BOU2_ASIG_JEMP

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Universidad Abierta y a Distancia de 
México 
División de Ciencias de la Salud, Biológicas y 
Ambientales 
Ingeniería en Biotecnología 
 
Operaciones Unitarias II 
 
Asignación a cargo del 
Docente en línea 
 
 
Jessica Verónica Mendoza Prado 
ES202104539 
Grupo BI-BOU2-2301-B1-002 
 
 
 
29 de marzo de 2022 
 
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índice 
Introducción ................................................................................................................................................ 2 
Materiales y métodos ................................................................................................................................. 2 
Columna de exclusión molecular ............................................................................................................ 3 
Electroforesis .......................................................................................................................................... 3 
Análisis de restricción ............................................................................................................................. 3 
Resultados .................................................................................................................................................. 3 
Calidad del ADN ...................................................................................................................................... 3 
Discusión ..................................................................................................................................................... 4 
Conclusión personal .................................................................................................................................... 4 
Referencias ................................................................................................................................................. 4 
 
Introducción 
Los autores nos presentan un contexto general sobre la dificultad que representa la extracción 
de ADN de plantas de Coffea spp., dada la presencia de componentes diversos altamente 
oxidativos. Hacen mención de compuestos como polifenoles, clorofilas y taninos que se 
encuentran normalmente a altas concentraciones al interior de vacuolas, pero que durante la 
homogenización celular se ven expuestos, causando oxidación del ADN. A pesar del uso de 
agentes antioxidantes como PVP, PVPP y DIECA, existe aun considerable daño al material, por 
lo que reconocen la necesidad de una alternativa para la extracción y mencionan su propuesta 
que es la cromatografía de exclusión molecular. 
Materiales y métodos 
• Hojas frescas de Coffea arabica y Coffea canephora 
• Buffer de extracción (Tris-EDTA, NaCl, SDS y PVP) 
• Cloruro de sodio (NaCl) 
• Etanol absoluto y etanol al 70% 
• Solución de lisozima 
• Solución de RNAasa 
• Fenol cloroformo isoamil alcohol (25:24:1) 
• Buffer TE (Tris-EDTA) 
• Columna de cromatografía de exclusión molecular (Sephacryl S-100 HR) 
• Solución de lavado (Tris-EDTA) 
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• Solución de elución (Tris-EDTA) 
• Agua estéril 
Además, se utilizaron equipos y materiales de laboratorio comunes como centrífugas, pipetas, 
microtubos, termociclador, espectrofotómetro, entre otros. 
Los autores tomaron muestra de hojas jóvenes del segundo par de ramas de planas de 1 año de 
las plantas ya mencionadas. Se pulverizaron las hojas en presencia de nitrógeno liquido y se 
añadieron 60 mg de PVPP y 90 mg de DIECA por cada gramo de hoja. Se añadió buffer y se 
agito para incubarse. Se utilizo fenol para extraer la muestra y se lavó, entre otros procedimientos 
de extracción. 
Columna de exclusión molecular 
Se empaco la muestra en la columna 600 uL y se corrió a flujo de 1 ml min^-1 y se recolectaron 
23 fracciones en total. Fueron evaluadas entonces por espectrofotometría y se determinó la 
relación A260-260 de cada una. Se reunieron aquellas que no revelaron presencia de ARN y con 
una relación A260/280 mayor a 1.8. 
Electroforesis 
Se realizo electroforesis y las bandas se visualizaron en un transiluminador. Se realizo 
nuevamente un análisis por espectrofotometría y se determinaron absorbancias a A260 y A280. 
Análisis de restricción 
Se uso la enzima EcoRI según un protocolo, nuevamente se analizo la muestra por electroforesis. 
Finalmente se determinó la concentración de ADN con una electroforesis horizontal. 
Resultados 
Encontraron 320 ug de ADN por gramo de tejido, de buena integridad, pero con baja pureza por 
los productos fenólicos, pigmentos y proteínas no eliminadas durante la extracción. 
Calidad del ADN 
• Encontraron que el ADN eluyo desde la tercera hasta la séptima fracción de la 
electroforesis, catalogado en un grupo A, con calidad por la relación A260/280 como muy 
biena. 
• El grupo b iba de las fracciones 8 a 13, con ARN degrado a pesar de contener ADN integro 
y de buena calidad. 
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• Finalmente, el grupo C iba de las fracciones 14 a 18, con una relación A260/280 baja, 
deformidad de la curva de espectro. La electroforesis demostró ausencia de ácidos 
nucleicos, pero presencia de otras moléculas. 
Discusión 
 En la discusión, los autores discuten los resultados de su estudio en relación con otros métodos 
de purificación de ADN. Señalan que la técnica de cromatografía de exclusión molecular es una 
alternativa efectiva y conveniente a otros métodos de purificación de ADN, y que puede ser 
especialmente útil para muestras de plantas de Coffea sp. que contienen compuestos que 
pueden interferir con otros métodos de purificación de ADN. También discuten algunas 
limitaciones potenciales de la técnica, como el costo y la necesidad de equipo especializado. En 
general, los autores concluyen que la técnica de cromatografía de exclusión molecular es una 
opción viable y efectiva para la purificación de ADN en muestras de plantas de Coffea sp. 
Además, el artículo describe en detalle el protocolo utilizado para la extracción y purificación de 
ADN mediante la técnica de SEC, lo que puede ser útil para otros investigadores que trabajan 
con plantas de café u otras especies vegetales. 
 Conclusión personal 
Los autores hacen abordaje de un problema biotecnológico: la necesidad de obtener ADN 
purificado de mayor calidad que permita hacer los análisis necesario y presentar soluciones a las 
problemáticas particulares de la especie. La obtención de ADN de alta calidad y buena pureza 
en especies de Coffea spp. Había sido un reto hasta el momento, dada la presencia de diversas 
moléculas que pueden oxidar el ADN y degradarlo. 
Los autores nos proponen entonces una forma inteligente y creativa de obtener el material 
necesario sin comprometer su calidad, demostrando su conocimiento sobre el tema. Es un 
artículo que lleva a pensar que problemas existen en nuestro entorno que, con un enfoque 
creativo, podrían ser solucionados prontamente. 
Es un articulo formativo por instruir en la realización de la técnica pero también motivacional, 
llevando a considerar nuevos abordajes para problemas clásicos. 
 Referencias 
 Serrano-Mislata, A., Crespo-Pérez, V., Moreno, V., & Torres, M. (2014). Aplicación de una técnica 
de cromatografía de exclusión molecular para la purificación de ADN en plantas de Coffea sp. 
Revista de la Facultad de Agronomía, 31(1), 59-66.