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Química Analítica: Cromatografía 1 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno GUÍA DE ESTUDIOS La cromatografía agrupa a un conjunto importante de métodos analíticos que permiten separar, identificar y –en la mayoría de los casos- cuantificar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas. En todas las separaciones cromatográficas la muestra se desplaza con una fase móvil que puede ser un gas ó un líquido. Esta fase móvil pasa a través de una fase estacionaria con la que es inmiscible y que se fija a una columna o superficie sólida. Las dos fases se eligen de manera que los componentes de la muestra tengan distinta afinidad por ambas y por lo tanto se distribuyan de manera diferente entre ambas. Los componentes de la mezcla sólo avanzan por el sistema cromatográfico con la fase móvil. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil. Por el contrario los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad los componentes se separan en bandas o zonas que pueden analizarse cualitativa y cuantitativamente. Los Métodos Cromatográficos se clasifican según distintos criterios: a) En base al estado físico de la fase móvil y la fase estacionaria b) En base a los procesos responsables de la separación c) En base a la forma en que se ponen en contacto ambas fases Teoría General de la Cromatografía: deducción considerando la cromatografía por elución (transporte de una especie a través de la columna por adición continua de fase móvil) Química Analítica: Cromatografía 2 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno Figura 1: Cromatografía de elución en columna Velocidad de migración de los solutos La eficacia de una columna cromatográfica para separar dos solutos depende, en parte, de las velocidades relativas con las que eluyen las dos especies. Esas velocidades están determinadas por las magnitudes de las constantes de equilibrios en función de las cuales las especies se distribuyen entre las fases estacionaria y móvil. Así, el soluto A se distribuye entre ambas fases según: A móvil ↔ A estacionaria La constante de distribución ó coeficiente de distribución: 𝐾 = 𝐶𝑆 𝐶𝑀 (1) Donde Cs: concentración molar del soluto en la fase estacionaria y CM: concentración molar del soluto en la fase móvil Figura 2: Cromatograma. Representación gráfica de la señal cromatográfica en función del tiempo Química Analítica: Cromatografía 3 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno Tiempo muerto (to ó tM): tiempo necesario para que una especie no retenida en la fase estacionaria (puede ser la fase móvil) alcance el detector. La velocidad de migración de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio del movimiento de las moléculas de la fase móvil. Tiempo de retención (tR): tiempo que transcurre desde la inyección de la muestra hasta que el pico de concentración del analito alcanza el detector. La velocidad lineal promedio de migración del soluto es: 𝑉 = 𝑳 𝒕𝑹 (2) La velocidad lineal promedio de migración de las moléculas de la fase móvil es: 𝑈 = 𝑳 𝒕𝟎 (3) Relación entre el tiempo de retención y el coeficiente de distribución V = U x fracción de tiempo que el analito pasa en fase móvil V = U x (moles de soluto en fase móvil/ moles totales de soluto en la columna) NM (moles soluto en fase móvil) = CMx VM y NS(moles de soluto en fase estacionaria) = CSx VS Remplazando: 𝑉 = 𝑼 × 𝑪𝑴 × 𝑽𝑴 𝑪𝑴 × 𝑽𝑴+ 𝑪𝑺 × 𝑽𝑺 = 𝑼 × 𝟏 𝟏+ 𝑪𝑺 × 𝑽𝑺 𝑪𝑴 × 𝑽𝑴 (4) Sustituyendo el coeficiente de partición K: 𝑉 = 𝑼 × 𝟏 𝟏+𝑲 𝑽𝑺 𝑽𝑴 (5) Expresión que relaciona la velocidad de migración del soluto (V) en función de su coeficiente de distribución (K) y de los volúmenes de las fases estacionaria (𝑉𝑆) y móvil (𝑉𝑀). Los dos volúmenes pueden estimarse a partir