Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica - McFaddin (3 ed 2000) - Karla Morales Hernandez

Esta es una vista previa del archivo. Inicie sesión para ver el archivo original

T E R C E R A E D I C I Ó N
A
oPruebas Bioqu micas 
para la Identificación 
de Bacterias de 
Importancia Clínica
w
T E R C E R A E D I C I Ó N
Pruebas Bioquímicas 
para la Identificación 
de Bacterias de 
Importancia Clínica
Jean F. MacFaddin
MS, MT(ASCP), SM(AAM)
e d it o r ia l m e d ic a
panamericana
BUENOS AIRES - BOGOTÁ - GARATAS - MADRID - MÉXICO - SAO PAUI.l) 
e-mail: iuVjLSiuedicapanamericana.com 
w\\»|jínedi. i,- p a namericana.com
Dedicado a mi hermana gemela, 
Joan M. Feustle
Prefacio
D esde que se publicó la segunda ed ición de P ruebas B ioqu ím icas p a ra la Iden tificac ión de 
B acterias de Im portancia C lín ica (1980), e l cam po de la bac terio log ía sufrió cam bios espec­
tacu lares en la clasificación y en la nom encla tu ra bacterianas; sin em bargo, los m étodos b io ­
quím icos para la iden tificación bac teriana en los laboratorios clín icos de ru tina perm anecieron 
bastante constan tes con el transcurrir de los años, con actualización e in troducción de pruebas 
b ioquím icas nuevas.
M ás de 19 años después de la segunda ed ición , los cam bios m ás im portantes se observan en 
la nom enclatura. L as relaciones del D N A , el análisis de secuencias del rR N A , las relaciones 
G + C y o tros m étodos analíticos sofisticados p roporc ionaron in form ación m ás p ro funda so­
b re m uchos m icroorganism os. E stos adelantos p rodu jeron la reclasificación y a m enudo la 
transferencia de especies a géneros d iferen tes o la nueva denom inación jun to con la iden tifica­
ción de géneros nuevos. H ace unos años el género M icrococcus pose ía nueve especies, en la 
actualidad sólo ex isten dos; las otras especies se transfirieron a otros géneros. A sim ism o, el nú ­
m ero de especies se m ultip licó enorm em ente en algunos géneros; p o r ejem plo , S taphylococ­
cus ahora posee 44 especies.
H e inclu ido nueve cap ítu los de pruebas b ioqu ím icas to ta lm en te nuevos con p rocedim ien tos 
m uy utilizados: p ruebas de bac itrac ina y su lfam etoxazol-trim etoprim a (SX T); p ruebas de h i­
drólisis de sustratos indoxflicos; p rueba de (3-lactamasa; p rueba de lecitinasa; p rueba de lipa- 
sa; p rueba de sensib ilidad a la lisostafina; p rueba de porfirina-ácido S-am inolevulín ico (A LA ); 
p rueba de h idró lisis de p irro lidon il-P -naftilam ida (PY R ), y factores X y V.
N o cam bié el fo rm ato , pero actualicé cap ítu los an terio res cuando correspondía, en especial 
en lo que se refiere a la nom enclatura actual. C on el agregado de capítulos nuevos, conservé 
los p rocedim ien tos estándar m ás antiguos que aún se u tilizan en la m ayor parte de los labo ra­
torios de bac terio log ía y en las instituciones ded icadas a la enseñanza.
Los cuadros de iden tificación fueron d iv id idos en cocos y bacilos gram positivos y cocos y 
bacilos g ram negativos, ya que m uchas bacterias exhiben form as cocoides y bacilares. Los 
m iem bros de la fam ilia E n terobacteriaceae se tratan en un capítu lo separado. M uchos encuen­
tran ú tiles los d iagram as de flu jo diagnóstico; p o r lo tanto , los conservé para aquellas p erso ­
nas a qu ienes les resu ltan beneficiosos.
L a clasificación (nom enclatura) de género y especie se h a efectuado de acuerdo con la p ro ­
puesta en los 5 volúm enes del M anua l de Bergey. A gradezco a la C om pañía de P roducción de 
B ergey p o r orien tarm e para actualizar todos los géneros y especies.
Q uiero agradecer de m anera especial al docto r D avid Power, de B D B iosciences (antes B ec- 
ton D ick inson M icrob io logy System s), po r su invalorable ayuda en las b ib liografías, e l m a te­
rial de p rueba y las fo tografías. Tam bién a S cott Puyear, de R E M E L L aboratories, y a M ike 
C ox, de A naerobe System s, p o r p roporc ionarm e las fo tografías para los capítu los nuevos.
Jean F. M acF addin
Contenido
Prefacio vii
Láminas color 805
SECCIÓN I. PRUEBAS BIOQUÍMICAS INDIVIDUALES
1. Pruebas de bacitracina/sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) 3
2. Pruebas de hidrólisis de bilis y esculina 8
3. Pruebas de solubilidad en bilis 25
4. Pruebas (reacciones) de CAMP/ CAMP inversa y prueba de inhibición CAMP
(producción de fosfolipasa D) 33
5. Pruebas de fermentación de hidratos de carbono 54
6. Pruebas de catalasa y peroxidasa 73
7. Prueba de citrato 92
8. Prueba de coagulasa 98
9. Pruebas de descarboxilasa (lisina-omitina-arginina) y prueba de dihidrolasa (arginina) 113
10. Pruebas de desoxirribonucleasa (DNasa) y termonucleasa (TNasa) 128
11. Pruebas de [l-galactosidasa (ONPG y PNPG) 151
12. Pruebas de licuefacción de la gelatina 160
13. Prueba de oxidación del gluconato 172
14. Prueba de hidrólisis del hipurato 177
15. Prueba de ácido sulfhídrico 192
16. Prueba de indol 206
17. Pruebas de hidrólisis de sustratos indoxílicos 217
18. Pruebas en agar con hierro de Kligler/ triple azúcar y hierro 223
19. Prueba de (3-lactamasa 236
20. Prueba de lecitinasa 254
21. Prueba de leucina aminopeptidasa (leucina arilamidasa) (LAP) 263
22. Prueba de lipasa 267
23. Prueba de leche tornasolada 275
24. Prueba de sensibilidad a la lisostafina 284
25. Prueba de malonato 291
26. Prueba de reducción de la leche del azul de metileno para enterococos 296
27. Prueba de rojo de metilo 301
28. Prueba de movilidad 306
29. Pruebas de utilización de hidratos de carbono para Neisseria 312
30. Pruebas de reducción de nitratos /nitritos 326
31. Prueba del disco de optoquina 339
32. Prueba de oxidasa 344
33. Prueba de oxidación-fermentación 354
34. Prueba de fenilalanina desaminasa 362
35. Prueba de fosfatasa 368
36. Prueba de porfirina- ácido 5-aminolevulínico (ALA) 376
37. Prueba de hidrólisis de pirrolidonil-P-naftilamida (PYR) 380
38. Prueba de hidrólisis del almidón 385
39. Prueba de ureasa 397
40. Prueba de Voges-Proskauer 411
41. Factores X y V 422
X índice
SECCIÓN II. SISTEMAS DE PRUEBAS MÚLTIPLES
42. Sistemas de pruebas múltiples 427
SECCIÓN III. ESQUEMAS DE IDENTIFICACIÓN__________________________________________
43. Bacterias grampositivas 451
44. Bacterias gramnegativas 580
45. Familia Enterobacteriaceae gramnegativas y otras bacterias intestinales gramnegativas 673
SECCIÓN IV. APÉNDICES
1. Resultados fotográficos 745
2. Unidades de medición del sistema métrico 758
3. Indicadores de pH 759
4. Correcciones de pH 760
5. Estándares nefelométricos de McFarland 764
6. Preparaciones de reactivos 766
7. Sinónimos comunes en la terminología de los medios de cultivo 780
8. Tamaño estándar de los tubos de prueba para bacteriología 781
9. Conversiones de temperatura 782
10. Colecciones de cultivos: cultivos de referencia 783
11. Direcciones de proveedores comerciales 789
12. Glosario 801
SECCIÓN V. ÍNDICES ANALÍTICOS _____ ____
1. General
2. Microorganismos
827
839
SECCI ÓN
^0
• c
Pruebas bioquímicas 
individuales
.
CAPÍ TULO
>
Pruebas de bacitracina/
sulfametoxazol-trimetoprima
(SXT)
I. PRINCIPIO
Determinar la sensibilidad de un microorganismo a la bacitracina o a bacitracina y sulfametoxazol-tri­
metoprima (SXT).
II. OBJETIVO
(Véase también cap. 43)
A. Diferenciación presuntiva de estreptococos (3-hemolíticos del grupo A de otros estreptococos [i-hemolíticos.
B. Ayudar a descartar los estreptococos no A y no B que pueden ser susceptibles a la bacitracina (5).
La precisión de la prueba de la bacitracina se mejora por el uso de la sensibilidad a un disco de SXT en 
combinación con la bacitracina. El agregado de SXT junto con la bacitracina aumenta la sensibilidad y el 
valor predicüvo de la prueba de la bacitracina. Las sensibilidades de bacitracina/SXT todavía se emplean 
en los laboratorios donde no se dispone de pruebas confiables para la agrupación serológica. Una prueba 
más específica para identificar los estreptococos del grupo A es la prueba PYR (hidrólisis de la pirrolido- 
nil-P-naftilamida); es mejor para la producción de la enzima piroglutamil amidasa (véase cap. 38).
III. BIOQUÍMICA_______________________________________________________________
Bacitracina
La bacitracina, un antibiótico aislado por primera vez a partir de Bacillus licheniformis (antes B. sub- 
tilis), pertenece a una clase de antibióticos que inhiben la síntesis de la pared celular bacteriana. La baci- 
tracina es un antibiótico peptídico compuesto por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
C,H,
CH,
C — CH — C
' I II 
n h 2 n -
A c h 2 
I
--------CH - -C O - ■L-Lev
Phe - fenilalanina
D-Asp
D-gluHis - histidina
D-Phe-L-His-L-AspAsp - asparagina |
Lys - 
Leu - 
Orn -
lisina
leucina
ornitina
L-lleu-D-Orn-L-Lys — — L-lleu
Bacitracina A
Residuo de isoleucina y de cisterna, condensado para formar un anillo de tiazol (A) en lugar de la unión
peptídica habitual de un polipéptido
4 Pruebas bioquímicas individuales
La bacitracina inhibe la síntesis de la pared celular, una estructura rígida que encierra la célula micro­
biana. El esqueleto fundamental consiste en una estructura tridimensional compleja que contiene pepti- 
doglucano, una macromolécula (mucopéptido o glucopéptido o mureína), y otros polímeros (p. ej., poli- 
sacáridos, lipoproteínas) que difieren en los distintos tipos de bacterias (7). La rigidez final de la pared 
celular es impartida por entrecruzamientos de las cadenas peptídicas y la capa del peptidoglucano es mu­
cho más gruesa en la pared celular de las bacterias grampositivas. La bacitracina inhibe una fase tempra­
na en la biosíntesis del peptidoglucano; inhibe la desfosforilación de un pirofosfato lipídico, un paso esen­
cial para la síntesis de la pared bacteriana (10), e inhibe el reciclado de ciertos metabolitos requeridos para 
mantener la síntesis del peptidoglucano (7).
