Microscopía de Campo Oscuro y de Contraste de Fases.

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Dayra Elizabeth Hernández Bautista
Microscopía de Campo Oscuro y de Contraste de Fases.
Campo Oscuro.
La microscopia de campo oscuro es una técnica de contraste donde solo la luz difractada desde el espécimen se usa para formar la imagen. El espécimen aparece brillante contra un fondo oscuro. Es una modificación al sistema de campo claro, que consiste en bloquear los rayos centrales que alcanzan al condensador, por medio de un disco o algún otro tipo de dispositivo, de manera tal que el cono iluminador es un cono hueco de luz, con mayor apertura numérica que la del objetivo. Esta forma de iluminación permite que sólo aquellos rayos que han sido desviados por la muestra observada, sean captados por el objetivo. Es decir, la imagen microscópica está formada en este caso sólo por rayos difractados y constituye un sistema cuyo funcionamiento se basa en el fenómeno de Tyndall.
Aplicaciones
En microscopía de campo oscuro, el contraste se crea por un espécimen brillante sobre fondo oscuro. Esta es ideal para revelar contornos, bordes, fronteras y gradientes de índice de refracción, pero no brinda mucha información sobre la estructura interna. Los objetos ideales incluyen células vivas sin tinción (donde el campo oscuro brinda información no visible con otras técnicas), aunque también se pueden observar exitosamente células fijas teñidas. Las imágenes de campo oscuro son particularmente útiles en hematología para examinar sangre fresca. Los especímenes no biológicos incluyen minerales, cristales químicos, partículas coloidales, inclusiones y porosidad en vidrio, cerámicas, y secciones delgadas de polímeros.
Características
La composición del microscopio de campo oscuro presenta modificaciones importantes con respecto al de campo claro, pues los fundamentos de ambas microscopías son opuestos.
Mientras que en el campo claro se concentran los rayos de luz para que estos atraviesen la muestra de forma directa, en el campo oscuro se dispersan los haces con el fin de que solo los haces oblicuos lleguen a la muestra. Estos son luego dispersados por la misma muestra, transmitiendo la imagen hacia el objetivo.
Si se tratara de enfocar una lámina sin muestra se observaría un círculo oscuro, ya que sin muestra no hay nada que disperse la luz hacia el objetivo. Para obtener el efecto deseado en el campo visual se necesita del uso de condensadores específicos, así como de diafragmas que ayuden a controlar los haces de luz.
En un campo visual de campo oscuro los elementos o partículas en suspensión se ven brillantes y refringentes mientras que el resto del campo es oscuro, haciendo un contraste perfecto.
Si se utiliza luz oblicua o incidente se obtiene un efecto de bordes con alto relieve en las estructuras observadas.
Partes del Microscopio de Campo Oscuro.
· Sistema mecánico.
· Tubo. Es el dispositivo por donde viaja la imagen reflejada y aumentada por el objetivo hasta llegar al ocular u oculares.
· Revólver. Es el soporte donde se ubican los distintos objetivos. 
· Tornillo macro. Este tornillo es utilizado para enfocar la muestra, se mueve hacia adelante o hacia atrás para acercar o alejar la muestra del objetivo.
· Tornillo micrométrico. Se utiliza para movimientos muy finos o delicados, casi imperceptibles. Es el que logra el enfoque definitivo.
· Platina. Es el soporte donde reposará el espécimen sobre el portaobjetos. Posee una abertura central por donde pasan los haces de luz. 
· El carro. Permite que se pueda recorrer con el objetivo toda la muestra. 
· Pinzas sujetadoras. Sujetan el portaobjeto para evitar que esta se ruede durante su observación. 
· Brazo o asa. Es el lugar por donde debe agarrarse el microscopio cuando se va a trasladar de un lado a otro. 
· Base o pie. Como su nombre lo indica es la base o soporte del microscopio. 
· Sistema óptico.
· Objetivos. Tienen forma cilíndrica. Los objetivos pueden ser de diversos aumentos. Ejemplo: 4,5X (lupa), 10X, 40X y 100X (objetivo de inmersión).
· Oculares. Los microscopios viejos son monoculares, es decir, poseen un solo ocular, y los microscopios modernos son binoculares, es decir, que tienen dos oculares. Los oculares tienen forma cilíndrica y hueca. Estos poseen en su interior lentes convergentes que amplían la imagen virtual creada por el objetivo. El ocular en su parte superior contiene un lente denominado ocular y en su parte inferior alberga un lente llamado colector.