del procedimiento de preparación de la columna. La Velocidad de Migración del Soluto: El Factor de Retención ó Factor de Capacidad Es un parámetro que se utiliza para describir las velocidades de migración de los solutos en las columnas. Para una especie A, el factor de retención K’A se define como: 𝑲𝑨 ′ = 𝑲𝑨 × 𝑽𝑺 𝑽𝑴 = 𝑪𝑺 × 𝑽𝑺 𝑪𝑴 × 𝑽𝑴 = 𝒎𝑺 𝒎𝑴 (6) El factor de retención es, en resumen, la relación entre la masa de analito en fase estacionaria (mS) y la masa de analito en fase móvil (mM). Remplazando (6) en (5): 𝑉 = 𝑈 × 1 1+𝐾𝐴 ′ (7) Para mostrar como 𝐾𝐴 ′ se puede obtener a partir de un cromatograma remplazamos (2) y (3) en (7): 𝑳 𝒕𝑹 = 𝑳 𝒕𝟎 × 𝟏 𝟏+𝑲𝑨 ′ (8) Química Analítica: Cromatografía 4 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno Reordenando: 𝑡𝑅 = 𝑡𝑀 (1 + K’A) (9) 𝑡𝑅 = 𝑡𝑀 + tM K’A (10) 𝐾𝐴 ′ = 𝒕𝑹 − 𝒕𝑴 𝒕𝑴 (11) A partir de un cromatograma se puede obtener fácilmente tR y tM Cuando K’A <<<1 la especie eluye tan rápido que es difícil determinar con exactitud los tiempos de retención. No proporciona resolución adecuada para solutos de menor tR. Cuando K’A> 20 ó 30 los tiempos de elución son excesivamente largos. Se desperdicia tiempo analítico valioso. Idealmente las separaciones se realizan para 2 ≤ K’A ≤ 10 Si consideramos el caudal de la fase móvil F (mL/min): 𝑭 × 𝒕𝑹 = 𝑽𝑹 (12) Remplazando (12) en (9): 𝑽𝑹(𝑨) = 𝑽𝑴 (𝟏 + 𝑲𝑨 ′ ) (13) Remplazando (6) en (13): 𝑽𝑹(𝑨) = 𝑽𝑴 (𝟏 + 𝑲 𝑽𝑺 𝑽𝑴 ) (14) 𝑽𝑹(𝑨) ′ = 𝑽𝑹 𝑨 − 𝑽𝑴 = 𝑲 × 𝑽𝑺 (15) Dividiendo por F: 𝒕𝑹(𝑨) ′ = 𝒕𝑹 𝑨 − 𝒕𝑴 = 𝑲 × 𝑽𝑺 (16) El coeficiente de partición K determina la separación y el volumen de fase estacionaria VS es característico de la columna. Los parámetros corregidos ó ajustados 𝑽𝑹(𝑨) ′ y 𝒕𝑹(𝑨) ′ se utilizan para identificar a los solutos. Son parámetros cualitativos. Si bien VR y tR también lo son pero dependen de tM y de VM. Velocidades de Migración Relativas: el Factor de selectividad, Retención Relativa ó Coeficiente de Separación El factor de selectividad α de una columna para dos especies A y B se define como: 𝜶 = 𝑲𝑩 𝑲𝑨 (17) Donde KB es el coeficiente de distribución para la especie más fuertemente retenida (mayor tR) y KA es el coeficiente de distribución de la especie más débilmente retenida. De esta manera α > 1. Sustituyendo el coeficiente de distribución (K) en función del factor de retención (K’), despejando de (6): ∝ = 𝑲𝑩 ′ (𝑽𝑴 𝑽𝑺 ) 𝑲𝑨 ′ (𝑽𝑴 𝑽𝑺) ∝ = 𝑲𝑩 ′ 𝑲𝑨 ′ (18) Remplazando los factores de retención (K’) en función de los tiempos de retención (9): ∝= 𝒕𝑹 𝑩 − 𝒕𝑴 𝒕𝑹 𝑨 − 𝒕𝑴 (19) Remplazando por los parámetros corregidos ó ajustados: t’R = tR - tM: ∝= 𝒕𝑹(𝑩) ′ 𝒕𝑹(𝑨) ′ (20) En resumen: α = 𝒕𝑹𝒊 ′ 𝒕𝑹𝒔 ′ = 𝑽𝑹𝒊 ′ 𝑽𝑹𝒔′ = 𝑲𝒊 ′ 𝑲𝑺 ′ Índice para la identificación de un compuesto i conociendo el tiempo de retención del estándar S en la misma columna (fase estacionaria) y con la misma programación de temperaturas, dado que al ser un parámetro relativo es Química Analítica: Cromatografía 5 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno en gran parte independiente de las variables de la columna, excepto la temperatura y la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil. Forma de los Picos Cromatográficos La forma gaussiana de una banda cromatográfica ideal se puede atribuir a la combinación aditiva de los movimientos aleatorios de las numerosas moléculas de soluto en la banda cromatográfica. Recordemos que la partícula eluye solamente mientras reside en la fase móvil. Cada molécula individual de soluto, durante la migración experimenta miles de transferencias entre la fase móvil y la fase estacionaria. Ciertas partículas se desplazan con rapidez en virtud de su inclusión accidental en la fase móvil la mayor parte del tiempo. Otras pueden retrasarse debido a que casualmente se han incorporado a la fase estacionaria durante