Los peptidoglucanos consisten en filamentos de polisacáridos largos interconectados por cuatro ami- 
nopéptidos en los que el tercer aminoácido es variable. La forma de interconexión entre las cadenas pep­
tídicas difiere entre las especies bacterianas.
Existen dos clases de inhibidores de la síntesis de la pared celular: los inhibidores de la síntesis del pepti­
doglucano (p. ej., bacitracina) y los inhibidores de la síntesis o ensamblado de otros componentes de la pared.
La bacitracina es a) bactericida, b) inactiva contra las células en reposo, y c) inactiva contra bacterias 
que carecen de pared celular. La bacitracina es bactericida durante el crecimiento, ya que las enzimas lí­
ricas ubicadas en la parte interna de la pared celular abren las cadenas del peptidoglucano para formar 
“extremos libres”. La pared celular luego se rompe y el citoplasma fluye hacia el exterior (7).
La bacitracina es inactiva contra las células en reposo. Las enzimas líticas asociadas con la síntesis" de 
la pared celular son activas sólo cuando las células están en la etapa de crecimiento, no cuando están en 
reposo (7); por lo tanto, los inhibidores de la síntesis de la pared celular son inactivos contra las bacte­
rias en la fase estacionaria (7).
La bacitracina A bloquea la fosforilasa que libera uno de los dos fosfatos terminales del lípido trans­
portador, el cual no puede funcionar entonces como un aceptor del muramilpentapéptido. La bacitracina 
no es específica, también puede inhibir otras reacciones de la fosforilasa (7).
Trimetoprima (TMP)
La TMP (3,4,5-trimetoxibencil pirimidina) inhibe la reductasa del ácido dihidrofólico. Es un análogo 
estructural de la pirimidina de la fracción pteridina del ácido dihidrofólico que inhibe la enzima reducta­
sa, lo que en consecuencia interfiere con el metabolismo del ácido fólico, la posterior síntesis de pirimi­
dina y el metabolismo del fragmento de un carbono en la bacteria (10).
o c h 3
Trimetoprima
La TMP inhibe la enzima bacteriana pero no la enzima de los mamíferos.
Sulfonamidas
Las sulfonamidas derivan de la sulfanilamida.
nh2
so2nh —
Estructura del anillo básico de las sulfonamidas
Pruebas de bacitracina/sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) 5
Sulfametoxazol-trimetoprima (SXT)
La SXT inhibe de manera competitiva la modificación bacteriana del ácido p-aminobenzoico en dihi- 
drofolato. La inhibición secuencial del metabolismo del folato impide por último la síntesis del DNA bac­
teriano (3).
Dado que el sulfametoxazol (SX) y la TMP bloquean la vía metabólica del ácido fólico bacteriano en 
sitios diferentes, juntos producen el bloqueo secuencial, lo que determina un marcado incremento (siner- 
gismo) de la actividad (3, 4).
Ácido para-aminobenzoico
Dihidroptaroato
sintetasa
- ......... inhibido por el sulfametoxazol
Dihidrofolato
Díhidrofolato
reductasa
■<----------- inhibido por la trimetopríma
Tetrahidrofolato
Síntesis de ácido nucleico
Mecanismo de acción de SMX-TMP (9). Vía metabólica del ácido fólico bacteriano
Cuando una población bacteriana homogénea es tratada de manera simultánea con dos antibióticos, 
pueden ocurrir tres tipos de resultados: a) sinergismo, b) suma y c) antagonismo. En el sinergismo, el efec­
to antibiótico de la combinación es mayor que la suma de los efectos de cada antibiótico individual. El 
sinergismo se debe al denominado bloqueo metabólico doble.
IV. REACTIVOS EMPLEADOS
A. Discos diferenciales de bacitracina
1. Discos comerciales Taxo A (BD Biosciences; véase Apéndice 11).
2. 0,04 unidades; los estreptococos del grupo A son susceptibles a una concentración baja de bacitracina.
3. Inhibe la mayoría de las bacterias orales.
B. SXT (cotrimoxazol) es una combinación de dos antibióticos
1. Discos comerciales disponibles
a. SX: 23,75 pg
b. TMP: 1,25 pg
2. Suprime el crecimiento de la mayor parte de la flora normal en los cultivos de fauces que incluyen 
los estreptococos viridans.
V PROCEDIMIENTOS ____
A. Procedimiento 1
1. Medios de cultivo: placas de agar con sangre de camero (SBA) no selectivas.
2. Con una aguja de inoculación, seleccionar y tomar 3-4 colonias puras de estreptococos P-hemolíticos.
3. Estriar el inoculo hacia abajo en el centro de una mitad de una placa de Petri y sembrar por pun­
ción en la profundidad del medio unas pocas veces para observar la hemolisis por debajo de la su­
perficie (subsuperficial).
4. Con un hisopo o un ansa bacteriológica estériles, diseminar el inoculo sobre la totalidad de la mi­
tad de la placa.
6 Pruebas bioquímicas individuales
5. De manera aséptica, colocar el disco de bacitracina Taxo y un disco de SXT en el área inoculada; 
colocar los discos equidistantes.
6. Con una pinza flameada, presionar con suavidad los discos para que se adhieran al agar.
7. Incubar las placas de modo invertido (las tapas hacia abajo), 18-24 h, 35°C, 5-10% C 0 2; si los re­
sultados son negativos, reincubar otras 24 h.
B. Procedimiento 2
1. Medios de cultivo: selectivos, placas de tripticasa soja agar (TSA) (TSA-SXT) con sangre de camero 
(SB).
2. Fórmulas de Gunn, Ohashi, Gaydos y Holt (2).
3. Soluciones stock
a. Solución T: 0,125 g de TMP en unos pocos mililitros de HC1 0,1 N, llevar a 50 mL con agua 
destilada.
b. Solución SX: 2,375 g de SX en unos pocos mililitros de NaOH 1,0 N, llevar a 50 mL con agua 
destilada.
c. Solución SXT: Mezclar partes iguales de soluciones SX y T; concentraciones combinadas fina­
les, 25 pg/mL. Guardar de manera no estéril en alícuotas de 6 mL; congelar a -20°C.
4. Medio completo
TSA 1.000 mL
Solución de SXT 1 mL
despuésMe la esterilización (121°C, 15 Ib, 15 min) agregar
Sangre de camero, 7%, estéril, desfibrinada, 70 mL
5. Almacenar en bolsas de plástico en el refrigerador, 10-15°C hasta una semana.
Kurzynski y col. (5, 6), establecieron que el medio TSA-SXT es superior al medio no selectivo conven­
cional para la recuperación de estreptococos del grupo A dentro de las 18-24 h; es aceptable para la recu­
peración de los estreptococos del grupo A.
6. Distribuir en placas de Petri; 15-20 mL/placa (15 x 100 mm)
7. Seleccionar 3-4 colonias puras de estreptococos (i-hemolíticos.
a. Con ansa bacteriológica o hisopo estéril, esüiar para obtener un desarrollo confluente; sembrar va­
rias veces por punción en la profundidad del medio para la observación de hemólisis subsuperficial.
b. Colocar
de manera aséptica un disco de bacitracina Taxo sobre el área inoculada.
c. Con una pinza flameada, presionar con suavidad los discos para que se adhieran al agar.
8. Incubar las placas de modo invertido (las tapas hacia abajo), 18-24 h, 35°C, 5-10% C 0 2; si los re­
sultados son negativos, reincubar 24 h adicionales.
VI. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD
A. Bacitracina sensible (S): Streptococcus pyogenes ATCC 12344.
B. Bacitracina resistente (R): Streptococcus agalactiae grupo B ATCC 13813.
Vil. RESULTADOS
VIII. INTERPRETACIÓN
Discos de Bacitracina/SXT o bacitracina en el medio de cultivo TSA-SXT 
1. Sensible (S, Sen, sensible)
a. Cualquier zona alrededor del disco; crecimiento inhibido.
b. Informar: estreptococos p-hemolíticos presuntivamente del grupo A por la prueba de la baci­
tracina.
Pruebas de bacitracina/sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) 7
2. Resistente (R )
a. Ninguna zona alrededor del disco; crecimiento hasta el disco y alrededor de él.
b. Informar: estreptococos (3-hemolíticos que presuntivamente no son del grupo A por la prueba 
de la bacitracina.
Cuadro 1-1. Interpretaciones del disco bacitracina/SXT
Bacitracina SXT Identificación presuntiva
S R Estreptococos p-hemolítico del grupo A
R R Estreptococos p-hemoliticos del grupo B
R S Estreptococos p-hemolíticos que no pertenecen a los grupos A o B
S S Descartar grupo A o B con las pruebas serológicas
{Nota: La interpretación de la sensibilidad del SXT puede ser difícil ya que el microorganismo puede 
presentar un leve crecimiento antes de que ocurra la inhibición total (4).) La incubación en anaerobiosis 
aumenta la detección de cepas de estreptococos del grupo A que sólo producen estreptolisina O oxígeno 
lábil e inhiben gran parte de la flora normal (8). No deben medirse las zonas de inhibición. Las colonias 
P-hemolíticas en el medio de TSA/SXT y las zonas de hemolisis son más pequeñas que cuando desarro­
llan en el medio no selectivo SBA.
IX. PRECAUCIONES
A. Algunos estreptococos que no son del grupo A también pueden ser inhibidos por la bacitracina; por lo 
tanto, con frecuencia se realiza una prueba junto con la prueba de sensibilidad al SXT.
B. La prueba de la bacitracina es bastante exacta como una prueba presuntiva pero no es altamente es­
pecífica (5). Más de 10% de los estreptococos de los grupos C y G y ó ^ d e las cepas del grupo B tam­
bién son sensibles a la bacitracina (5).
C. Sólo deben ser investigados los estreptococos P-hemolíticos ya que muchos estreptococos P-hemolí- 
ticos (incluso S. pneumoniae) son sensibles a concentraciones bajas de bacitracina (5). Streptococcus 
cricetus, S. downei, S. ferns y S. macacae también son sensibles a la bacitracina pero raras veces son 
aislados a partir de infecciones humanas.
D. El crecimiento del inoculo bacteriano debe ser confluente; un inoculo demasiado escaso producirá que 
los estreptococos que no son del grupo A parezcan sensibles a la bacitracina (1).
E. No se recomienda un cultivo de fauces para la inoculación ya que la flora normal puede inhibir en par­
te el desarrollo de los estreptococos del grupo A, sobre todo en las áreas de crecimiento más confluen­
te (5).
F. No utilizar positivo (+) y negativo (-) para indicar los resultados; utilizar la denominación S (sensi­
ble, susceptible) y R (resistente). Los términos positivo y negativo podrían denotar crecimiento o au­
sencia de crecimiento en la placa pero no necesariamente alrededor del disco.
REFERENCIAS
1. Facklam RR, Thacker LG, Fox B, Etiquez L. Pre­
sumptive identification of streptococci with a new 
test system. J Clin Microbiol 1982;15(6): 987-990.
2. Gunn BA, Ohashi DK, Gaydos CA, HoltES. Selec­
tive and enhanced recovery of group A and B strep­
tococci from throat cultures with sheep blood agar 
containing sulfamethoxazole and trimethoprim. 
J Clin Microbiol 1977;5(6):650-655.
3. Hitchings GH. Mechanismof action of trimethoprim- 
sulfamethoxazole. Int J Infect Dis 1973; 128(suppl); 
S433-S436.
