Ultracentrifugación investigacion -Mónica Ivonne Díaz López

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Ultracentrifugación
MIDL
Introducción 
Las técnicas de ultracentrifugación son las mas 
complicadas de los métodos que existen para la 
determinación de los pesos moleculares de altos 
polímeros. Son por lo general, mucho mas adecuados 
para su aplicación a moléculas proteicas compactadas 
que a polímeros enrollados al azar, donde las 
conformaciones extendidas incrementan las 
desviaciones del comportamiento ideal y las 
oportunidades del entrelazamiento mecánico de las 
cadenas del polímero. 
Puesto que la fuerza gravitacional en una ultracentrífuga es suficiente para precipitar moléculas de polímero de acuerdo con su tamaño, 
la ultracentrifugación se utiliza como método para la determinación del peso molecular, especialmente para sistemas monodispersos
como las proteínas.
Un poco de Historia…..
•El científico Theodor Svedberg inventó la primera ultracentrífuga en 
1923, su trabajo de investigación se basaba en coloides y proteínas.
•Su grupo de trabajo utilizaba la ultracentrífuga para determinar el 
peso molecular y la subunidad estructural de la hemoglobina.
•El grupo de Svedberg desarrollo algunas centrífugas y los primeros 
modelos funcionaban a velocidades de hasta 900 000 g y cuyos 
rotores eran pequeños; otros modelos funcionaban a velocidades de 
hasta 260 000 g. 
¿Qué es?
•Es una técnica que consiste en someter
una mezcla homogeneizada a una
velocidad de rotación muy alta, de
forma que, a velocidades más lentas,
sedimentan los componentes más
grandes, y a velocidades mayores, los
componentes más pequeños.
•Aunque las masas de diferentes
partículas sean muy similares,
sedimentan en tiempos distintos.
Técnicas Experimentales
• La ultracentrífuga esta formada por un rotor de aluminio de varias pulgadas de diámetro que gira a alta velocidad en una
cámara a vacío.
• La disolución que se centrifuga se coloca en una cubeta pequeña en el interior del rotor próxima a su periferia.
• El rotor puede impulsarse eléctricamente o por una turbina de aceite o aire.
• La cubeta va equipada con ventanas y la concentración del polímero a lo largo de toda ella se determina por métodos ópticos
basados en medidas del índice de refracción o de absorbancia.
• Los disolventes para experimentos de ultracentrifugación deben elegirse por su diferencia con el polímero en la densidad
(para garantizar la sedimentación), y en el índice de refracción (para permitir la medida).
• Debe evitarse el utilizar mezcla de disolventes, y son mas adecuados aquellos de baja viscosidad
Ultracentrífuga 
Velocidad de Sedimentación
En un experimento de velocidad de sedimentación las 
macromoléculas se someten a un campo centrífugo 
elevado tal que la fuerza de centrifugación es mayor 
que la de difusión, por lo que existe un transporte neto 
de material hacia el fondo de la celda. Es un método 
hidrodinámico de transporte que permite fraccionar las 
macromoléculas en base a las diferencias en 
coeficiente de sedimentación (una función de la masa, 
la densidad y la forma macromolecular). 
Equilibrio de Sedimentación
En esta modalidad las muestras se someten a campos centrífugos
moderados hasta que se igualan las fuerzas opuestas de
centrifugación y difusión (condición de equilibrio). En estas
condiciones, las especies macromoleculares se distribuyen
formando un gradiente de concentración que se caracteriza porque
a) no varía con el tiempo
b) es independiente de las propiedades hidrodinámicas (forma) de 
las macromoléculas 
c) depende únicamente de la masa molecular de la especie que 
sedimenta.
Determinación del Peso Molecular
•Tanto Mw como Mz puede determinarse mediante la acción de fuerzas de ultracentrigufación en 
disoluciones diluidas de polímeros en disolventes adecuados.
•Se deben utilizar disolventes de densidades e índices de refracción distintos a los de los polímeros para 
asegurar el movimiento de los polímeros y la detección óptica.
•Se utilizan velocidades altas de hasta 70 000 rpm para transportar las moléculas de los polímeros a 
través de un disolvente en el tubo de ensayo.
Peso Molecular Promedio en Peso (Mw)
•La determinación del peso molecular medio en peso Mw se puede calcular a partir de la siguiente 
ecuación:
𝑴𝒘 =
2𝑅𝑇 𝐼𝑛
𝐶2
𝐶1
(1 − 𝑉𝜌)𝜔2(𝑟2
2 − 𝑟1
2)
Donde:
•r1 y r2: Distancias del centro de rotación al punto de observación en el tubo de ensayo
•(𝟏 − 𝑽𝝆): factor de flotabilidad
•𝝎: velocidad angular de rotación
Nota: Esto solo aplica en caso de que el polímero sea heterogéneo y soluciones ideales
Si los datos se procesan en función del incremento de refracción ñ, diferencia entre los índices de refracción de la 
disolución y disolvente se puede calcular el peso molecular promedio centrifugal por medio de la siguiente ecuación
𝑴𝒛 =
𝑅𝑇
(1 − 𝑉𝜌)𝜔2
1
𝑟
𝑑ñ
𝑑𝑟 2
1
𝑟
𝑑ñ
𝑑𝑟 1
ñ2 − ñ1
Donde:
ñ1: índice de refracción del solvente
ñ2: índice de refracción de la solución
Peso Molecular Promedio Centrifugal (Mz) 
Ultracentrifugación
Analítica
•La ultracentrifugación analítica consiste en someter una 
dispersión coloidal o una disolución molecular; a la acción de 
la fuerza centrífuga. 