un tiempo mayor que el promedio. La consecuencia de estos procesos individuales aleatorios es una dispersión simétrica de las velocidades alrededor del valor medio. La anchura de la banda aumenta a medida que se mueve a través de la columna, debido a que se dispone de más tiempo para que la dispersión tenga lugar. Es por eso que la anchura de la banda está relacionada directamente con el tiempo de permanencia en la columna e inversamente con la velocidad de la fase móvil. Eficiencia de la Columnas Cromatográficas A semejanza de lo que ocurre en las columnas de destilación fraccionada, para cuantificar la eficacia de una columna cromatográfica se definen dos parámetros a) El número de platos teóricos (N) y b) La altura equivalente plato teórico (H ó HEPT), entendiéndose por plato teórico a la porción de la columna de la cual emergen ambas fases en equilibrio. En la cromatografía es la porción de columna en que se alcanza el equilibrio dinámico entre la concentración del analito en la fase móvil y su concentración en la fase estacionaria. Ambos parámetros se relacionan a través de la longitud L (cm) de la columna según: 𝑵 = 𝑳 𝑯 (21) La eficacia de la columna para un determinado soluto aumenta cuando mayor es N y cuando menor es H. la eficacia varía según el tipo de columna, de fase móvil y de fase estacionaria. En realidad se trata de un pseudo- equilibrio, dado que la fase móvil está desplazándose continuamente. Definición de Altura de Plato La anchura de la curva gaussiana esta relacionada con la varianza (𝜎2) ó con la desviación estándar (𝜎) de una medida. Dado que los picos cromatográficos tienen forma gaussiana, definiremos la eficacia de la columna y por lo tanto la altura de plato H como: 𝑯 = 𝝈𝟐 𝑳 (22) En la siguiente figura vemos el pico del analito cuando la banda emerge del extremo final de la columna y la ubicación de L ± 𝜎 que abarca el 68% de área total. H tendrá unidades de longitud y contendrá tal como se ha definido un 34% del analito. Figura 3: Definición de altura de plato Química Analítica: Cromatografía 6 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno Evaluación experimental de H y N Dado que en un cromatograma se grafica la señal del detector en función del tiempo, se define una varianza en unidades de tiempo, τ2 [s2] para distinguirlo de σ2 [cm2]. Figura 4: Determinación de la desviación estándar de un pico cromatográfico Ambas deviaciones se relacionan por: 𝝉 = 𝝈 𝑳 𝒕𝑹 (23) Donde L/tR es la velocidad lineal promedio de la especie [cm/s]. Trazando las tangentes en los puntos de inflexión a ambos lados del pico cromatográfico y uniendo con la prolongación de la línea de base del cromatograma se forma un triángulo que abarca aproximadamente el 96% del área bajo el pico, equivalente al intervalo comprendido entre tR ± 2σ. En la gráfica corresponde a tR ± 2τ y por lo tanto el ancho del pico en la base será: W = 4 τ (24). Reemplazando en (23): 𝑾 𝟒 = 𝝈 𝒕𝑹 𝑳 → 𝝈 = 𝑳𝑾 𝟒𝒕𝑹 (24) Reemplazando en (22): 𝑯 = 𝝈𝟐 𝑳 = 𝑳𝟐𝑾𝟐 𝑳 𝟏𝟔 𝒕𝑹 𝟐 = 𝑳 𝟏𝟔 𝑾 𝒕𝑹 𝟐 (25) Reemplazando en (21): 𝑵 = 𝑳 𝑯 = 𝟏𝟔 𝒕𝑹 𝑾 𝟐 (26) Cuanto Mayor es N y menor es H más eficiente es una columna para un soluto dado. Influencia del Caudal de la Fase Móvil en la Eficiencia de la Columna La ecuación de Van Deemter relaciona la altura de plato H con la velocidad de flujo de la fase móvil U: 𝑯 = 𝑨 + 𝑩 𝑼 + 𝑪𝑼 (27) A: Factor de Difusión turbulenta. Es independiente de U. Es efecto de los caminos múltiples que toman las partículas para recorrer la columna. Depende del tamaño de partícula y lo compacto del empaque de la fase estacionaria y de la geometría de las partículas. A = 0 para columnas capilares (no tienen relleno). B: Factor de Difusión longitudinal. Disminuye al aumentar U (da menos tiempo para que ocurra la difusión) C: Factor de Transferencia de materia entre ambas fases. Directamente proporcional a U. A medida que aumenta la velocidad de la fase móvil no alcanza el tiempo para que se establezca el equilibrio en la transferencia de materia y por lo tanto aumenta H. La curva presenta un mínimo que representa la velocidad óptima de la fase móvil para tener el valor mínimo de H. En la práctica se utiliza U ≈ 2Uoptimo con lo cual no aumenta tanto el tiempo de análisis sin que haya un incremento sustancial de la altura de plato H. Química Analítica: Cromatografía 7 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno Figura 5: Ecuación de Van Deemter Resolución de Columnas Cromatográficas La resolución R de una columna constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos. Expresión para su cálculo en función de parámetros del cromatograma (t’R y el ancho del pico en la base: W) R = 2 (t2 – t1)/ (W1+W2) Figura 6: Resolución cromatográfica Química Analítica: Cromatografía 8 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno Una resolución de 1,5 permite una separación esencialmente completa de los dos componentes. Para una fase estacionaria dada la resolución puede mejorarse alargando la columna, con lo cual aumentará el número de platos N pero una consecuencia negativa de esto es el incremento del tiempo requerido para la separación. Análisis Cuantitativo Como la señal es proporcional a la concentración del analito, el área A bajo el pico y V = t . F: 𝑨 = 𝒌 𝑪𝒎 𝝏𝒕 = 𝒌 𝑭 𝑪𝒎 𝝏𝑽 = 𝒌 𝑭 𝒘 𝑽 𝝏𝑽 = 𝒌 𝑭 𝑾 (26) Por lo tanto el área bajo la curva es proporcional a la masa de soluto. Se la determina a) Por integración electrónica b) por triangulación y c) recortando y pesando los picos. También se pueden utilizar las alturas de los picos cuando estos son todos muy estrechos. Métodos de AnálisisCuantitativo 1) Calibración con patrones externos: puede conducir a error sobre todo por variaciones en el volumen de muestra inyectada que varía de 1 a 10 μL 2) Método del Patrón Interno: evita las incertidumbres asociadas a la inyección de la muestra. En cada estándar y la muestra se introduce una cantidad exactamente medida de patrón interno. Se grafica la relación de las áreas del analito a la del patrón interno. Es necesario que el pico del patrón interno esté bien resuelto respecto de los de los otros componentes presentes y el pico del patrón debe estar cerca del pico del analito. 3) Método de Normalización de Áreas La suma de las áreas de todos los solutos presentes representa el 100%. La concentración del analito se calcula por la relación de su área con el área total de los picos. Es de aplicación limitada, pues deben eluir todos los componentes de la muestra. Química Analítica: Cromatografía 9 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno Cromatografía Gaseosa Figura 7: Esquema de un cromatógrafo de gases La muestra a analizar por cromatografía gaseosa debe ser volátil ó debe poder ser transformada (derivatización) en un producto volátil. Gas Portador: debe ser químicamente inerte. Se utiliza He, N2 ó H2 dependiendo del detector. Con el suministro de gas se encuentran asociados los reguladores de presión, manómetros y medidores de caudal. La presión de entrada oscila entre 10 a 50 psi (por encima de la atmosférica), lo que da lugar a caudales de 25 a 150 mL/min en columnas rellenas y 1 a 25 mL/min en las capilares. Este caudal se determina con un medidor de pompas de jabón colocado al final de la columna. Se presiona la pera de goma que contiene una solución de jabón ó detergente y se mide con un cronómetro el tiempo que tarda una película de jabón para desplazarse entre dos divisiones de la bureta. Inyector: la muestra debe ser introducida como un tapón de vapor. La inyección lenta de muestras