4. Jawetz E, Melnick JL, Adelberg EA. Review of Me­
dical Microbiology, ed 17. Los Altos, CA: Appleton 
Lange, 1987.
5 Kurzynski TA, Meise CK. Evaluation of sulfamet­
hoxazole-trimethoprim blood agar plates for reco­
very of group A streptococci from throat cultures. J 
Clin Microbiol 1979;9(2): 189-193.
6. Kurzynski T, Meise C, Van Holten C. Evaluation of 
techniques for isolation of group A streptococci 
from throat cultures. J Clin Microbiol 1981; 13(5): 
891-894.
7. Lancini G, Parenti F. Antibiotics An Integrated View. 
New York: Springer-Verlag, 1982:39,46,48.
8. Lauer BA, Reller LB, Mirrett S. Effect of atmosp­
here and duration of incubation on primary isolation 
of group A streptococci from throat cultures. J Clin 
Microbiol 1983;17(2):338-340.
9. Nagarajan R. Antibacterial activities and modes 
of action of vancomycin and related glycopepti- 
des. Antimicrob Agents Chemother 1991 ;35: 605- 
609.
10. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, et al. Manual 
of Clinical Microbiology, ed 6. Washington, DC: 
American Society for Microbiology, 1995:1294, 
1296.
CAPÍ TULO
Pruebas de hidrólisis 
de bilis y esculina
I. PRINCIPIO
Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el glucósido esculina a esculetina y glu­
cosa en presencia de bilis; una prueba aglucona.
II. OBJETIVO
(Véanse caps. 43-45)
A. Ayudar en la identificación y diferenciación de las especies de Enterococcus del grupo D (+) (antes 
Streptococcus faecalis, S.faecium y S. durans, más especies nuevas) y las especies de Streptococcus 
del grupo D no enterocócico (+) (p. ej., S. equinus, S. bovis y variantes de S. bovis) de otros estrepto­
cocos que no son del grupo D (-). Es una prueba presuntiva (cuadro 2-1). El género Streptococcus 
fue dividido en tres géneros: Enterococcus, Lactococcus y Streptococcus. (68)
Antes se aceptaba que el crecimiento en NaCl junto con bilis y esculina brindaba una identifica­
ción presuntiva de las especies de Enterococcus (29). Sin embargo, en la actualidad con el aislamien­
to de especies de Pcdiococcus y de Leuconostoc a partir de infecciones humanas, esta identificación 
presuntiva podría ser errónea (29). Tanto las especies de Pediococcus como de Leuconostoc brindan 
resultados positivos con NaCl y bilis-esculina (29).
B. Ayudar en la diferenciación de los miembros de la familia Enterobacteriaceae, en especial la división 
Klebsiella-Enterobactcr-Sermtia (todos V+j_(K-E-S), Kluyvera (+), Leclercia (+) y especies de Cede- 
cea (+jj¡21, 47) y servir como una herramienta taxonómica para la clasificación de la familia Entero­
bacteriaceae (22).
C. Ayudar en la diferenciación de especies de Listeria (+) de otros bacilos grampositivos anaerobios fa­
cultativos no formadores de esporas (-) (71); por ejemplo, Erysipelothrix rhusiopathiae con una simi­
litud morfológica y algunos difteroides (64).
D. Identificación presuntiva del grupo Bacteroides fragilis (véase Agar con bilis y esculina para Bacte- 
roides (BBE) (52) y medio con kanamicina-bilis-esculina (KEB) (11)).
E. Ayudar en la identificación de Vibrio vulnificus (81) (véase Precauciones).
F. Ayudar en la identificación de Aeromonas eucrenophila móvil (+); diferenciación de especies de Ae- 
romonas: A. caviae (+), A. veronii (+) y A. hydrophilia (+) de A. sobria (-) (34). Sin embargo, las es­
pecies de Aeromonas no crecen a 10-45°C, una característica que puede utilizarse para diferenciarlas 
de los enterococos.
G. Los estudios epidemiológicos y la identificación presuntiva de Cryptococcus neoformans de otras es­
pecies de Cryptococcus por la producción de pigmento. Esto no se relaciona con el color castaño-ne­
gro desarrollado por la reacción de los iones férricos con la esculina (19). (Véase Medio de agar con 
base de esculina y estreptomicina-cloranfenicol).
H. Diferenciación de especies de Fusobacterium, sobre todo F. mortiferum (+) y F. necrogenes (+) de 
otras especies de Fusobacterium (-) (2, 47).
I. Ayudar en la diferenciación de Falvimonas oryzhabitans pigmentado de amarillo (-) (antes
VE-2) de 
Sphingomonas (Pseudomonas) paucimobilis (+) y Chryseomonas luteola (+) (antes VE-1) (47).
Pruebas de hidrólisis de bilis y escuiina 9
Cuadro 2-1. Clasificación de cepa tipo de Enterococcus3 y especies de Streptococcus 
Enterococcus del grupo D:
E. avium (13, 57) AFCC 14025
E. casse('<havu& 
E. columbae
ATCC 25788
E. durans (13, 46) ATCC 19432
E. faecalisP ATCC 19433
E. faecium 
E. flavescens
ATCC 19434
E. gallinarum (7, 13) NCDO 2313 ATCC 49573
E. hirae (46) NCDO 1258 ATCC 8043
E. malodoratus NCDO 846 ATCC 43197
F. m undtii (12) NCDO 2375 ATCC 43186
E. pseudoaviurrfi NCDO 2138 ATCC 49372
F. raffinose-variablee CDC 1739-79 ATCC 49427
E. seriolicida ATCC 49156
E. solitariusP 
E. sulfureus
Enterococcus que no son del grupo D:
CDCf 885-78 ATCC 49428
E. cecorum 
E. dispar
E, raffinose-variable
NCD09 2674 ATCC 43198
F. saccharolyticus 
Streptococcus:
NCDO 2594 ATCC 43076
S. bovis ATCC 33317 NCDO 5^7
S. equinus ATCC 9812
a Antes incluido en el género Streptococcus.
b El anterior S. Uecium subesp. casseliflavus es en la actualidad una especie separada de Enterococcus (13, 83).
0 Las subespecies anteriores Streptococcus faecalis subesp. liquetaciens, S. faecalis subesp. zymogens y S. faecalis 
subesp. faecalis ya no se reconocen y se agrupan en una especie, Enterococcus faecalis (8, 44).
d Collins y col., remitido para publicación (27).
e Collins MD, Facklam RR, Farrow JAE, Williams R, remitido para publicación (27).
1 Centers for Disease Control and Prevention.
9 National Collection of Dairy Organisms.
III. BIOQUÍMICA
La escuiina deriva del castaño de Indias y posee actividad de vitamina P (19). La escuiina es un glucósido, 
un derivado acetal de un monosacárido simple (50). Cuando una sustancia que no es un hidrato de carbono se 
une a un azúcar por una unión acetal, el acetal resultante se denomina glucósido y la porción no elucida se de­
nomina aglucona (6) (o genina (33)); la porción esteroide se une a un residuo carbono del azúcar. La agluco- 
na se une al azúcar principal a través de un átomo de oxígeno (kri), una unión glucosídica) (9). Dos partes de 
la molécula (glucosa y 7-hidroxicumarina) se unen juntas por una unión éster a través del oxígeno (47).
D-Glucosa No es un hidrato de carbono
(P-D-Glucopiranosa)
Escuiina
Glucósido (derivado acetal)
Los acétales se hidrolizan con facilidad por acción de los ácidos (9); la base de la prueba de escuiina 
es la hidrólisis en la ligadura p de la escuiina a esculetina por una P-glucosidasa constitutiva (la enzima 
esculinasa), la cual libera la molécula de glucosa (33). La escuiina, un derivado de la cumarina (6-P-glu- 
cósido-7-hidroxicumarina) (47), es hidrolizada a 6.7-hidroxicumarina y glucosa.
10 Pruebas bioquímicas individuales
H OH
Esculina (C15H160 9) 
6-(i-Glucósido-7-hidroxicumarina
H OH
Esculetina (aglucona) p-D-Glucosa
6,7-Dihidroxicumarina
La hidrólisis de la esculina puede demostrarse por una de tres maneras (14,21-23,55).
Habitual
En el método más utilizado, la esculetina reacciona con una sal de hierro (III) (férrica; Fe3+) para for­
mar un complejo fenólico de color castaño oscuro o negro. El citrato férrico (FeC6H50 7) o el citrato fé­
rrico y de amonio (una mezcla 50/50 de citrato férrico y citrato de amonio) es incorporado en el medio 
de bilis y esculina a una concentración de 0,05% como un indicador de la hidrólisis de la esculina y pro­
duce la formación de esculetina. La hidrólisis habitual de la esculina es un procedimiento que ocurre en 
dos pasos: la cepa bacteriana debe a) crecer en presencia de una concentración particular de bilis y b) pro­
ducir esculinasa para hidrolizar la esculina (22, 23).
Complejo fenólico férrico 
(color castaño oscuro-negro)
Esculetina Iones férricos
Aún se desconoce el mecanismo exacto, pero la hipótesis es
F e + + +
H
H
O
Alternativas
A. Determinación de la producción de ácido a partir de la fermentación de los productos de hidrólisis, 
una porción de glucosa, con formación de gas o sin ella (C 0 2 y H2S), con una disminución en el pH 
del medio (14, 56). Sin embargo, la falta relativa de sensibilidad de las determinaciones secundarias 
del pH con indicadores químicos limita mucho este método de fermentación de la glucosa (23).
B. Determinación de una pérdida (disminución) de la fluorescencia (366 nm) a medida que la molécula 
de esculina intacta es lúdrolizada; se rompe la unión ji-D-glucosídica (21,23).
IV. MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS
(Notas: se requiere una incubación prolongada debido a que el crecimiento y la multiplicación bacte­
rianas deben preceder la síntesis de la enzima requerida para la hidrólisis de la esculina (63).
Pruebas de hidrólisis de bilis y esculina 11
La bilis inhibe los estreptococos que no son del grupo D que hidrolizan la esculina (22, 54); Oxgall al 
2%, una concentración 10 x de bilis, es igual a 20% de sales biliares, y 1-4KJ de bilis es equivalente a 10 
y 40% de sales biliares. La bilis inhibe las bacterias grampositivas distintas de los enterococos.
Hierro (III) es la nueva terminología para el ion férrico (Fe3+); el citrato de hierro (III) es un indicador 
de la hidrólisis de la esculina y la formación resultante de esculetina. El crecimiento de los enterococos 
puede ser optimizado por el agregado de suero de caballo.
