Clase_8_ Manejo de Muestras en el estudio de Biología Molecular (1)

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HERRAMIENTAS O TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
BIO. MSC. CARMEN BARBA GUZMÁN
DOCENTE
UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
¿A QUÉ SE DENOMINA TÉCNICAS O HERRAMIENTAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR?
SE LLAMA ASÍ A TODAS LAS TÉCNICAS DE LABORATORIO QUE SE UTILIZAN PARA EXTRAER O AISLAR CON ALTO GRADO DE PUREZA MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS (ADN Y ARN), VISUALIZARLO PARA VER SU ESTADO, CORTARLO Y PEGARLO, AMPLIFICAR POR PCR UNA REGIÓN ESPECÍFICA DEL GENOMA, CLONAR FRAGMENTOS ADN GENÓMICO HUMANO EN BACTERIAS U OTROS VECTORES COMO VIRUS. HIBRIDAR FRAGMENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE GENES, PARA TEST DE PATERNIDAD
¿PARA QUÉ SE UTILIZAN ÉSTAS TÉCNICAS?
Todas estas técnicas tienen diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades moleculares, hereditarias, búsqueda de alelos más o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos, diagnóstico en enfermedades infecciosas por virus (VIH; Hepatitis C, etc.), selección de marcadores moleculares para mejorar una especie, test de paternidad, diagnóstico forense
EXTRACCIÓN DE ADN
La primera técnica que se debe utilizar antes de las demás, es la extracción del ADN y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se lo hace desde el tejido sanguíneo. 
Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del medio, detergente para eliminar las membranas plasmáticas y luego seguir purificando el ADN de esa mezcla de ARN, proteínas y restos celulares.
ENTRE LAS TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ADN TENEMOS:
Incubación del lisado: Una posible forma de aislar el ADN genómico es incubar el lisado crudo a temperaturas entre 90 – 100 ºC y luego usarlo directamente. 
Es evidente que mediante este método el ADN obtenido es de muy baja pureza y con aplicaciones muy reducidas. 
Otra desventaja de este método son las pérdidas de ADN por acción de las nucleasas y otros componentes de los orgánulos que están en contacto con el ADN y pueden destruirlo, por lo que no es útil para almacenar el ADN pues los contaminantes pueden degradar las moléculas de ADN extraído.
Este método puede ser usado para extraer ADN de material crudo, liofilizado o congelado, que puede romperse con un mortero, por congelación-descongelación o usando ultrasonido. 
El lisado de células se puede extraer con cloroformo, alcohol isoamílico o fenol, siendo las proteínas y otros componentes de la célula solubles en el disolvente orgánico, por lo que de esta forma se logra la separación de los ácidos nucleicos
LISIS POR RUPTURA MECÁNICA Y EXTRACCIÓN CON DISOLVENTES ORGÁNICOS
LISADO Y PURIFICACIÓN CON UN DETERGENTE IÓNICO. MÉTODO DEL CTAB:
Este es un procedimiento básico para extraer ADN de vegetales, donde un detergente aniónico puede romper la pared celular y así se produce la lisis de las células. El uso de detergentes aniónicos no solo se restringe a la extracción de ADN vegetal, puede ser usado para ADN genómico de bacterias y otros tipos de organismos. Un ejemplo de este método, quizás el más conocido, es el uso de CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio) como detergente para lograr la lisis.
MÉTODO DE SALTING-OUT:
A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas de proteínas y otros contaminantes del ADN mediante la adición de altas concentraciones de sal que hacen que disminuya la solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase acuosa. 
En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa K, el TRIS-HCl para regular el pH y otros reactivos químicos que aseguren la total inactivación de las enzimas que pueden actuar sobre las moléculas de ADN.
Para la extracción se utilizan sales inorgánicas como el perclorato de sodio y el cloruro de sodio en concentraciones muy altas que hacen precipitar a las moléculas orgánicas. 
El precipitado formado se separa por centrifugación y luego se puede extraer el ADN de la disolución acuosa mediante la adición de alcohol, por precipitación.
ELECTROFORESIS EN GELES
La electroforesis es una técnica muy importante en la Biología Molecular.
El principio básico es ADN, ARN y proteínas que pueden ser separadas por medio de un campo eléctrico.
PREPARACIÓN DE AGARES
Agarosa, poliacrilamida
TAE , PBS entre otros
Colorantes: bromuro de etidio, syber safe, syber green.
APLICACIONES
Se utiliza para hacer análisis de la secuencia de ADN y ARN, también se usa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar espectrofotometría de masa, Reacción de la Cadena de Polimerasa (PCR), clonación o secuenciación.
Extracción de ADN
Técnicas de Biología Molecular
CUESTIONARIO
¿Cuáles son las ventajas que podemos tener de la manipulación del ADN?
En la aplicación de cualquier técnica aplicable en el estudio molecular, la extracción del ADN ¿porqué es importante?
¿Cómo se conoce al área que trata sobre la aplicación de todas estas herramientas moleculares?
En la aplicación de esta herramientas moleculares en el estudio de la vida ¿cuáles son las desventajes en el campo de la bioética?
GRACIAS POR SU ATENCIÓN
Lavf58.19.102