grandes provoca ensanchamiento de bandas y resolución pobre. Se utilizan microjeríngas que se introducen a través de un septum de goma de silicona en una cámara de vaporización situada en la cabeza de la columna y cuya temperatura está a unos 50°C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la mezcla. Figura 8: Esquema del Inyector Química Analítica: Cromatografía 10 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno Columnas Rellenas y Capilares Figura 9: Esquema de la sección transversal de una columna rellena y una columna empacada Inicialmente se utilizaron columnas empacadas. Actualmente, y para la mayor parte de las aplicaciones de la cromatografía gaseosa, se prefiere utilizar columnas capilares que permiten obtener una resolución muy elevada. Fases estacionarias polares y no polares (principio de “lo semejante disuelve a lo semejante”) La decisión más importante en la fijación de los parámetros para un análisis por cromatografía gaseosa, es la selección de la mejor columna o fase estacionaria. La otra decisión importante es la selección de la temperatura de la columna, pero esto es menos crítico debido a la amplia posibilidad de programaciones que se pueden ensayar. En la selección de una fase estacionaria se pueden seguir algunos de los siguientes criterios: 1) Información previa acerca de la separación requerida: Las referencias en la literatura y las notas de aplicación son fuente de este tipo de información. Si se encuentran otras columnas disponibles en el laboratorio, evaluar los resultados al utilizarlas. 2) Selectividad: Determinar el tipo de interacción potencial entre el compuesto y la fase estacionaria (dispersión, dipolar, enlaces de hidrógeno). Si los compuestos tienen diferentes dipolos o pueden formar puentes de hidrógeno, considerar una fase estacionaria selectiva con esas características. 3) Polaridad: Utilizar la fase estacionaria más no-polar que provea las separaciones requeridas. 4) Límites de temperatura: Compuestos con altos punto de ebullición o pesos moleculares elevados requieren altas temperaturas de columna para evitar tiempos de retención extremadamente largos. Los límites de temperatura menores para las fases estacionarias polares, restringen su uso a compuestos con bajo o medio punto de ebullición (como aproximación a su volatilidad). 5) Actividad de cada compuesto: Las columnas con fases estacionarias no polares generalmente son las más inertes. Con fases polares se pueden experimentar “tailings” importantes en los picos o adsorción. 6) Tiempo de análisis: Algunas fases estacionarias dan separaciones satisfactorias en menos tiempo de corrida. 7) Capacidad: Las fases estacionarias similares en polaridad a los compuestos a separar, tienen mayor capacidad para esos compuestos. 8) Sangrado: En general, las fases estacionarias no polares tienen menos sangrado. Compuestos con elevados PE ó PM eluyen en zonas de alta temperatura donde el sangrado de la columna es más severo. Fases estacionarias no polares no sólo tienen menos sangrado, sino que además el máximo de sangrado ocurre a mayores temperaturas. 9) Detectores selectivos: Se deben evitar las fases estacionarias que contengan especies o grupos funcionales que generen una fuerte respuesta a un detector selectivo (ej. cianopropil con el detector de nitrógeno y fósforo NPD). En este caso usualmente ocurren derivas extremas de la línea de base y elevado ruido. Química Analítica: Cromatografía 11 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno 10) Versatilidad: Para análisis múltiples, se pueden requerir diferentes fases estacionarias para obtener una óptima separación. En algunos casos, diferentes análisis pueden ser realizados con una sola fase estacionaria sacrificando calidad en la