A. Fórmulas; medios de cultivo para el crecimiento
1. Medio de bilis y esculina (BEM) agar (BEA); pH 7,1 ± 0,2
Peptona de caseína 5 g
Extracto de came 3 g
Oxgall (bilis) 40 g
Esculina en polvo, Ci5H160 9 1 g
Citrato de hierro (III), FeC6H50 7 0 g
o
Citrato de hierro (III) y amonio, (NH4)2HC6H50 7
Agar (sólo para medio sólido) 15 g
Agua desionizada 1.000 mL
Después de la esterilización, agregar
Suero de caballo, 5%, estéril 50 mL
2. Medio de bilis y esculina modificado (MBEM): sin suero de caballo.
3. Bilis esculina azida agar/caldo (Pfizer Selective Enterococcus Medium (PSE), medio selectivo pa­
ra enterococos (SEM), Enterococcosel (BBL)).
a. Fórmula de Isenberg, Goldberg y Sampson (43); concentración reducida de bilis y agregado de 
azida sódica.
b. Ingredientes; pH 7,1 ± 0,2
Peptona de caseína 17 g
Peptona de came 3g
Extracto de levadura 5 g
Esculina 1 g
Oxgall (bilis) 10 g
Cloruro de sodio, NaCl 5 g
Citrato de sodio, C3H4OH(COO)3Na3 1 g
Citrato de hierro (III) y amonio, (50/50) 0,5 g
Azida sódica, NaN3, 0,25 g
Agar (sólo para medio sólido) 15 g
Agua desionizada 1.000 mL
B. Inhibidores
1. La bilis inhibe el crecimiento de la mayoría de los cocos grampositivos distintos de las especies de 
Streptococcus y a una concentración de 20% inhibe las bacterias anaerobias distintas del grupo 
B. fragilis así como la mayoría de los anaerobios facultativos.
2. La azida sódica (NaN3), 0,25 g/L, inhibe el crecimiento de las bacterias gramnegativas, inhibe los 
citocromos bacterianos (30) y reduce la actividad de la catalasa. Permite el desarrollo de cocos 
grampositivos (p. ej., estreptococos).
C. Método de preparación
1. Pesar la cantidad exacta según indica el rótulo del envase; los productos de los diferentes fabrican­
tes pueden presentar leves diferencias.
2. Rehidratar con agua destilada o desionizada; calentar suavemente la solución.
D. Esterilización
1. Medio base: esterilización en autoclave a 121°C, 15 Ib, 15 mm.
2. Suero de caballo: filtración (Millipore).
E. Fraccionamiento
1. Placas de Petri: 15-20 mL/placa (15 x 100 mm); fraccionar después de la esterilización.
2. Tubos con tapa a rosca: 5,0 mL/tubo (16 x 125 mm). Enfriar en una posición inclinada para obte­
ner mayor superficie de siembra.
F. Aspecto del medio terminado y no inoculado: color crema (amarillo pálido), medios de cultivo sóli­
dos en placa o en tubos.
12 Pruebas bioquímicas individuales
G. Almacenamiento
1. Refrigerador, 2-8°C; placas invertidas (tapas hacia abajo).
2. El vencimiento es aproximadamente a las 3-4 semanas.
H. Método de inoculación
1. Inoculo
a. Comprobación de estreptococos/enterococos
(1) Crecimiento de un cultivo puro de 24 h en el caldo de Todd-Hewitt (25).
(2) Medio en tubos: agregar
2 gotas a la superficie del pico de flauta con una pipeta Pasteur o 
un ansa de inoculación; estriar el pico de flauta con un movimiento en forma de S (4).
(3) Medio en placa: agregar 2 gotas a la superficie; utilizar la siembra por estrías en cuatro cua­
drantes para obtener el máximo aislamiento.
b. Comprobación de la familia Enterobacteriaceae
(1) Crecimiento a partir de agar infusión de corazón (HIA), agar con lisina y hierro (LIA) o agar 
con hierro de Kligler/agar con azúcar triple y hierro (KIA/TSI); cultivo puro.
(2) Utilizar un inoculo denso (ansada de 4 mm) excepto cuando se comprueba Escherichia coli 
(inoculo liviano) (20, 51, 85) (véase Precauciones).
I. Incubación: en aerobiosis, 35°C.
1. Estreptococos/enterococos: 48 h.
a. Controlar de manera periódica los tubos y si la reacción es positiva, informar el resultado.
b. Esperar 72 h antes de informar un resultado negativo.
2. Enterobacteriaceae: 18-24 h.
Una atmósfera con aumento de la concentración de C 0 2 aumenta la cantidad de estreptococos viri- 
dans que dan una reacción de bilis y esculina positiva; los estreptococos del grupo D y los enterococos 
desarrollan bien en una atmósfera sin C 0 2 (1).
V. RESULTADOS
VI. INTERPRETACIÓN
A. Resultado positivo (+) de la prueba BE para la hidrólisis de la esculina
1. Pico de flauta (medio en tubo)
a. Un color castaño oscuro a negro difunde hacia el pico de flauta y hacia las colonias translúci­
das a blancas.
b. La mitad o más del medio se tiñe de negro.
2. Medio en placa
a. Cualquier ennegrecimiento del medio es significativo.
b. Las colonias están rodeadas por halos de color negro a castaño oscuro.
3. Placas o picos de flauta: ennegrecimiento en cualquier intervalo de tiempo (55).
B. Resultado negativo (-) de la prueba BE para la hidrólisis de la esculina: tres posibles lecturas
1. No existe ennegrecimiento del medio.
2. Ennegrecimiento de menos de la mitad del medio en los tubos después de una incubación de 72 h 
(reacción ±) (25).
3. El crecimiento puede ocurrir, pero esto no indica ruptura de la esculina; sólo indica que la concen­
tración de la bilis no inhibió el crecimiento habitual de microorganismos distintos de los enteroco­
cos del grupo D/estreptococos.
Vil. PRUEBAS RÁPIDAS
(Nota: la incubación durante 4 h o menos determina sobre todo la esculinasa constitutiva (una p-glu- 
cosidasa) (18). Todos los procedimientos rápidos utilizan medios que no favorecen el crecimiento.)
Pruebas de hidrólisis de bilis y esculina 13
A. Prueba de la mancha para esculina (20, 21, 71)
1. La hidrólisis es determinada por la pérdida de fluorescencia medida con un generador de luz ultra­
violeta a 366 nm. La pérdida de fluorescencia indica hidrólisis de la esculina. La esculina es fluo­
rescente, pero ni la glucosa ni la esculetina producen fluorescencia a esta longitud de onda.
2. Solución de esculina: pipetear una solución de esculina al 0,02% en un papel de filtro sobre un por­
taobjeto.
a. Frotar una colonia bacteriana aislada sobre el papel de prueba.
b. Incubar a 35°C durante 30 min.
3. Interpretación
a. Hidrólisis: oscurecimiento; pérdida de la fluorescencia.
b. Ausencia de hidrólisis: ausencia de oscurecimiento; ausencia de pérdida de la fluorescencia.
B. Solución tamponada de esculina para la prueba rápida (prueba de la hidrólisis de la esculina con 
cloruro de sodio)
1. Procedimiento de Qadri, DeSilva y Zubairi (61).
2. Solución tamponada de esculina, ajustar a pH 5,6 ± 0,2
Esculina en polvo, C15H160 9 5 g
Citrato de hierro (IH) y amonio, (50/50) 0,5 g
Citrato férrico, FeC6H57 
Citrato de amonio, (NH4)3C6H50 7
Fosfato monopotásico, KH2P04 0,1 g
Fosfato dipotásico, K2HP04 0,4 g
Cloruro de sodio, NaCl 50 g
Agua desionizada 1.000 mL
3. Fraccionamiento/almacenamiento
a. 0,5 mL/ tubo con tapa a rosca (12 x 75 mm).
b. Estable por lo menos 8 semanas en refrigerador (4°C).
4. Inoculo
a. Densidad de McFarland estándar #3 en 0,5 mL de solución tamponada de esculina (véase Apén­
dice 5).
b. Un inoculo denso aumenta la rapidez de la prueba y hace innecesario utilizar materiales esté­
riles debido a que la densidad de los microorganismos y la falta de carbono y nitrógeno apre­
ciable en la solución impide el sobrecrecimiento por contaminantes dentro del marco de tiem­
po de la prueba.
5. Incubación: baño de M aría a 35°C durante 4 h.
6. Interpretación
a. Positivo (+)
(1) Cambio de color de la solución al castaño oscuro a negro.
(2) Todos los enterococos muestran una reacción 2+ a 4+ dentro de las 2 h.
b. Negativo (-): ningún cambio de color; la solución permanece incolora.
C. Prueba rápida en un tubo con reactivo para bilis y esculina (Rapid Bile Esculin: RBE)
1. Procedimiento de Edberg, Trepeta, Kontnick y Torres (23).
2. Propósito dual
a. Determinar la producción de esculinasa en presencia de un equivalente de la bilis.
b. Determinar la solubilidad de la bilis de Streptococcus pneumoniae.
3. Principio: la prueba se basa en la determinación de la [3-glucosidasa constitutiva (esculinasa) con 
represión de la enzima por un equivalente de la bilis (desoxicolato de sodio).
4. Solución de reactivo, pH 7,5.
a. Ingredientes: a un buffer fosfato de Sorensen 0,05 M (pH 7,5) (véase Apéndice 6) agregar con­
centraciones finales (peso/volumen) de
(1) Desoxicolato de sodio (deoxicolato),<2,5% (un sustituto de las sales biliares).
(2) p-Nitrofenil-p-D-glucopiranósido, 0,5% (un sustrato incoloro e hidrolizable de la esculinasa).
b. Disolver a 35°C.
c. Distribuir en alícuotas de 0,25 mL en los tubos de prueba con tapa a rosca (12 x 75 mm).
d. Almacenamiento: en la oscuridad; estable por lo menos durante 6 meses.
(1) Alícuotas líquidas; refrigerar a 4-10°C.
(2) Alícuotas deshidratadas; refrigerar a 4-10°C con desecador.
14 Pruebas bioquímicas individuales
5. Inoculo: concentración bacteriana suficiente para producir una turbidez final de por lo menos un 
estándar de 0,5 McFarland (véase Apéndice 5).
a. El reactivo líquido puede gelificarse con el almacenamiento; llevar a 35°C para producir la re­
licuefacción antes del uso. Inocular las colonias bacterianas.
b. Reactivo deshidratado: inocular con la suspensión bacteriana en agua destilada.
6. Incubación: en aerobiosis a 35°C; leer a intervalos de 5 minutos hasta los 30 min.
7. Interpretación
a. Color amarillo (+)
(1) Positivo para la hidrólisis de la esculina en presencia de bilis.
(2) Color equivalente a un color castaño oscuro a negro observado en 40%'de la reacción de bilis 
y esculina.
b. Sin cambio de color, aclaramiento de la turbidez.
(1) Solubilidad de bilis positiva (sensible, S)
(a) Liberación de enzima autolítica.
(b) S. pneumoniae.
(2) Hidrólisis de la esculina negativa (-).
c. Sin cambio de color, sin aclaramiento de la turbidez.
(1) Solubilidad de bilis negativa (-).
(2) Hidrólisis de la esculina negativa (-).
Edberg y Bell (18) modificaron el procedimiento para diferenciar Bacteroides (+) de Fusobacterium (-) 
sobre la base de la presencia de (3-glucosidasa constitutiva. Las excepciones al procedimiento anterior son:
1. Distribuir alícuotas de 0,30 mL.
2. Utilizar un inoculo estándar 0,05 de McFarland o anterior (véase Apéndice 5).
3. Incubar en aerobiosis a temperatura ambiente (22-25°C).
VIII. PRUEBAS ALTERNATIVAS
A. Caldo con esculina para anaerobios
1. Caldo infusión de corazón (HIB), 1 L, que contiene
Esculina 1 g
Agar 1 g
Hemina, 5 mg/mL (opcional) 1 mL
Vitamina K, (opcional) 1 mL
2. Incubación: en anaerobiosis a 35°C durante 24-48 h o hasta que se obtiene un buen desarrollo.
3. Agregar unas gotas de solución de citrato férrico y de amonio al 0,Wc a cada tubo. Reacción po­
sitiva: color negro en el medio.
