Bitácora práctica 8 biotec forense

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Práctica 7: Extracción y purificación de Ácido Desoxirribonucleico de 
eritrocitos de pollo. 
Fecha: 06 de noviembre de 2021. 
OBJETIVO 
Desarrollar las habilidades de la extracción y purificación de DNA en eritrocitos de 
pollo. 
INVESTIGACIÓN PREVIA 
Para el estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones y especias, 
para explicar patrones y procesos ecológicos y evolutivos, se puede abordar 
mediante marcadores moleculares, segmentos de ADN que tienen o no una función 
conocida, lo cual nos proporciona información sobre la variación alélica y permiten 
distinguir individuos. Este tipo de marcadores se pueden obtener a través de 
técnicas como la PCR y secuenciación. 
La aplicación de técnicas moleculares inicia con la extracción de ADN, pero que los 
datos obtenidos sean confiables y reproducibles, depende, en gran medida, de la 
extracción de ADN íntegro y puro. 
La extracción de ADN consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN 
y se basa en características fisicoquímicas de la molécula. 
Los grupos fosfato presentes en el ADN son polares y están cargados 
negativamente, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa y lo hace 
altamente polar, lo cual es aprovechado para poder extraerlo. Estos grupos tienen 
una fuerte tendencia a repelerse por su carga, lo que hace que se pueda disolver al 
ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. 
En presencia de etanol, esta capa se rompe y se exponen los grupos fosfato, lo 
cual, favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas 
entre las cadenas de nucleótidos permitiendo así que el ADN precipite. 
La selección del método de extracción es un paso fundamental en las técnicas 
moleculares, y depende del organismo bajo estudio, el tejido disponible y su estado 
de conservación, la técnica que se aplicará posteriormente, así como la 
infraestructura de los laboratorios, los recursos económicos y tiempo para obtener 
resultados. 
Protocolos de extracción tradicional y comercial. 
Colecta de la muestra. 
La colecta de la muestra y su manejo adecuados son indispensables para una 
extracción de ADN exitosa, debido a que, si se lleva adecuadamente, se puede 
obtener ADN integro y sin contaminantes, los cuales afectan la acción de las 
enzimas durante la reacción de PCR. 
Homogeneización del tejido. 
La homogeneización, mecánica o química, consiste en romper las uniones entre las 
células para facilitar la interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar 
el material genético. 
La homogeneización mecánica incluye el uso de: 
- Nitrógeno líquido: Se macera la muestra con nitrógeno líquido, en un mortero 
de porcelana, hasta obtener un polvo muy fino. El nitrógeno líquido congela 
de inmediato la muestra y evita que se formen cristales en el interior de la 
célula que rompen la estructura celular e inicie el proceso de degradación. 
- Pistilos u homogeneizadores: Los pistilos disgregan la muestra mediante 
fricción con la pared del tubo que contiene la muestra. Es recomendable 
adicionar un poco del buffer de lisis antes de iniciar, estas soluciones 
desnaturalizan a las proteínas y mantienen estable al ADN. Cuando se 
utilizan dispositivos es necesario colocar el tubo sobre una cama de hielo, lo 
cual evita que el ADN se fragmente por el calor que genera la fricción. 
- Homogeneización química: La muestra se mantiene en solución a altas 
temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y agentes caotrópicos 
que rompen las uniones entre las células o que incluso pueden perforar la 
membrana celular. 
- Lisis celular: Las interacciones entre las moléculas que conforman la pared, 
la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los 
ácidos nucleicos se liberen. Se utilizan soluciones básicas, detergentes o 
agentes caotrópicos que permiten disolver la membrana, así como 
inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el ADN. 
Protocolo tradicional. 
Separación de proteínas y lípidos. 
Se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solvente orgánicos y ciclos de 
centrifugación. La fase acuosa y la orgánica se separan por centrifugación lo que 
permite aislar al ADN. 
Precipitación del ADN. 
Una vez que se ha eliminado el etanol, el siguiente paso es hidratar el ADN para 
mantenerlo en solución. 
Protocolo comercial. 
- Unión del ADN a la matriz inorgánica y lavado. 
- Recuperación del ADN de la matriz. 
 
 
Métodos de análisis 
Cuantificación del ADN. 
Es importante determinar el rendimiento mediante espectrofotometría. Una 
característica del ADN es que absorbe la luz UV a 260 nm y permite estimar su 
concentración. 
Para estimar la pureza del ADN se considera la proporción de la absorbancia a 260 
nm y 280 nm. Una proporción de 1.8 es aceptada como ADN puro, proporciones 
menores indican la presencia de proteínas. 
Comprobación de la integridad del ADN por electroforesis. 
La integridad del ADN se puede observar mediante electroforesis en gel de agarosa. 
Si el ADN está íntegro, se debe observar una banda estrecha cercana al pozo en 
que se colocó la mezcla de ADN. 
Almacenamiento del ADN. 
Una parte se puede almacenar a 4°C para los análisis inmediatos y el material 
restante a -20°C o -80°C, para una conservación por varios meses. 
(Cornejo, et. al., 2014) 
METODOLOGÍA 
 