· Sistema de iluminación.
· Lámpara. Es la fuente de iluminación y se ubica en la parte inferior del microscopio. La luz es halógena y es emitida de abajo hacia arriba. 
· Diafragma. El diafragma de los microscopios de campo oscuro carece de iris; en este caso este impide que los rayos que provienen de la lámpara lleguen de forma directa a la muestra, solo los haces oblicuos tocaran el espécimen. Aquellos haces que sean dispersados por las estructuras presentes en la muestra son los que pasarán al objetivo. Esto explica por qué las estructuras se ven brillantes y luminosas en un campo oscuro.
· Condensador. El condensador de un microscopio de campo oscuro difiere del de campo claro. Existen dos tipos: condensadores de refracción y condensadores de reflexión. Este último se divide en dos categorías: los paraboloides y los cardioides.
· Condensadores de refracción. Posee un disco que se interpone para refractar los rayos de luz, puede ubicarse encima del lente frontal o en el lado posterior.
· Condensadores de reflexión. Son los que utilizan los microscopios estereoscopios. Los hay de dos tipos: 
· Paraboloides: Poseen un tipo de curvatura denominada paraboloides. Usado en el estudio de sífilis.
· Cardioides: La curvatura del condensador es de forma similar a un corazón, de allí el nombre que recibe “cardioide”, llevando el condensador el mismo nombre. Posee un diafragma que es regulable.
De Contraste de Fases.
La microscopia de contraste de fases es una técnica óptica que explota los cambios en el índice de refracción para producir imágenes de alto contraste de especímenes transparentes. El microscopio de contraste de fases es un tipo de microscopio que permite observar muestras vivas sin necesidad de usar técnicas de tinción.
El microscopio de contraste de fase permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas.
Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto, estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semi finos no coloreados.
Aplicaciones.
La imagen de contraste de fases es aplicable a varios objetos transparentes, como células vivas en cultivos, macroorganismo, rebanadas delgadas de tejido, patrones litográficos, vibras, dispersiones de látex, fragmentos de vidrio, y partículas subcelulares (incluyendo núcleos y otros organelos) donde la técnica revela estructuras que no son visibles en campo claro. Una ventaja de la microscopia de contraste de fases es que las células vivas pueden ser observadas en detalle sin la necesidad de teñirlas o usar fluoró foros.
Partes del Microscopio de Contraste de Fases.
El sistema mecánico de este tipo de microscopio es equivalente al de un microscopio compuesto convencional. Incluye la base, el brazo, el tubo, la platina, el revólver y los tornillos macrométrico y micrométrico.
El sistema óptico de los microscopios de contraste de fases es similar al de un microscopio convencional, pero incluye tambiénalgunos elementos adicionales. Los elementos básicos son el objetivo, los oculares, el foco de luz, el condensador y el diafragma. Adicionalmente también es necesario un anillo de fase y un filtro. 
La luz que emite el foco de luz es dirigida hacia la muestra con el condensador y regulada con el diafragma. Una vez ha atravesado la muestra la luz llega al objetivo, en el que se produce una primera etapa del aumento. 
A continuación, solo la luz de iluminación experimenta un cambio de fase debido a la presencia de un anillo de fase. Posteriormente el filtro reduce la amplitud o intensidad de esta señal. La luz dispersada por la muestra no se ve afectada por estos dos elementos. Finalmente, la combinación de la luz de iluminación y la luz dispersada llega a los oculares. Las lentes en los oculares representan una segunda etapa de aumento y a través de ellos el observador puede ver la muestra con un contraste variable en función de las fases.
Fuentes de consulta.
· Gil, Marielsa. (3 de julio de 2019). Microscopio de campo oscuro: características, partes, funciones. Lifeder. Recuperado de https://www.lifeder.com/microscopio-campo-oscuro/.
· Tecnicaenlaboratorios.com. n.d. Campo Oscuro. [online] Available at: <http://www.tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_campo_oscuro.htm> [Accessed 15 March 2021].
· Mundo Microscopio. 2021. Microscopio de Contraste de Fases (Características y Funcionamiento). [online] Available at: <https://www.mundomicroscopio.com/microscopio-de-contraste-de-fases/> [Accessed 16 March 2021].
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· Morfoudec.blogspot.com. n.d. Microscopio de Contraste de Fase. [online] Available at: <http://morfoudec.blogspot.com/2008/07/microscopa-de-contraste-de-fase.html> [Accessed 16 March 2021].