4. De manera alternativa, el tubo puede observarse bajo luz ultravioleta de onda larga (366 nm); la 
pérdida de fluorescencia indica un resultado positivo.
B. Agar con bilis y esculina para Bacteroides (BBE) (agar para aislamiento de B. fragilis, agar bi-
lis-esculina para B. fragilis)
1. Medio de Livingston, Kominos y Yee (52).
2. Objetivo: selección rápida e identificación presuntiva
del grupo B. fragilis (76) (B. fragilis, B. the- 
taiotaomicron, B. ovatus, B. distasonis, B. uniformis, B. caccae y B. vulgatus (60)) y medio selec­
tivo para Bilophila wadsworthia (3).
3. El medio selectivo y diferencial permite distinguir la capacidad de hidrolizar la esculina y produ­
cir catalasa. Un estimulante del crecimiento y la hemina proporcionan la posibilidad de compro­
bar la producción de catalasa (52). BBE puede utilizarse para la reacción de la esculina si el mi­
croorganismo de prueba es resistente a la bilis y a la gentam icina. Los miem bros del grupo 
B. fragilis casi siempre son resistentes a la penicilina (36-38) y pueden proteger a las bacterias sen­
sibles a la penicilina que los acompañan en las infecciones mixtas (40).
4. Ingredientes
a. Solución stock de hemina: concentración final, 5 g/mL. La hemina es necesaria o estimula de 
manera notable el crecimiento (72). A un frasco de 100 mL agregar
Pruebas de hidrólisis de bilis y esculina 15
Hemina
Hidróxido de sodio, NaOH, 1 N 
Agua destilada c.s.p.
0,5 g
10 mL 
100 mL
b. Solución stock de gentamicina
(1) Gentamicina; Garamycine, solución de 40 mg/mL, inyectable. Un antibiótico de amplio es­
pectro que junto con la bilis inhibe los anaerobios facultativos y la mayoría de las bacterias 
anaerobias gramnegativas, otros microorganismos distintos de Bacteroides positivos a la es­
culina que pueden tolerar la bilis (60).
(2) Concentración final: 40 (g/mL.
c. Medio, pH 7,0 ± 0,2
Tripticasa soja agar (TSA) 40 g
Bilis, 20% ' 20 g
Esculina hidratada 1 g
Citrato de hierro (III) y amonio, (50/50) 0,5 g
Agua desionizada 1.000 mL
No se requiere calentar; agitar para disolver y agregar:
Hemina, 5 |ig/mL, 2,5 mL. estéril
Solución de gentamicina, 2,5 mL, estéril.
d. Método de esterilización
(1) Stock de hemina y medio base: esterilización en autoclave a 121°C, 15 Ib, 15 min.
(2) Gentamicina: filtración (Millipore).
5. Distribuir en placas de Petri: 12-15 mL/placa (15 x 100 mm).
6. El medio no inoculado es un medio sólido para placa, claro, ligeramente amarillo.
7. Almacenamiento
a. Soluciones stock y medios de cultivo: refrigerar a 2-8°C; placas invertidas (tapas hacia abajo).
b. El vencimiento es aproximadamente a las 3-6 semanas.
8. Método de inoculación
a. El medio debe ser reducido inmediatamente antes de la inoculación colocándolo en condicio­
nes anaerobias durante 18-24 h (16) o, por ejemplo, en un sistema para anaerobiosis de GasPak 
(69). Sin tomar en consideración el sistema utilizado, es necesario el empleo de un indicador 
de anaerobiosis.
b. Muestra directa: utilizar el estriado en cuatro cuadrantes para el máximo aislamiento. La mues­
tra debe sembrarse en cuanto se recibe en el laboratorio.
9. Incubación: en anaerobiosis a 35°C, placas invertidas (tapas hacia abajo); leer los resultados fi­
nales después de las 48 h.
10. Interpretación
(Nota: los estudios realizados por Livingston y col. (52) demostraron tres tipos distintos de morfolo­
gía de las colonias del grupo B. fragilis. Todas son redondas, sobreelevadas, con bordes completos y de 
más de 1 mm de diámetro, pero diferencias específicas permiten distinguir los tres tipos.)
a. Hidrólisis de la esculina
(1) Positivo (+)
(a) Ennegrecimiento del medio
Tipo 1:31% exhibió colonias romas, opacas, de color gris marengo débil, rodeadas por 
una zona oscura con bilis precipitada (52).
Tipo 2: 68% exhibió colonias de color gris claro a oscuro, brillantes, butirosas, semi­
transparentes, rodeadas por una zona gris sin precipitado (52).
(b) Identificación presuntiva del grupo B. fragilis.
(2) Negativo (-)
(a) Crecimiento sin cambio en el color del medio.
(b) Esculina no hidrolizada.
(c) Gmpo B. fragilis del tipo 3; 1% exhibió colonias blancas, brillantes, butirosas, sin zona gris (52).
(d) Raras veces otros microorganismos.
b. Producción de catalasa
(1) Exponer el crecimiento en placas de BBE a la atmósfera durante 30 min antes de agregar 
peróxido de hidrógeno (H20 2) al 3%.
16 Pruebas bioquímicas individuales
(2) Positivo (+): aparición de burbujas.
(3) Negativo (-): ausencia de burbujas.
C. Prueba del disco con kanamicina-bilis
1. Procedimiento de Draper y Barry (17) modificado por Vargo y col. (82).
2. Prueba de detección para el grupo B. fm gilis: prueba de estimulación con bilis y prueba de resis­
tencia a la kanamicina (82).
3. Discos de papel de filtro impregnados en bilis y en antibiótico; el grupo B. fragilis es la única es­
pecie que puede desarrollar en presencia de bilis y exhibe resistencia a la kanamicina (82).
a. Bilis al 2% (Oxgall), concentración de 25 mg.
b. Kanamicina, 1.000 (g/mL.
4. Medio de crecimiento: caldo tioglicolato (Thio); turbidez igual al estándar 0,5 de McFarland (véa­
se Apéndice 5).
5. Medio para la prueba del disco: placas de agar sangre para Brucella.
6. Incubación: en anaerobiosis a 35°C durante 24-48 h; todos los microorganismos del grupo B. fra ­
gilis dan resultados positivos después de 24 h.
7. Interpretación
a. Positivo (+)
(1) Resistente (R) a la kanamicina: zona de inhibición < 1 0 mm de diámetro.
(2) Resistente (R) a la bilis: crecimiento en el borde del disco.
b. Negativo (-)
(1) Sensible (susceptible) (S) a la kanamicina: zona de inhibición > 12 mm de diámetro.
(2) Sensible (susceptible) (S) a la bilis: inhibición del crecimiento, halos de inhibición de 17-30 
mm de diámetro.
Los discos de bilis están rodeados en su totalidad por una zona grande de hemolisis y los microorga­
nismos que crecen a menudo dentro de esta zona producen un precipitado oscuro en el agar; sin embar­
go, este fenómeno acentúa el crecimiento, lo que hace más fácil la interpretación (17).
D. Medio con kanamicina-bilis-esculina (KEB)
1. Medio de Chan y Porschen (11), basado en el medio de Swan (79).
2. Detección para el aislamiento y distinción presuntiva del grupo B. fragilis de otros bacilos gram- 
negativos anaerobios (11, 17, 82) en muestras que contienen flora mixta.
3. Medio de prueba, tripticasa soja agar (TSA) que contiene:
Kanamicina, 1.000 pg/mL, agregada después de la esterilización en autoclave 
Esculina, 5,0
Citrato de hierro (Til) y amonio. (50/50, citrato férrico y citrato de amonio)
Bilis, 20,0 (u Oxgall, 2%)
La kanamicina asegura el aislamiento selectivo de miembros del grupo B. fragilis e inhibe el creci­
miento de los bacilos gramnegativos anaerobios facultativos y aerobios; la bilis al 20% estimula el desa­
rrollo del grupo B. fragilis pero inhibe otras bacterias anaerobias excepto Fusobacterium mortiferum (52).
4. Incubación: en anaerobiosis (p ej., GasPak, BBL) a 35°C durante 24 h; se recomienda una incu­
bación adicional de 24 h cuando las reacciones son negativas.
5. Interpretación (60): examen de las colonias bajo microscopio con una lámpara de UV de longitud 
de onda larga para detectar la fluorescencia.
a. Las colonias pigmentadas del grupo B. fragilis emiten luz del naranja al rojo ladrillo. La fluo­
rescencia es visible antes que la pigmentación.
b. Bilis-esculina (+): crecimiento con ennegrecimiento en el medio circundante.
Muchos investigadores (5, 11, 17, 78, 82) demostraron que el grupo B. fragilis son los únicos bacilos 
gramnegativos anaerobios encontrados con más frecuencia que no son inhibidos por la bilis y también 
son resistentes a altas concentraciones de kanamicina. En el medio de KEB, los estudios de Chan y Pors­
chen (11) demostraron que hubo desarrollo en 100% de los microorganismos B. fragilis, con la produc­
ción de hidrólisis de la esculina en 97-100% de las cepas, mientras se inhibe de manera selectiva el cre­
cimiento de otros anaerobios gramnegativos, así como de la mayoría de los anaerobios facultativos, sin 
producir hidrólisis.
Pruebas de hidrólisis de bilis y esculina 17
E. Medio de agar con base de esculina y estreptomicina-cloranfenicol
1. Medio de Edberg, Chaskes, Alture-Werber y Singer (19).
2. Aislamiento e identificación presuntiva de C. neoformans (19) de otras levaduras. La prueba es 
específica para C. neoformans (19).
3. Principio: la esculina
o el componente esculetina de la hidrólisis de la esculina se convierten en un 
pigmento símil melanina.
a. Los diseñadores (19) sospechan que la reacción es similar a la conversión de difenoles, amino- 
fenoles y diaminobencenos a melanina.
b. La producción del pigmento no está relacionada con el color castaño-negro producido por la 
reacción de iones férricos con la esculina, aunque los colores producidos por ambos mecanis­
mos son similares. Los estudios no determinan si las levaduras pueden usar la molécula de es­
culina intacta o si es necesaria la hidrólisis. C. neoformans puede producir un pigmento símil 
melanina tanto a partir de la esculina como de la esculetina. La 6,7-dihidroxicumarina es, des­
de el punto de vista estructural, bastante similar a los difenoles para actuar como un interme­
diario en el camino biosintético de la melanina (19).
4. Medio, pH 7,1 ± 0,2 
a. Ingredientes
Peptona 10 g
Extracto de levadura 1 g
Esculina en polvo 0,5 g
Glucosa (dextrosa) 5,0 g
Agar, purificado 15 g
Agua desionizada 1.000 mL
Autoclave a 121°C, 15 Ib, durante 15 min y agregar
Sulfato de gentamicina, esterilizado por filtración (p. ej., Millipore) 25 mg
Cloranfenicol, esterilizado por filtración 10 mg
b. Fraccionamiento/almacenamiento: fraccionar 20 mL en placas de Petri (100 mm); refrigerar a 
4-10°C; estable alrededor de 4-6 meses.
5. Interpretación
a. Positivo (+): pigmentación castaño-negra; C. neoformans.
b. Negativo (-); dos posibles resultados:
(1) Pigmentación amarillo pálida
(a) Designado “tórpido”; pigmentación débil.