•Esto se realiza con el fin de causar cambios de 
concentración, los cuales son constantemente medidos a lo 
largo del tiempo por elementos ópticos acoplados a la 
ultracentrífuga. Los elementos ópticos pueden captar 
señales, en forma de absorbancia e interferencia..
Aspectos Prácticos
La absorbancia de la muestra frente a su correspondiente tampón ha de ser menor de 1,3 (unidades de absorción a la 
longitud de onda de trabajo). Es necesario poner en cada celda de la ultracentrífuga el tampón de muestra (que se usa como 
referencia). 
Se recomienda hacer el experimento a varias concentraciones
Volumen de muestra: 300-400 µL. 
Tiempo aproximado del experimento: 2 h. 
Aspectos Prácticos
• La absorbancia de cada muestra en la celda, medida frente a su correspondiente tampón, ha de estar en el intervalo 
de 0.1-0.6 unidades de absorción a la longitud de onda elegida (preferiblemente en un máximo de absorción, en el 
intervalo entre 220 y 600 nm). Es necesario poner en cada celda de medida de la ultracentrífuga el tampón de muestra 
(que se usa como referencia). 
• La medida de la absorbancia se suele realizar en un espectrofotómetro con una cubeta de paso óptico de 1 cm. Para 
correlacionar esta medida con la señal que se detectará en las celdas de la ultracentrífuga debe tenerse en cuenta el 
paso óptico de dichas celdas. A) Las piezas centrales que se emplean más habitualmente tienen un paso óptico de 1.2 
cm. En este caso, una absorbancia de 1.0 en el espectrofotómetro daría 1.2 en la ultracentrífuga. 
B) Si las muestras dan una absorbancia superior a 0.6 pueden emplearse celdas de paso óptico de 0.3 cm (donde una 
absorción de 1.0, medida espectrofotométricamente, daría una señal en la ultracentrífuga de 0.3
• Se recomienda hacer el experimento a varias concentraciones de muestra (al menos tres) y a varias velocidades 
angulares (al menos dos). 
• Volumen de muestra: normalmente 80 µL, aunque puede ser de 60-120 µL (a mayor volumen mayor precisión en el
análisis, pero a costa de que el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio de sedimentación aumenta
considerablemente).
• Tiempo aproximado del experimento: 15-24 h (80 µL). Muestras lábiles: se pueden reducir estos tiempos usando 
procedimientos experimentales específicos. 
Aplicaciones
• Determinación del peso molecular de las especies 
macromoleculares que sedimentan
• Obtención del grado de homogeneidad o 
heterogeneidad de las especies macromoleculares 
que sedimentan. 
• Detección y cuantificación de la estequiometria y 
la afinidad de complejos macromoleculares. 
• Estimación de la forma aproximada de 
macromoléculas en disolución. 
• Separación de proteínas y ácidos nucleicos (ADN)
Bibliografía
•Seymour, R., & Carraher, C. (2002). Introducción a la química de los polímeros. Barcelona, 
España: Reverté.
•Billyemer, F. (2004). Ciencia de lospolímeros. Barcelona, España: Reverté.
•MÉTODOS DE ULTRACENTRIFUGACIÓN ANALÍTICA EN EL CIB: Consideraciones generales y 
aspectos prácticos.. (s.f.). Recuperado 29 agosto, 2019, de 
https://www.cib.csic.es/sites/default/files/inline-files/UCA-CIB.13oct2005.pdf
https://www.cib.csic.es/sites/default/files/inline-files/UCA-CIB.13oct2005.pdf
	Diapositiva 1: Ultracentrifugación
	Diapositiva 2: Introducción 
	Diapositiva 3
	Diapositiva 4: Un poco de Historia…..
	Diapositiva 5: ¿Qué es?
	Diapositiva 6: Técnicas Experimentales
	Diapositiva 7: Ultracentrífuga 
	Diapositiva 8: Velocidad de Sedimentación
	Diapositiva 9: Equilibrio de Sedimentación
	Diapositiva 10
	Diapositiva 11: Determinación del Peso Molecular
	Diapositiva 12: Peso Molecular Promedio en Peso (Mw)
	Diapositiva 13: Peso Molecular Promedio Centrifugal (Mz) 
	Diapositiva 14: Ultracentrifugación Analítica
	Diapositiva 15: Aspectos Prácticos
	Diapositiva 16: Aspectos Prácticos
	Diapositiva 17
	Diapositiva 18: Aplicaciones
	Diapositiva 19: Bibliografía