben la multiplicación temprana de los coliformes. La adición de mayor cantidad de manitol que de glucosa estimula el crecimiento de los patógenos fermentadores de manitol y no es favorable para Proteus. El medio se tampona para mantener el pH neutro aún después de la producción de metabolitos bacterianos ácidos. Para obtener el máximo beneficio de sus propiedades selectivas, el caldo GN debe ser subcultivado después de 6-8 horas tras la inoculación e incubación iniciales, ya que después de este período los coliformes sobrepasan a los patógenos.
2. ¿Por qué se debe realizar un pre- enriquecimiento selectivo a las muestras de heces?
Porque las bacterias del tracto gastrointestinal se encuentran más abundantes que las bacterias que están causando enfermedades gastrointestinal, lo que se busca es equilibrar el crecimiento en este caldo de las bacterias tanto de la flora normal como las bacterias que están causando EDA y cuando se siembre se puedan diferenciar las colonias y puedan crecer en iguales condiciones ya que, si hay mucha microbiota normal al sembrar esto sin pre enriquecimiento en el agar solo crecería la microbiota normal y no el microorganismo patógeno que estamos buscando, porque le robaría nutrientes y no dejaría reproducirse en el medio.
3. ¿Cuáles son los microorganismos de importancia clínica productores de gastroenteritis de tipo infeccioso?
En un proceso gastroenterítico, con heces con glóbulos blancos se sospecharía de Shigella, E coli enteroinvasivo Salmonella con heces exentas de glóbulos blancos, se sospecha una etiología virásica, o una bacteriana capaz de producir toxina, como Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum o E. coli enterotóxico.
4. ¿Qué medios de transporte son utilizados para las muestras de materia fecal?
-Medio Cary Blair es adecuado para la recuperación de la generalidad de las bacterias patógenas.
-Medio de transporte Stuart.
-Medio de transporte Amies o glicerol salino tamponado.
POST-LABORATORIO
1. Investigue la colección y conservación adecuada para muestras de heces en el laboratorio de microbiología.
COLECCIÓN Y PROCEDIMIENTO.
· Asegurarse de que la persona defeque en un recipiente aparte (bacinilla) cuidando que la muestra no se mezcle con orina.
· Rotular el frasco colocando el nombre del paciente, edad y fecha de recolección. 
· Introducir la(s) muestra(s) en una funda plástica y cerrarla evitando que se derrame y se mezcle con otras muestras. 
· Colocarlas en una caja, rodeándolas de papel picado asegurando que los recipientes no se muevan durante el transporte. 
· Sellar la caja y colocar un rótulo a un costado indicando “Peligro, Muestra Biológica” y una flecha indicando la posición “Hacia Arriba”, de manera que el transporte se haga de esa forma.
· Transportar las muestras rápidamente, antes de que transcurran 2 horas de su emisión. Luego de ese tiempo la muestra no será útil.
ENVIO DE MUESTRA EN MEDIO DE TRANSPORTE
 Se utilizará en caso de que la muestra tarde más de 2 horas en llegar al laboratorio. Puede usarse para hisopados fecales (introduciendo el hisopo directamente en la muestra tomando una parte de ella) o para hisopados rectales (toma de la muestra introduciendo el hisopo a través del ano del paciente). 
PROCEDIMIENTO:
· Tomar con un hisopo estéril parte de la muestra. 
· Introducir el hisopo en el medio de transporte Cary Blair, cuidando de que el algodón quede 2 cm por debajo de la superficie y sin perforar el fondo del medio de transporte.
· Romper la parte del mango que tocó nuestros dedos para evitar fuentes de contaminación externa. 
· Cerrar bien el tubo y rotularlo con el nombre del paciente. 
· Colocar el (los) tubo(s) en una caja, rodeándolos con papel picado para evitar que se rompan durante el transporte. 
· Adjuntar los formularios de pedido en donde constará los nombres y apellidos de los pacientes, procedencia, edad, procedencia y nombre de la persona que tomó la muestra. 
· Sellar la caja y rotularla con un papel que diga “Peligro Muestra Biológica” y una flecha indicando la posición en que debe viajar la caja. 
· No es necesario refrigerar las muestras. Enviarlas lo antes posible a su laboratorio de referencia.
2. ¿Para qué se utiliza el Agar MacConkey con sorbitol? investigue su fundamento
El agar MacConkey con sorbitol es una modificación de la fórmula proporcionada por Rappaport y Henig para aislar los serotipos 011 y 055 de Escherichia coli enteropatógeno, a partir de muestras clínicas, veterinarias, alimentarias y medioambientales. Las peptonas son fuentes de nitrógeno. D-Sorbitol es un carbohidrato fermentable. La mayoría de las cepas hemorrágicas de E. coli no fermentan D-sorbitol y producen colonias incoloras en agar MacConkey Sorbitol. Las sales biliares y el cristal violeta son agentes selectivos que inhiben el crecimiento de organismos gram positivos. El rojo neutro es un indicador del pH.