(b) Especies de Cryptococcus distintas de C. neoformans.
(2) Incoloro
(a) Sin pigmentación.
(b) Especies de Cryptococcus distintas de C. neoformans o especies de Candida, Torulopsis 
glabrata, especies de Geotrichum o especies de Rhodotorula.
IX. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD
Cepas de la American Type Culture Collection (ATCC); microorganismos del National Committee for 
Clinical Laboratory Standards (NCCLS).
(Nota: siempre se incluye una placa o tubo sin inocular como control negativo.)
A. BE, BEM, MBEM
1. Positivo (+)
Enterococcúsjaeccñis
2. Negativo (-)
Streptococcus, pyogenes 
Streptococcus mutans
B. B B E yK E B
1. Positivo (+)
Bacte¡pides fragilis 
Bacteroides thetaiotaomicron
ATCC 29212
ATCC 19615 
ATCC 25175
ATCC 25285 
ATCC 29741
18 Pruebas bioquímicas individuales
2. Negativo (-)
Escherichia coli 
Clostridium peifringeus 
Fusobacterium necrophorum 
Proteus mirabilis
ATCC 2592 
ATCC 13124 
ATCC 25286 
ATCC 12453
C. Prueba rápida con reactivo para bilis y esculina (RBE)
1. Positivo (+)
a. Hidrólisis de la esculina: Enterococcus faecalis ATCC 29212.
b. Solubilidad de la bilis: Streptococcus pneumoniae ATCC 49136.
2. Negativo (-)
Streptococcus pyogenes ATCC 12344
D. Medio de agar con base de esculina y estreptomicina-cloranfenicol para Cryptococcus
1. Positivo (+)
Cryptococcus neoformans ATCC 14116
2. Negativo (-)
Cryptococcus albidus 
Cryptococcus laut entii 
Cryptococcus terreus
ATCC 10666 
ATCC 18803 
ATCC 11799
X. PRECAUCIONES
A. Generales
1. La prueba de bilis y esculina fue utilizada en un comienzo para identificar los enterococos (54); sin 
embargo, otros estreptococos del grupo D y en ocasiones los estreptococos que no pertenecen al gru­
po D y otros géneros, Aerococcus (V, variable) (30, 34) y Listeria (71), pueden tolerar la concentra­
ción de bilis y romper la esculina. Las especies de Aerococcus no desarrollan a 10-45°C, una caracte­
rística que puede utilizarse para diferenciarlos de los enterococos; son a-hemolíticos y todos son 
variables con respecto a la hidrólisis de bilis y esculina. Resulta de ayuda realizar una coloración de 
Gram; las especies de Aerococcus son por lo común cocos grampositivos dispuestos en tétradas. Se 
confirman por serología que demuestra la falta del antígeno del grupo D (42). La demostración del 
an.ígeno del grupo D en los extractos de cultivos no es específica para los enterococos (27). Algunas 
cepas de Leuconosíoc y la mayoría de las cepas de Pediococcus también poseen el antígeno D (29).
Las propiedades de crecimiento en medios de cultivo con bilis al 1-4% y ácido a partir de la escu­
lina (hidrólisis) no son exclusivas para los estreptococos del grupo D; son compartidas por la mayoría 
de las cepas del grupo D (24). Alrededor de 3% de los estreptococos viridans son bilis y esculina po­
sitivos (47); por ejemplo, S. intermedius, S. mutans, S. uberis, S. sanguis y S. constellatus (2, 24, 26, 
65). S. intermedius y S. constellatus son sinónimos subjetivos de Streptococcus anginosus.
La prueba de bilis y esculina sola no puede utilizarse para identificar los enterococos, pero una 
reacción positiva puede ser utilizada en combinación con otras pruebas para identificar de manera 
presuntiva las especies de Enterococcus. Facklam (24) y Facklam y col. (30) recomiendan una com­
binación de bilis y esculina y tolerancia a la sal (crecimiento en presencia de NaCl al 6,5%). Antes 
se aceptaba que el crecimiento en presencia de NaCl junto con bilis y esculina daba una identifica­
ción presuntiva de las especies de Enterococcus (29). Sin embargo, con el aislamiento de Pediococ­
cus y especies de Leuconosíoc a partir de infecciones humanas, esta identificación presuntiva podría 
ser errónea (29). Tanto Pediococcus como las especies de Leuconosíoc brindan resultados positivos 
con NaCl y con bilis y esculina (29).
Los enterococos del grupo D y los estreptococos difieren en su sensibilidad a los agentes anti­
microbianos (1) y deben ser diferenciados para administrar la terapéutica antimicrobiana apropia­
da. Los enterococos por lo común son resistentes a la penicilina, mientras que las cepas no ente- 
rocócicas por lo general son sensibles a la penicilina (1). La comprobación serológica es la única 
manera para confirmar la identificación de enterococos del grupo D y estreptococos (27).
2. Las diferencias en las fórmulas de los medios de cultivo con bilis y esculina son las responsables 
de las diferentes reacciones de los microorganismos (25). El medio de bilis y esculina (BEM) con­
tiene cuatro veces más de bilis (40%) que el medio de bilis esculina azida (BEA) (10%).
Los estreptococos no enterococos, como algunos estreptococos viridans, son capaces de romper la escu­
lina (p. ej., S. sanguis, S. mutans y S. anginosus), pero estas especies por lo común no pueden tole­
rar una concentración aumentada del 40% de bilis e hidrolizan la esculina en combinación. Los estu-
Pruebas de hidrólisis de bilis y esculina 19
dios realizados por Sabbaj y col. (66) mostraron que todas las cepas de S. mutans ludrolizan la escu­
lina; cepas ocasionales podrían crecer en 40% de bilis, pero podrían no crecer en 6,5% de sal. Sin em­
bargo, las colonias de S. mutans se distinguen con facilidad ya que son pequeñas y duras y tienden a 
adherirse a la superficie del agat. Otra especie de estreptococos del grupo viridans que en ocasiones 
puede lúdrolizar la esculina y desarrollar en una concentración aumentada de bilis es S. sanguis (66).
Sin embargo, con concentraciones menores de bilis (10%) en BEA, algunos estreptococos vi­
ridans pueden mostrar crecimiento e hidrólisis (25); una menor concentración de bilis es menos 
inhibitoria para los enterococos que son del grupo D y para los estreptococos (24).
Por consiguiente, el medio que contiene azida es un mejor medio selectivo primario, pero uno con 
una concentración aumentada de bilis (40%) y sin azida es mejor para la diferenciación. Los estudios 
realizados por Facklam (26) encontraron que el medio SEM (Pfizer) resultaba poco satisfactorio para 
la diferenciación exacta de los estreptococos del grupo D de los que no pertenecen a ese grupo.
3. Existen amplias discrepancias entre los estudios de hidrólisis de la esculina en la familia Entero- 
bacteriaceae. Levine y col. (50) y Vaughn y Levine (84) redescubrieron su valor en la diferencia­
ción de los integrantes de esa familia. Wasilauskas (85) y Lindell y Quinn (51) mostraron que sus
miembros pueden desarrollar en el medio de crecimiento con bilis-esculina (p. ej., Vaughn-Levi- 
ne (VL), BEM, MBEM), pero que sólo ciertos miembros pueden hidrolizar la esculina y producir 
el característico ennegrecimiento cuando reaccionan con el hierro. Edberg y col. (21) mostraron 
que los géneros Klebsiella (V), Enterobacter (+) y Serraría (V+) y las especies Proteus vulgaris 
(V), Proteus rettgeri (V) (antes Providencia rettgeri) y Citrobacter koseri (V) (antes C. diversus) 
podrían hidrolizar la esculina dentro de las 24 h. Según Edberg y col. (22), Enterobacter cloacae 
hidroliza la esculina tanto de manera variable como débil; este microorganismo posee pequeñas 
cantidades de enzima constitutiva, la produce en forma inactiva o la contiene en un sitio relativa­
mente inaccesible, ya que produce de modo uniforme una reacción positiva más débil tanto en me­
dios de cultivo para el crecimiento como en los que no favorecen el desarrollo, oscureciendo por 
lo común sólo 2 a 5 mm por debajo del pico de flauta en el fondo del tubo.
Lindell y Quinn (51) observaron una hidrólisis 100% positiva en 4 h con Klebsiella pneumo­
niae subesp. pneumoniae, Enterobacter aerogenes y tres especies de Serraría; hidrólisis 100% ne­
gativa en 4 h con Shigella sonnei, especies de Salmonella, P. mirabilis, Morganella morganii y 
Proteus inconstans (antes Providencia alcalifaciens) y Providencia stuarríi; hidrólisis 70% nega­
tiva en 18 h con E. coli, Citrobacter freundii, C. koseri, Hafnia alvei y P. vulgaris; y obtuvieron 
resultados equívocos (-) con Pantoea agglomerans (antes Enterobacter agglomerans) y P. rettge­
ri. La glucosidasa responsable de la hidrólisis de la esculina en todos los miembros de la familia 
Enierobacteriaceae distintos de E. coli es constitutiva (55) y se detecta con facilidad por las prue­
bas rápidas para esculina sin crecimiento (21).
Edberg y col. (21) recomiendan el empleo del BEM como medio de elección para la compro­
bación de rutina de la familia Enterobacteriaceae. Está limitado para la diferenciación de las espe­
cies de Klebsiella-Enterobacter-Serratia.
4. La (3-glucosidasa de E. coli es inducible y el microorganismo no puede producir la enzima consti­
tutiva (55). No se produce hidrólisis en las pruebas sin crecimiento (p. ej., las pruebas de la man­
cha) (20, 21, 55); la inducción no ocurre durante este corto periodo de incubación (20).
La (3-glucosidasa no es un componente normal de E. coli; la elabora cuando la necesita (p. ej., 
cuando la bacteria debe utilizar lactosa u otro disacárido o compuesto relacionado como fuente de 
carbono). La lactosa actúa como un inductor y permite la producción de (3-glucosidasa codificada en 
el gen estructural de E. coli. Por consiguiente, uno debe utilizar un inoculo liviano obtenido tocan­
do la parte superior de una colonia con una aguja bacteriológica (no con un ansa) cuando se com­
prueba E. coli con un medio de prueba que favorece el crecimiento (p. ej., BEM, MBEM) y la reac­
ción se interpreta dentro de un periodo de incubación de 18 a 24 h (21,55) Wasilauskas (85) sugiere 
que el tiempo requerido para que un aislamiento produzca hidrólisis es directamente proporcional 
al tamaño del inoculo. Un inoculo denso presenta más células para la inducción de (3-glucosidasa ca­
paz de hidrolizar la esculina y una incubación mayor de 24 h hace que más células sean inducidas 
con el tiempo; el tiempo o la temperatura, o ambos, aumentan la positividad (55). Ninguna otra es­
pecie en la familia mostró este marcado aumento en la hidrólisis con el tiempo; sin embargo, después 
de la inducción, se pierde la capacidad de hidrolizar si los microorganismos son subcultivados en un 
medio que no contiene glucósido (55). Debido a que se induce la P-glucosidasa de E. coli, es nece­
sario utilizar un inoculo liviano cuando se utiliza un medio de crecimiento con una incubación de 18- 
24 h o realizar un prueba rápida sin crecimiento en tira o en mancha (55).