 
CUESTIONARIO 
1. Explique qué sucede en cada uno de los pasos de esta técnica. 
- Se debe obtener la sangre con heparina debido a que la sangre de pollo 
coagula sumamente rápido, por lo que la heparina, al ser un anticoagulante, 
nos ayuda a evitar que esto suceda. Así mismo, se debe utilizar una solución 
isotónica de NaCl debido a que sirve para preservar células cuando se 
realizan los lavados, ya que no modifica la estructura de las células. 
- Se centrifuga y se lava la muestra con solución isotónica debido a que de 
esta forma quitamos todo el contenido del plasma a los eritrocitos para poder 
quedarnos con el paquete globular. 
- La solución de saponina se usa para romper la membrana y preservar los 
núcleos, esto debido a que la saponina es un tensoactivo leve que tiene la 
capacidad de romper la membrana celular debido a que esta tiene más 
fosfolípidos lo que la hace más sensible a los tensoactivos, pero, la saponina 
no tiene la capacidad de romper la membrana nuclear. 
- Se realiza en hielo y se agita por 30 minutos por que así se puede romper la 
membrana del eritrocito, se realiza en baño de hielo debido a que lo que se 
busca es evitar la actividad de las enzimas como la ADNasa y ribonucleasas 
que puedan dañar el ADN y bajar la cantidad que se pueda obtener, es decir, 
el baño de hielo sirve para evitar la actividad enzimática. 
- Los lavados y la centrifugación se vuelven a realizar para poder obtener el 
sobrenadante transparente en donde se van a tener los núcleos. 
- El SDS es un tensoactivo más fuerte, el cual sirve para desestabilizar la 
membrana nuclear, haciendo que se rompan los núcleos y salga el ADN. 
- Se utiliza NaCl 5M debido a que en el plasma tenemos proteínas disueltas, 
si se le agrega la sal, las proteínas se precipitan debido a que el agua pierde 
afinidad con la proteína generando así uniones con la sal para disolverla. Al 
precipitar las proteínas, sin ser desnaturalizadas, se pueden aislar y purificar 
para después redisolverlas en solución salina. Todo este proceso es 
conocido como salting in (se añade la sal), salting out (se quita la sal). Las 
proteínas que precipitan son las histonas, en donde el ADN se encuentra 
enroscado en estas. 
- Se agrega la solución Sevag (alcohol isoamílico con cloroformo) para poder 
quitar también los lípidos de la membrana nuclear, generando así que todo 
lo liposoluble se vaya con el cloroformo y lo hidrosoluble con las proteínas 
precipitadas en la solución acuosa con el alcohol isoamílico 
- Se vuelve a centrifugar parapoder deshacernos de todo lo que no nos 
interesa para que el ADN esté lo más libre posible. 
- Se toma la fase acuosa y se repite la adición de la sal y la solución de Sevag 
para poder eliminar lo más posible las proteínas. 
- Se ocupa EtOH frío en la fase acuosa para poder precipitar el ADN. 
- Se determina la absorbancia para poder determinar la pureza del ADN 
extraído. 
 
2. De acuerdo a las lecturas a 260 y 280 nm diga usted si el DNA obtenido 
es puro. 
Las lecturas a estas longitudes de onda se realizan justamente para determinar si 
el ADN es puro, de esta forma, para poder determinar que si lo es, se debe tener 
una proporción aceptable como 1:8, debido a que un valor menor indicia la 
presencia de proteínas. Una segunda valoración de la pureza de ácidos nucleicos 
es la proporción 260/230, los valores aceptados se encuentran en el rango de 2.0 a 
2.2, si la relación es menor, indica la presencia de contaminantes como 
carbohidratos o fenol. 
(Cornejo, et. al., 2014) 
 
3. Explique cómo se puede cuantificar el DNA 
El ADN se puede cuantificar mediante la lectura espectrofotométrica, esto, debido 
a que el ADN tiene como parte de sus características que es capaz de absorber la 
luz UV a 260 nm y permite estimar su concentración mediante espectrofotometría. 
Se debe considerar el factor de dilución para obtener la concentración en ng/µL. 
(Cornejo, et. al., 2014) 
 
 
REFERENCIAS 
Cornejo, A., et. al. (2014). Herramientas moleculares aplicadas en ecología: 
Aspectos teóricos y prácticos. Consultados el 04 de noviembre de 2021. 
Recuperado de: https://www.researchgate.net/profile/Alejandra-Vazquez-
Lobo/publication/280731680_Microsatelites/links/55c3903008aeca747d5fa98f/Micr
osatelites.pdf#page=17 
https://www.researchgate.net/profile/Alejandra-Vazquez-Lobo/publication/280731680_Microsatelites/links/55c3903008aeca747d5fa98f/Microsatelites.pdf#page=17
https://www.researchgate.net/profile/Alejandra-Vazquez-Lobo/publication/280731680_Microsatelites/links/55c3903008aeca747d5fa98f/Microsatelites.pdf#page=17
https://www.researchgate.net/profile/Alejandra-Vazquez-Lobo/publication/280731680_Microsatelites/links/55c3903008aeca747d5fa98f/Microsatelites.pdf#page=17