3. En caso de que el médico ordene un antibiograma ¿Qué antibióticos utilizaría?
En tal caso que se ordene el antibiograma, los antibióticos que se deben utilizar son: 
· Aminoglucósidos 
· Tetraciclina
· Cefalosporinas 
· Carbapenémicos 
· Fluoroquinolonas 
· Trimetoprima/sulfametoxazol 
· Nitrofurantoina 
4. ¿Cuáles son los microorganismos que desplazan completamente la microbiota gastrointestinal; como observaría los Gram directos de cada uno de ellos?
Si esto ocurre estaríamos hablando de disbiosis intestinal que es un desequilibrio constante de la flora intestinal. Puede ocurrir por microorganismos como: Firmicutes/Bacteroidetes, Vibrio cholerae. Parásitos como helmintos, giarda lamblia.
 -Cepas de E. coli patógenas: Bacilo Gram negativo. No forma esporas, Móviles (flagelos perítricos) Miden 0.5 µ de ancho por 3 µ de largo.
-Yersinia: Bacilos del tipo gramnegativos aerobios y anaerobios facultativos; son mótiles a 22°C, pero no a 37°C, por flagelos anfitricos, o perítricos, forman pilis, y fimbrias. No forman cápsulas de gran espesor ni esporas.
-Shigella: forma de bacilo gramnegativas, inmóviles, no formadoras de esporas.
-Salmonella: Gram negativos, generalmente móviles por flagelos perítricos (excepto S. Gallinarum), anaerobios facultativos no encapsulados y no esporulados.
-Campylobacter spp: bacilos Gram negativo con forma de coma y móviles por la presencia de uno o dos flagelos polares. Miden entre 0,5 y 5 micras de largo por 0,2 a 0,5 micrasde ancho, tomando forma cocoide en cultivos antiguos o expuestos de forma prolongada al aire.
5. Elabore un caso clínico donde esté implicado el germen objeto de estudio.
Caso clínico. 
Paciente femenino de 7 años se remitió al servicio de urgencias de la clínica de montería por cuadro clínico de 6 días de evolución consistente en diarrea, vómito y fiebre a quien se le ha suministrado líquidos y electrolitos como manejo, sin mejoría aparente. La madre relata antecedentes de ser una paciente asmática. Al examen físico se encuentra, fiebre 38,5°C, deshidratación severa, ojos hundidos e irritables, además de un peso de 27 kg y talla de 112 cm. Se solicitaron pruebas de coprocultivo, Gram de las colonias, prueba de oxidasa y pruebas bioquímicas para identificar al microorganismo. Los resultados de los exámenes indicaron que el examen macroscópico de las heces eran heces diarreicas, con pus, fétidas y sanguinolentas, la tinción de Gram de las colonias fue Bacilos Gram negativos +++, con predominio de polimorfonucleares, oxidasa negativa, las pruebas bioquímicas usadas para la identificación de la enterobacteria asociada a EDA fueron Citrato, TSI, LIA, Urea, Voges Proskaur/Rojo de metilo y SIM. En el Citrato su resultado fue negativo, en el TSI su resultado fue K/A sin producción de H2S y sin producción de gas, LIA no descarboxiló ni desaminó la lisina sin producción de H2S, Urea negativo, Voges Proskaur negativo, Rojo de metilo positivo y SIM movilidad negativa sin producción de H2S e indol negativo, por lo que se confirmó que era Shigella dysenteriae, como se aisló esta bacteria el antibiótico de elección de primera línea ácido nalidíxico 50mg/kg al día tratamiento por 7 días, también se administró rehidratación oral, 1.125ml de SRO en 4 horas (282ml/h) fraccionados, además se le retiró la bebida previamente ofrecida y se dejó en observación. Una vez pasadas las 4 horas la paciente ya no presentaba signos de deshidratación, se dejó otras 2 horas en observación y se le envió a casa con recomendaciones generales y signos de alarma.
Conclusiones.
En conclusión, es de gran importancia como estudiantes de bacteriología tener conocimiento y poder identificar las enterobacterias, debido a que son de importancia clínica como la Salmonella entérica, Shigella spp., Yersinia spp. y algunas cepas de Escherichia coli. Estas son los agentes más comunes y frecuentes para producir enfermedades como la infección del tracto urinario y la diarrea aguda. En el informe profundizamos en la identificación de estas bacterias en el laboratorio, también adquirimos el conocimiento microbiológico básicos sobre el crecimiento y metabolismo de las Enterobacterias productoras de enfermedades diarreicas agudas. Pudimos aprender, conocer y diferenciar los procedimientos para realizar un coprocultivo como examen diagnóstico de EDA.
Referencia bibliográfica.
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5. Marielsa Gil. (12 de abril de 2019). Agar XLD: fundamento, preparación y usos. Lifeder. Recuperado de
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