20 Pruebas bioquímicas individuales
5. La producción tardía de piocianina por Pseudomonas aeruginosa puede oscurecer el medio de 
BEA; esta reacción no es una “verdadera” prueba (58). Asimismo, las cepas productoras de pio- 
melanina pueden ocasionar un ennegrecimiento intenso después de unos días; esto no se debe a la 
hidrólisis de la esculina ya que no muestra fluorescencia bajo la luz ultravioleta (58).
6. La hidrólisis de la esculina falsa positiva puede ocurrir con los bacilos no fermentadores H2S po­
sitivos como Shewanella putrefaciens (antes Pseudomonas putrefaciens) (33).
7. Los estudios realizados por Tison (81) mostraron que V. vulnificus hidroliza la esculina en medios 
habituales no inhibitorios que contienen esculina (p. ej., BEM, caldo infusión de corazón con es­
culina (HIE)) en condiciones estándar de incubación. Sin embargo, existen informes contradicto­
rios; el Bergey’s Manual o f Systematic Bacteriology, vol. I (48), Baumann y col. (4) y Weaver y 
col. (86) informaron especies negativas para la hidrólisis de la esculina; otros investigadores (15, 
53, 86) informaron resultados positivos variables. Los estudios de Tison (81) también mostraron 
que algunas cepas fallaron en hidrolizar la esculina en medios de cultivo que contienen compues­
tos inhibitorios (p. ej., BEA). Según Tison, el fracaso de los investigadores para definir las condi­
ciones y variaciones en los procedimientos puede ser el responsable de los informes contradicto­
rios en la bibliografía de la hidrólisis de la esculina por V. vulnificus.
B. Medio con agar y bilis esculina azida (BEA)
1. Los estudios realizados por Havelaar y col. (41) mostraron que el agar BEA incubado a 44°C du­
rante 48 h favorece el crecimiento de los enterococos del grupo D y de los estreptococos casi con 
exclusividad, si bien es también el más inhibitorio de todos los medios probados (p. ej., etil viole­
ta azida (EVA), caldo con dextrosa y azida, BEA, caldo Kenner fecal (KF)) contra los estreptoco­
cos del grupo D. Estos autores recomiendan considerar las reacciones positivas en BEA sólo cuan­
do hay presencia de un crecimiento denso e hidrólisis de la esculina (es decir, crecimiento con halos 
castaño negruzcos alrededor de las colonias). Havelaar y col. (41) también encontraron que las ce­
pas distintas de los estreptococos del grupo D podrían producir reacciones típicas en BEA cuando 
se incuban a 37°C (temperatura recomendada por Facklam) (25).
2. Algunos estreptococos del grupo B pueden crecer en agar BEA, aunque no ennegrecen el agar (59).
3. Según los estudios de Wasilauskas (85), el tiempo de la hidrólisis de la esculina se relaciona con 
el inoculo. La cantidad de colonias de E. cotí capaces de hidrolizar la esculina aumenta con el tiem­
po (55). La inducción no ocurre durante un período de incubación corto (20). Wasilauskas (85) y 
Edberg y col. (20, 21) determinaron que la positividad aumenta con el tiempo.
C. Anaerobios: existen dos limitaciones principales para utilizar los medios de cultivo con bilis-esculi-
na para identificar los bacilos gramnegativos anaerobios (52).
1. Se requiere un período de incubación en anaerobiosis de 24-48 h.
2. Una especie, Fusobacterium mortiferum, es resistente a la bilis y puede producir (3-glucosidasa 
(52) como actividad de enzima inducible (18).
D. Agar con bilis y esculina para Bacteroides (BBE)
1. Los enterococos pueden mostrar un crecimiento débil después de una incubación prolongada (2). 
Aparecen como colonias pequeñas, transparentes y pueden colorearse como gramnegativos debi­
do a su estado dañado (77).
2. Los microorganismos del grupo B. fragilis presentan un buen desarrollo; la excepción es B. vul- 
gatus que por lo común no hidroliza la esculina y por consiguiente no exhibe cambio de color en 
el medio que lo rodea (60, 76). Bacteroides splanchnicus y Bacteroides eggerthii, que no son in­
tegrantes del grupo B. fragilis, son resistentes a la bilis e hidrolizan la esculina (60); sin embargo, 
estas especies raras veces se aíslan y son parte de la flora normal del
intestino (2).
3. Otros anaerobios, Enterobacteriaceae y enterococos que pueden crecer en BBE fallan en producir 
la morfología o el ennegrecimiento característicos asociados con el grupo B. fragilis.
4. Cepas ocasionales de B. fragilis no crecen debido a la inhibición por la bilis al 20%.
5. De vez en cuando las cepas de Fusobacterium (p. ej., F. mortiferum (2)) desarrollan; sin embargo, esto 
es predecible ya que las fusobacterias son resistentes a una concentración de bilis del 20% (75). Las co­
lonias aparecen como “huevos fritos” y son más pequeñas que Bacteroides (< 1 mm de diámetro); su 
tamaño se debe a su relativa mayor sensibilidad a la gentamicina (32). Todas son catalasa negativas (52).
6. Raras cepas de K. pneumoniae subesp. pneumoniae pueden crecer en BBE y pueden ennegrecer el 
medio (2); sin embargo, las colonias se distinguen con facilidad por su tamaño como un alfiler y 
un ennegrecimiento menos intenso que produce un color castaño negruzco más que gris.
7. El medio BBE no inhibe el desarrollo de las levaduras (52); sin embargo, no se produce el enne­
grecimiento.
Pruebas de hidrólisis de bilis y esculina 21
8. El medio no permitirá la detección de todas las especies de Bacteroides resistentes a la penicilina, 
en especial las que son inhibidas por la bilis (52). Eiemplos: B. melaninogenicus y Prevotella ora­
lis (antes Bacteroides oralis) por lo común no desarrollan en BBE (52).
9. La hemina posee una función dual: es un estimulador del crecimiento y es de elección para la com­
probación de la catalasa. Muchas cepas de Bacteroides requieren hemina para el crecimiento (35, 87). 
El grupo B. fragilis no puede sintetizar su propia hemina y debe transportar la hemina preforma­
da para sintetizar las proteínas hémicas como los citocromos y la catalasa (73). Para el crecimien­
to óptimo se requiere una concentración de 1 pg/rnL.
10. Los estudios realizados por Wilkins y col. (88) mostraron que la mayor actividad de la catalasa se ob­
servaba cuando se agregaba hemina después de la esterilización en autoclave, lo que indica que la 
disponibilidad de la hemina y no su concentración total determina la producción de catalasa. La ca­
talasa no se encuentra de manera uniforme en todos los microorganismos del grupo B. fragilis; sin 
embargo, B. fragilis es de modo específico el microorganismo anaerobio aislado con mayor frecuen­
cia a partir de las muestras clínicas y por lo general es catalasa positivo (88). El grupo B. fragilis y
B. putredinis son los únicos bacilos gramnegativos anaerobios que son catalasa positivos (88).
11. No utilizar un hidrato de carbono fermentable en el medio base si se está determinando la produc­
ción de catalasa. Concentraciones de glucosa tan pequeñas como de 0,5-1,0% de glucosa pueden 
causar la inmediata cesación en la producción de catalasa (39,74). En un medio que contiene hi­
dratos de carbono se produce escasa cantidad de catalasa porque las células continúan utilizando 
la glucosa en su ciclo de crecimiento (88). Por consiguiente, la concentración de hidrato de carbo­
no y la concentración de hemina disponible pueden afectar la reacción de la catalasa (88).
12. La gentamicina impide el desarrollo de la mayoría de los microorganismos distintos de Bacteroi­
des esculina positivos que puede tolerar la bilis. A una concentración de 10 |ig/mL suprime los 
anaerobios facultativos mientras permite el crecimiento del grupo B. fragilis. Los microorganis­
mos del grupo B. fragilis poseen una concentración inhibitoria mínima de 80 pg/mL o superior 
(32). La gentamicina es termoestable y no pierde su actividad con la incubación; puede agregarse 
al medio antes de la esterilización (10).
13. La bilis (Oxgall) inhibe casi todos los bacilos anaerobios gramnegativos excepto los que pertene­
cen al grupo B. fragilis (70).
14. Sembrar la muestra tan rápido como sea posible (ASAP) después de que se recibe en el laborato­
rio, ya que algunas cepas del grupo B. fragilis no pueden desarrollar bien debido a las propiedades 
selectivas del medio (60). Es aconsejable también incluir un medio de agar sangre no selectivo co­
mo agar sangre para anaerobiosis de los CDC (60).
E. Prueba del disco para Bacteroides
1. La confiabilidad de la prueba del disco para la detección de Bacteroides depende de la estandari­
zación de la densidad del inoculo; si es demasiado denso, las zonas se toman mucho más peque­
ñas y menos separadas (17). Draper y Barry (17) estandarizaron el procedimiento mediante el ajus­
te de la turbidez del crecimiento en caldo equiparado con el estándar 0,5 de la escala de McFarland. 
Sutter y col. (75,78) recomendaron que las zonas sensibles son > 1 0 mm y las resistentes < 10 mm; 
Vargo y col. (82), > 12 mm y < 12 mm; y Draper y Barry (17) estandarizaron las interpretaciones 
a sensible, > 1 2 mm y resistente, < 1 0 mm.
2. Cuando se prueban los microorganismos del gmpo B. fragilis con un procedimiento de disco de 
bilis y antibiótico (sólo un procedimiento de detección), la sensibilidad para uno o ambos discos 
indica una necesidad de realizar pruebas bioquímicas adicionales (17).
F. Producción de pigmento en un medio con base de esculina para C. neoformans
1. La hidrólisis de la esculina por las bacterias es una reacción diferente de la producción de pigmen­
to directamente a partir de la esculina sin la hidrólisis por C. neoformans', no existe ion férrico 
(Fe3+) en el medio y el color castaño-negro producido es la melanina, no el complejo formado por 
la esculina y los iones férricos (19). Muchas especies de Cryptococcus hidrolizan la esculina y la 
hidrólisis es variable entre las especies de Candida. La hidrólisis de la esculina no puede utilizar­
se para diferenciar las especies de Cryptococcus (19).
2. La producción de pigmento por C. neoformans sólo es una evidencia presuntiva y deben realizar­
se pruebas bioquímicas y serológicas adicionales para la confirmación (19).
G. Prueba rápida con reactivo para bilis y esculina (RBE)
1. A la temperatura del refrigerador (4-10°C), el reactivo puede gelificarse. Debe llevarse a 35°C pa­
ra licuarlo antes del uso (23).
22 Pruebas bioquímicas individuales
2. Una concentración de desoxicolato de sodio de 2 , ^ o superior inhibe la (3-glucosidasa cons­
titutiva de Streptococcus bovis (23). A una concentración de desoxicolato de sodio de 2,5% o 
menos, la esculin, S. anginosus (47)) y de otros miembros del grupo viridans de estreptoco­
cos comienza a detectarse (23).
3. La mayoría de los enterococos y estreptococos distintos del grupo D son inhibidos por el desoxi­
colato de sodio; sin embargo, también puede identificarse S. pneumoniae sensible a la bilis dentro 
de los 30 min debido a la inducción autolítica por el desoxicolato de sodio (23).