respuesta y obteniendo resultados aceptables. Esta práctica reduce el número de columnas necesarias, lo que reduce la complejidad de su manejo y el costo. Programación de temperaturas de la columna La temperatura de la columna debe ser lo suficientemente alta como para asegurar que los componentes de la muestra atraviesen la columna a una velocidad razonable. Sin embargo, no puede ser mayor que el punto de ebullición de la muestra; de hecho es preferible que la temperatura de la columna se encuentre por debajo del punto de ebullición. Se debe tener en cuenta que la columna debe operar a una temperatura a la que la muestra está en estado vapor, pero no debe estar en estado de gas. Las técnicas utilizadas implican el uso de sistemas isotérmicos (donde la temperatura de la columna se mantiene constante) o de temperatura programada (PTGC), donde la columna se somete a un incremento lineal de la temperatura con el tiempo. Figura 10: Separación de hidrocarburos por CG isotérmica (arriba) y CG con programación de T (abajo) Química Analítica: Cromatografía 12 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno En el ejemplo se pone en evidencia la mejor resolución alcanzada en menor tiempo de análisiscon programación de temperaturas. Detectores El detector debe ser sensible a los efluentes de la columna y capaz de suministrar un registro en la forma de un cromatograma. La señal del detector debe ser proporcional a la cantidad de cada soluto, Con lo que debe ser posible realizar un análisis cuantitativo. Se han desarrollado una gran cantidad de detectores para monitorear los componentes que son separados en el efluente del cromatógrafo de gases. Los más usados se basan en la ionización. El principio aplicado consiste en la medida de los cambios de conductividad eléctrica causados por cambios en las corrientes de iones generados en la llama del detector. Figura 11: Esquema de un detector FID El FID, Detector de Ionización en Llama es el más utilizado, ya que cumple con todos los requerimientos de un buen detector para cromatografía gaseosa: alta sensibilidad, muy buena estabilidad, respuesta rápida (1 ms), bajo volumen muerto y amplia respuesta lineal. El eluyente de la columna se mezcla con H2 y aire y se quema en la llama dentro del detector. Los átomos de carbono de compuestos orgánicos (A excepción del carbonílico y carboxílico) pueden producir radicales CH, los cuales a su vez Química Analítica: Cromatografía 13 UTN – FRRE Dra. María del Carmen Sarno producen iones CHO+ en la llama oxhídrica. Los iones son colectados por el cátodo. La corriente que fluye entre cátodo y ánodo se mide y se transmite como señal a un registrador. Características generales del detector de ionización de llama (FID) 1. Muy sensible, cantidad mínima detectable 10-11g (aprox. 50 ppb) 2. Aplicable solamente al análisis de compuestos orgánicos 3. Destructivo 4. Muy buena linealidad 5. Muy buena estabilidad (poco afectada por cambios de flujo o temperatura) 6. Límite de temperatura 400 ºC 7. Gas carrier H2, He, N2 (los gases deben ser de alta pureza) El detector de captura electrónica contiene un emisor beta. Generalmente es una lámina delgada de 63Ni. Cuando moléculas de analito con alta afinidad electrónica entran al detector, capturan algunos electrones y reducen la corriente hacia el ánodo. Este detector es especialmente sensible a moléculas que contienen halógenos, grupos carbonilo conjugados, grupos nitrilo, grupos nitro y compuestos organometálicos. Figura 12: Esquema de un Detector de Captura de Electrones BIBLIOGRAFÍA -Skoog, Holler, Nieman “Principios de Análisis Instrumental” -Rubinson y Rubinson “Análisis Instrumental” -Harris “Análisis Químico Cuantitativo”
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