4. Un pH de 7,5 es óptimo tanto para el desarrollo de color como para la actividad de la enzima (23).
5. El período de incubación máximo es de 30 min (23).
H. Prueba rápida de la esculina de Qadri y col. (57).
1. Durante la refrigeración se forma un precipitado en la solución; calentar a 60-70°C para resuspender 
el precipitado sin efectos adversos (61).
2. Los estudios de Qadri y col. (61) demostraron que, entre los bacilos gramnegativos, Klebsiella re­
quiere hasta 2-4 h para que ocurra la hidrólisis; los aislamientos de Serratia marceseens tardan has­
ta 4 h para que se produzca la hidrólisis de la esculina.
3. Una cepa de Streptococcus sanguis, dos cepas de S. salivaris y una cepa de S. marceseens y una 
de P. vulgaris mostraron resultados falsos negativos comparados con los del medio líquido de 
Vaughn-Levine (61).
I. Prueba de hidrólisis de esculina y cloruro de sodio
1. Finalizar la prueba a las 4 h evitará cualquier reacción falsa positiva por otros estreptococos (62).
2. Un pH menor de 5,4 retardará la reacción. La hidrólisis de la esculina es completamente inhibida 
en un pH menor de 4,0 y un pH mayor de 5,8 causará un cambio de color del medio al amarillo 
que interfiere con la interpretación de los resultados.
J. Pruebas de aglutinación
del látex
1. Existen muchos errores posibles en el uso de la aglutinación del látex para la identificación de los 
estreptococos del grupo D. Facklam y col. (28) y Levchak y Ellner (49) recomiendan que antes de 
utilizar las pruebas de aglutinación del látex, los microorganismos sean diferenciados por pruebas 
bioquímicas en los grupos enterococos y no enterococos. Levchak y Ellner (49) recomiendan lo 
siguiente cuando se utilizan las pruebas de aglutinación del látex:
a. Comprobar sólo cultivos puros, debido a que en ocasiones se producen reacciones cruzadas con 
los bacilos gramnegativos.
b. Tratar con tripsina las colonias hemolíticas antes de realizar la prueba.
REFERENCIAS
1. Balows A, Hausler WJ Jr, Herrmann KL, et al. 
Manual of Clinical Microbiology, ed 5. Washing­
ton, DC: American Society for Microbiology, 
1991:246, 250.
2. Baron EJ, Finegold SM. Bailey & Scott’s Diagnos­
tic Microbiology, ed 8. Philadelphia: CV. Mosby, 
1990:90, 533, 538, 543.
3. Baron EJ, Summanen P, Downes J, et al. Bilophila 
wadsworthia gen. nov., sp. nov., a unique gramne- 
gativeanaerobicrodrecoveredfrom appendicitis spe­
cimens and human faeces. J Gen Microbiol 1989; 
135:3405-3411.
4. Baumann P. Fumiss AL, Lee JV. Genus Vibrio. In: 
Holt JG, Krieg NR, eds. Bergey’s Manual of Syste­
matic B acteriology, vol 1. B altimore: Williams & Wil­
kins, 1984:518-538.
5. Bittner J. A simple method for rapid isolation and 
identification oiBacteroidesfragilis.ArchRoum Pat­
hol Exp Microbiol 1975;34:231.
6. Blazevic DJ, Schreckenberger PC, Matsen JM. Eva­
luation of the PathoTec “Rapid 1-D System.” Appl 
Microbiol 1973;26(6):886-889.
7. Bridge PD, Sneath PHA. Streptococcus gallinarum 
sp. nov. and Streptococcus oralis sp nov. Int J Syst 
Bacteriol 1982;32:410-415.
8. Bridge PD, Sneath PHA. Numerical taxonomy of 
Streptococcus. J Gen Microbiol 1983;129:565-597.
9. Cantarow A, Schepartz B. Biochemistry, ed 3. Phi­
ladelphia: WB Saunders, 1962:10-11.
10. Casemore DP. Gentamicin as a bacterial agent in vi­
rology tissue culture. J Clin Pathol 1967;20 (3):298- 
299.
11. Chan PCK, Porschen RK. Evaluation of Kanamy- 
cin-Esculin-Bile agar for isolation and presumptive 
identification of Bacteroides fragilis group. J Clin 
Microbiol 1977 ;6(5):528-529.
12. Collins MD, Farrow JAE, Jones D. EnterdSoccus 
mundii sp. nov. Int J Syst Bacteriol 1986;36(1):8-12.
13. Collins MD, Jones D, Farrow JAE, et al. Enterococ­
cus avium nom. rev., comb. nov.; E. casseliflavus nom. 
rev., comb, nov.; E. durans nom. rev., comb, nov., E. 
gallinarum comb, nov., and E. malodoratus sp nov. 
Int J Syst Bacteriol 1984a; 43(2):220-223.
14. Cowan ST. Cowan & Steel’s Manual for the Identi­
fication ol Medical Bacteriology, ed 2. Cambridge: 
Cambridge University Press, 1974:29.
15. Desmond EP, Janda JM, Adams FI, Bottone EJ. 
Comparative studies and laboratory diagnosis of Vi­
brio vulnifcus, an invasive Vibrio sp. J Clin Micro­
biol 1984; 19(2): 122-125.
Pruebas de hidrólisis de bilis y esculina 23
16. Dowell VR, Hawkins IM. Laboratory Methods in 
Anaerobic Bacteriology. CDC Laboratory Manual. 
Atlanta, GA: Centers for Disease Control, 1979.
17. Draper DL, Barry AL. Rapid identification of Bac- 
ternides fragilis with bile and antibiotic disks. J Clin 
Microbiol 1977 ;5(4):439-443.
18. Edberg SC, Bell SR. Lack of constituive p-glucosi- 
dase (esculinase) in the genus Fusobactenum. J Clin 
Microbiol 1985,22(3):435-437.
19. Edberg SC, Chaskes SJ, Alture-Werber E, Singer 
JM. Esculin-based medium for isolation and identi­
fication of Crvptococcus neoformans. J Clin Micro­
biol 1980;12(3):332-335.
20. Edberg SC, Gam K, Bottenbley CJ, Singer JM. Ra­
pid spot test for the determination of esculin hy­
drolysis. J Clin Microbiol 1976;4(2): 180-184.
21 Edberg SC, Pittman S, Singer JM. Esculin hydroly- 
sisby Enterobacteriaceae. J ClinMicrobiol 1977;6(2): 
111-116.
22. Edberg SC, Pittman S, Singer JM. The use of biie- 
esculin agar for the taxonomic classification of the 
family Enterobacteriaceae. Antonie van Leeuwen­
hoek 1977;43(l):31-35.
23. Edberg SC, Trepeta RW, Kontnick CM, Torres AR. 
Measurement of active constitutive |3- D-glucosidase 
(esculinase) in the presence of sodium desoxycho- 
late. J Clin Microbiol 1985; 21(3):363-365.
24. Facklam RR. Recognition of group D streptococcal 
species of human origin by biochemical and physio­
logical tests. Appl Microbiol 1972; 23(6): 1131-1139.
25. Facklam RR. Comparison of several laboratory me­
dia for presumptive identification of enterococci 
andgroupDstreptococci.ApplMicrobioll973;26(2): 
138-145.
26. Facklam RR. Physiological differentiation of viridans 
streptococci. J Clin Microbiol 1977;5(2): 184-201.
27. Facklam RR, Collins MD. Identification of Entero­
coccus species isolated from human infections by a 
conventional test scheme. J Clin Microbiol 1989; 
27(4):731-734.
28. Facklam RR, Cooksey RC, Wortham EC. Evalua­
tion of commercial latex agglutination reagents for 
grouping streptococci. J ClinMicrobiol 1979; 10(5): 
641-646.
29. Facklam R, Hollis D, Collins MD. Identification of 
gram-positive coccal and coccobacillary vancomy­
cin-resistant bacteria. J Clin Microbiol 1989; 
27(4):724-730.
30. Facklam RR, Padula JF, Thacker LG, et al. Pre­
sumptive identification of group A, B, and D strep­
tococci. Appl Microbiol 1974;27( 1): 107-113.
31. Farrow JAE, Collins MD. Enterococcus hirae, a 
new species that include amino assay strain NCDO 
1258 and strains causing growth depression in young 
chickens. Int J Syst Bacteriol 1985;35(l):73-75.
32. Finegold SM, Sutter VL. Susceptibility of gramne­
gative anaerobic bacilli to gentamicin and other ami­
noglycosides. J Infect Dis 1971;124 (suppl):S556- 
558.
33. Frank SK, von Riesen VL. Aglycon tests determine 
hydrolysis of arbutin, esculin, and salicin by nonfer- 
mentative gram-negative bacteria. Lab Med 1978; 
9(8):48-51.
34. George WL, Jones MJ, Nakata MM. Phenotypic 
characteristics of Aeromonas species isolated from 
adult humans. J Clin Microbiol 1986;23 (6): 1026- 
1029.
35. Gibbons RJ, MacDonald JB. Hemin and vitamin K 
compounds as required factors for the cultivation of 
certain stimnsofBacteioiitesmelaniiwgenicus. JBac- 
teriol 1960;80(2): 164-170.
36. Gorbach SL, Bartlett JG. Medical progress. Anae­
robic infections (part one). N Engl J Med 1974;290 
(21): 1177-1184.
37. Gorbach SL, Bartlett JG. Medical progress. Anae­
robic infections (part two). N Engl J Med 1974;290 
(21):1237-1245.
38. Gorbach SL, Bartlett JG. Medical progress: Anae­
robic infections (part three). N Engl J Med 1974;290 
(21): 1289-1294.
39. Gregory EM, Veltri BJ, Wagner DL, Wilkins TD. 
Carbohydrate repression of catalase synthesis in 
Bacteroides fragilis. J Bacteriol 1977; 129(1):534- 
535.
40. Hackman AS, Wilkins TD. In vivo protection of Fu- 
sobacterium necrophorum from penicillin by Bac- 
temides fragilis. Antimicrob Agents Chemother 
1975;7(5):698 703.
41. Havelaar AH, Tips PD, Engel HWB. Comparati­
ve study of confirmation media for detecting group 
S streptococci. Water Res 1982; 16( 12): 1605- 
1609.
42. Howard BJ, Klaas JII, Rubin SJ, et al. Clinical and 
Pathogenic Microbiology. St. Louis: CV Mosby, 
1987:251.
43. Isenberg HD, Goldberg D, Sampson J. Laboratory 
studies with a selective enterococcus medium. Appl 
Microbiol 1970;20(3):433-436.
44. Jones D, Sackin MJ, Sneath PHA. A numerical ta­
xonomic study of streptococci of serological group
D. J Gen Microbiol 1972;72:439-450.
45. Kalina AP. The taxonomy and nomenclature of 
enterococci. Int J Syst Bacteriol 1970;20(2): 185- 
189.
46. Knight RG, Shlaes DM. Deoxyribonucleic acid re­
latedness of Enterococcus hirae and Streptococcus 
durans homology group II. Int J Syst Bacteriol 1986; 
36(1): 111-113.
47. Koneman EW, Allen SD, JandaWM, Schreckenber- 
ger PC, Winn WC Jr. Color Atlasand Text-book of 
Diagnostic Microbiology, ed 4. Philadelphia: JB 
Lippincott, 1992:155-156, 208-209, 271,438,459- 
460.
48. Kneg NR, Holt JG, eds. Bergey’s Manual of Syste­
mic Bacteriology,